CC BY
87
Известия ТСХА, выпуск 1, 2015 год
УДК 632.35:635.34
ПРОЯВЛЕНИЕ СИМПТОМОВ СОСУДИСТОГО БАКТЕРИОЗА
У КАПУСТНЫХ РАСТЕНИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ГЕНАМИ УСТОЙЧИВОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ИНОКУЛЮМА XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS
Г.Ф. МОНАХОС, ВО ТХИ НГОК ХА, Ф.С. ДЖАЛИЛОВ (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)
В результате скрининга коллекции инбредных линий и коммерческих гибридов F¡ капусты белокочанной выявлены источники расоспецифической устойчивости к Xanthomonas campestris pv. campestris. Установлено, что у линии Цр2-1 устойчивость — рецессивный признак, ее проявление зависит от концентрации инокулюма. Устойчивость линии B. carinata PI 199947 к расам 1, 3 и 4, контролируемая геном Rb, проявляется независимо от инфекционной нагрузки. Для более надежного скрининга исходного селекционного материала предложено проводить инокуляцию при концентрации патогена 104-105КОЕ/мл с обязательным использованием восприимчивого стандарта и учет зараженности начинать с 7-го дня после искусственного заражения.
Ключевые слова: сосудистый бактериоз капусты, Xanthomonas campestris pv. сатре^'М^', устойчивость.
Сосудистый бактериоз, вызываемый Xanthomonas campestris pv. cаmpestris (Pammel) Dowson, является одним из самых распространенных и вредоносных заболеваний капусты [15]. Наиболее перспективный способ борьбы с этой болезнью — выращивание устойчивых гибридов. Однако селекция на устойчивость затруднена в связи с наличием у патогена физиологических рас. Катоип с соавторами при заражении различных сортов и гибридов Brassica rapa и Brassica juncea возбудителем сосудистого бактериоза впервые выделили пять рас патогена, различающихся по способности заражать растения-хозяева с генами расоспецифическими устойчивости [8].
Впоследствии было показано, что расу 1 можно подразделить на две или три расы на основе их реакции c новыми генотипами В. oleracea [13, 14]. В результате инокуляции расой 1 растений амфитриплоида с геномной формулой AABBCC была выделена раса 0 [3]. Анализ расового состава популяции возбудителя позволил установить, что в России наиболее распространены расы 1, 3 и 4 [4]. Имеется сообщение о том, что F1 гибриды Доминанта, Престиж, Церокс, Синтекс, Браксан и Агрессор обладают высокой устойчивостью к некоторым расам [1].
Успешность селекции на устойчивость во многом определяется выбором метода инокуляции растений и оценки поражения исходного материала.
При оценке нераспецифического типа устойчивости было установлено, что инокуляция через гидатоды обеспечивала более тесную связь с результатами поле-
26
вой оценки на естественном инфекционном фоне по сравнению с заражением через травмированные жилки [2]. Однако при оценке расоспецифического типа устойчивости исследователи используют метод инокуляции уколом в жилку как более простой, не требующий создания условий высокой влажности и позволяющий провести на одном растении инокуляцию различными расами возбудителя.
При планировании селекционной работы важно знать, оказывает ли инфекционная нагрузка влияние на экспрессию генов устойчивости. Существует мнение, что при расоспецифической устойчивости концентрация инокулюма не влияет на ее проявление [5]. При оценке устойчивости у капустных культур исследователи использовали различные концентрации инокулюма. Так, для выявления устойчивых образцов у B. napus и B. oleracea растения инокулировали суспензией с концентрацией 5*108 колониеобразующих единиц в 1 мл (КОЕ/мл) X. campestris pv. campestris [9], а у Brassica rapa и B. napus — 106 КОЕ/мл [4]. Guo (1991) для заражения B. napus и B. campestris использовал суспензию в концентрации 1,5*109 КОЕ/мл. Для идентификации рас патогена Vicente с соавторами проводили инокуляцию растений-дифференциаторов в концентрации 108-109 КОЕ/мл [13, 14].
Для создания устойчивых гибридов F1, необходимы скрининг коллекций исходного материала, выявление устойчивых генотипов и изучение характера наследования устойчивости. При этом знание особенностей влияния концентрации инокулюма на проявление устойчивости у генотипов с различным типом генетического контроля позволит оптимизировать иммунологическую оценку.
Материал и методы
В работе, проведенной в 2013-2014 гг., испытывали на устойчивость к сосудистому бактериозу 31 линию из коллекции Селекционной станции имени Н.Н. Тимофеева, а также гибриды F1 и сорт капусты белокочанной Офелия. Для оценки устойчивости из коллекции, состоящей из более 70 штаммов X. campestris pv. campestris, были отобраны представители каждой расы. Использовали штамм расы 0-AF2, расы 1-276NZ, расы 3-306 NZ и расы 4-277NZ. Для инокуляции брали 48-часовую культуру бактерий, выросшую при 26°С на среде YDC.
В предварительном исследовании определили взаимосвязь между концентрацией КОЕ патогена и оптической плотностью клеточной суспензии при 600 нм (OD 600) на спектрофотометре Eppendorf Bio Photometr plus. В дальнейших опытах концентрацию бактерий измеряли спектрофотометрически.
Рассаду селекционных образцов выращивали из семян в кассетах до стадии 4-5 настоящих листьев, а затем пересаживали в горшки с торфяным субстратом объемом 0,5 л. Инокуляцию возбудителем осуществляли методом укола препаровальной иглой, смоченной в бактериальной суспензии, проводя по 5 уколов на каждом листе. Скрининг устойчивости коллекции инбредных линий, сортов и гибридов F1 проводили тремя расами (0, 1, 3) в концентрации 104 5 КОЕ/мл. У каждого растения селекционного образца заражали по 3 листа (на 1 листе по 5 уколов одной расой). Учет проводили на 7-й и 20-й дни после инокуляции.
Во втором эксперименте изучали влияние концентрации инокулюма на проявление симптомов заражения у восприимчивого стандарта и линии Цр 2-1, показавшей в первом эксперименте высокую устойчивость. Кроме того, использовали линию удвоенного гаплоида ЦрЫЫ, полученную в лаборатории генетики, селекции и биотехнологии овощных культур от устойчивого растения Цр 1. В качестве стандар-
27
та восприимчивости использовали линию Мег2ф2, которая обладает очень высокой восприимчивостью ко всем использованным в экспериментах расам возбудителя.
Линии высевали повторно и по 5-6 растений инокулировали расами 0, 1, 3 и 4 в концентрации бактериальной суспензии от 103 до 109 КОЕ/мл. Температура в теплице после инокуляции днем составляла 28-30°С, ночью — 23-25°С. Учет зараженности проводили, начиная с 7-го дня после инокуляции, и ежедневно до 15-го дня. Отмечали наличие симптомов в зоне укола. За положительный результат принимали наличие хотя бы одного успешного инфицирования. Эксперимент проводили в двух повторностях.
Результаты исследований
Результаты заражения 35 сортообразцов 3-мя расами возбудителя представлены в таблице 1.
Т а б л и ц а 1
Оценка расоспецифической устойчивости селекционного материала капусты
(концентрация инокулюма 104 5 КОЕ/мл, % устойчивых растений)
Раса
№ Сорта, гибриды 0 1 3
п/п и линии капусты Период после инокуляции, сут.
7 20 7 20 7 20
1 F1 Церокс 100 100 33,3 33,3 66,7 33,3
2 F1 Агрессор 66,7 66,7 0 0 0 0
3 F1 Таурус 0 0 0 0 100 100
4 F1 Колобок 0 0 0 0 0 0
5 с. Офелия 0 0 0 0 33,3 0
6 PI 199947 B. carinata 0 0 100 100 100 100
7 НАН 1-1611 0 0 0 0 0 0
8 НАН 2-312 0 0 0 0 33,3 0
9 НАН 2-311 0 0 0 0 0 0
10 НАН 1-1521 0 0 0 0 0 0
11 НАН 1-1532 100 100 100 100 33,3 0
12 НАН1-1561 0 0 33,3 0 33,3 0
13 НАН 1-1511 0 0 0 0 0 0
14 АМС 2-3 33,3 0 0 0 0 0
15 АМС 0 0 0 0 0 0
28
Раса
№ Сорта, гибриды 0 1 3
п/п и линии капусты Период после инокуляции, сут.
7 20 7 20 7 20
16 ПМ4Ф2 33,3 0 0 0 0 0
17 ЦР 1-1 100 100 100 66,7 100 100
18 ЦР 1-2 100 100 66,7 33,3 100 100
19 ЦР 1-3 0 0 0 0 33,3 0
20 ЦР1-4 0 0 0 0 0 0
21 ЦР2-1 100 100 100 100 100 100
22 (ДМ1*Т5)(13)1-1 0 0 0 0 0 0
23 Вб4п 2-1 0 0 33,3 0 33,3 0
24 НИК 2-3 0 0 33,3 0 0 0
25 КАУ 1-81 0 0 33,3 0 0 0
26 С110Ф1-17 100 100 33,3 33,3 66,7 66,7
27 ЮБ 1-3 0 0 33,3 0 33,3 0
28 Хт5к1-3 33,3 0 0 0 0 0
29 ХДХ(20)2 0 0 0 0 0 0
30 ГЕС2-2546 0 0 0 0 100 100
31 ФУ4-93 0 0 0 0 0 0
32 Зму7д1-1 0 0 33,3 0 0 0
33 Цв9р7 0 0 0 0 0 0
34 Мег2ф2 0 0 0 0 0 0
35 АГР2-1 0 0 0 0 0 0
36 ЗА1-1 0 0 33,3 33,3 66,7 66,7
Результаты показывают, что среди испытанных сортообразцов расоспецифиче-ской устойчивостью обладают гибриды F1 Агрессор, F1 Церокс и F1 Таурус. Растения гибрида Таурус F1 показали устойчивость к 3-й расе, а растения гибрида F1 Агрессор — к расе 0. Растения гибрида F1 Церокс обладали более широкой устойчивостью, однако этот гибрид оказался гетерогенным. В нем выявлены растения, устойчивые ко всем трем расам, а также растения, устойчивые к двум или только к одной расе. Поэтому при использовании этого гибрида как источника в селекции на устойчивость
29
необходимо предварительно провести инокуляцию, отбор устойчивых растений ко всем трем расам и затем получать от них потомство. Полную устойчивость к расам 1 и 3 показала линия абиссинской капусты Р1 199947. Эта линия входит в состав набора растений-дифференциаторов. И то, что она в наших экспериментах поразилась только расой 0, подтверждает достоверность используемых нами рас. Отсутствие устойчивости отмечено у гибрида F1 Колобок, сорта Офелия и у большинства изучаемых линий. Полную устойчивость ко всем трем расам показала линия Цр2-1. В селекционных линиях Цр1-1, Цр1-2 и С110ф1-17 также имеются растения с устойчивостью к трем расам, т.е. в этих линиях возможен отбор растений с устойчивостью к трем расам. У линии Нан1-1532 выявлены растения, устойчивые к расам 0 и 3, а в линии Гес2-2546 — устойчивые к расе 3.
Результат анализа потомства от скрещивания высоковосприимчивой линии Мег2ф2 с устойчивой к трем расам линией Цр2-1 показал, что устойчивость является рецессивной, так как все растения потомства были поражены всеми четырьмя расами (табл. 2).
Т а б л и ц а 2
Распределение устойчивых и восприимчивых растений у гибрида F1 Мег2ф2хЦр2-1 при инокуляции Х.с. р^ сатревМэ (концентрация инокулюма 106 КОЕ/мл)
Гибридная комбинация Расы 0 1 3 4
Число растений Р Б Р Б Р Б Р Б
Мег2ф2^)*Цр2-1^) 5 0 5 0 5 0 5 0 5
Примечание. R — устойчивые, S — восприимчивые.
С целью усовершенствования методики оценки устойчивости селекционного материала были проведены эксперименты по уточнению оптимальных инфекционной нагрузки и сроков проведения учетов на восприимчивых и устойчивых гомозиготных линиях с различными генами расоспецифической устойчивости.
При инокуляции линии абиссинской капусты (В. сапт(а) Р1 199947 разными концентрациями установлено, что действие доминантного гена Rb, контролирующего устойчивость этой линии, не зависит от концентрации бактериального инокулю-ма. При заражении совместимой расой проявление симптомов начиналось уже на 7-е сут. после инокуляции даже при самой низкой концентрации патогена (табл. 3).
При заражении устойчивой линии удвоенного гаплоида Цр1dh1 на 7-й день после инокуляции симптомы отсутствовали даже при высокой концентрации патогена (табл. 4). На 15-е сут. симптомы появились при инокуляции расами 1 и 3 только при высокой инфекционной нагрузке — 108 и 109 КОЕ/мл. При инокуляции расами 0 и 4 симптомы обнаруживались при более низкой концентрации 106 и 105 КОЕ/мл соответственно.
У линии Цр 2-1 на 7-й день симптомы отсутствовали при инокуляции всеми расами даже при максимальных инфекционных нагрузках (табл. 5). На 15-е сут. при инокуляции расой 4 симптомы проявлялись уже при концентрации патогена 104 КОЕ/мл, расами 3 и 0 при концентрации 106 КОЕ/мл, а расой 1 — только при концентрациях 108 и выше.
30
Т а б л и ц а 3
Проявление симптомов сосудистого бактериоза у линии абиссинской капусты В. еаппа1а PI 199947 при различной инфекционной нагрузке возбудителя
Расы Период после инокуляции, сут. Концентрация инокулюма (КОЕ/мл)
103 104 105 106 107 108 109
1 7 - - - - - - -
15 - - - - - - -
3 7 - - - - - - -
15 - - - - - - -
4 7 - - - - - - -
15 - - - - - - -
0 7 + + + + + + +
15 + + + + + + +
Примечание."+" — наличие симптомов, "-" — отсутствие симптомов.
Т а б л и ц а 4
Проявление симптомов сосудистого бактериоза у устойчивой линии удвоенного гаплоида Цр1dh1 при различных инфекционных нагрузках возбудителя
Расы Период после инокуляции, сут. Концентрация инокулюма (КОЕ/мл)
103 104 105 106 107 108 109
1 7 - - - - - - -
15 - - - - - + +
3 7 - - - - - - -
15 - - - - - + +
4 7 - - - - - - -
15 - - + + + + +
0 7 - - - - - - -
15 - - - + + + +
Примечание."+" — наличие симптомов, "-" — отсутствие симптомов.
Как следует из таблицы 6, у восприимчивого стандарта — линии Мег2ф2 — при инокуляции 4-й расой симптомы появились, начиная с концентрации патогена 104 КОЕ/мл, на 7-й день и продолжали развиваться до конца периода учета, при более слабой концентрации патогена 103 КОЕ/мл симптомы не обнаруживались даже
31
Т а б л и ц а 5
Проявление симптомов сосудистого бактериоза у устойчивой линии Цр2-1 при различных инфекционных нагрузках рас X. сатревМэ ру. сampestris
Расы Период после инокуляции, сут. Концентрация инокулюма (КОЕ/мл)
103 104 105 106 107 108 109
1 7 - - - - - - -
15 - - - - - + +
3 7 - - - - - - -
15 - - - + + + +
4 7 - - - - - - -
15 - + + + + + +
0 7 - - - - - - -
15 - - - + + + +
Примечание."+" — наличие симптомов, "-" — отсутствие симптомов.
на 15-е сут. При инокуляции расами 0, 1 и 3 симптомы наблюдали на 7-е сут. только при инфекционной нагрузке свыше 107 КОЕ/мл. На 15-е сут. при инокуляции расами 0 и 1 симптомы появились даже при самой низкой инфекционной нагрузке патогена 103 КОЕ/мл.
Т а б л и ц а 6
Проявление симптомов сосудистого бактериоза у восприимчивой линии капусты Мег2ф2 при различных инфекционных нагрузках X. сатреэМэ ру. сampestris
Расы Период после инокуляции, сут. Концентрация бактерий (КОЕ/мл)
103 104 105 106 107 108 109
1 7 - - - + + + +
15 + + + + + + +
3 7 - - - - + + +
15 - + + + + + +
4 7 - + + + + + +
15 - + + + + + +
0 7 - - - - + + +
15 + + + + + + +
Примечание."+" — наличие симптомов, "-" — отсутствие симптомов.
32
Таким образом установлено, что доминантный ген устойчивости Rb у линии Р1 199947 В. саппа(а является сильным и устойчивость к расам 1, 3 и 4-я, контролируемая им, не зависит от концентрации патогена. Показано, что устойчивость линии Цр2-1 является рецессивным признаком, и ее проявление зависит от концентрации бактериального инокулюма. В связи с тем, что четкие симптомы поражения у восприимчивого стандарта — линии Мег2ф2 — обнаруживаются при концентрации бактерий 104 КОЕ/мл и выше, для более надежного скрининга исходного селекционного материала предлагаем проводить инокуляцию концентрацией 104-105 КОЕ/мл с обязательным использованием восприимчивого стандарта. Если условия благоприятны для развития заболевания, учет зараженности рекомендуется начинать с 7-го дня после искусственного заражения.
Библиографический список
1. Джалилов Ф.С., Во Тхи Нгок Ха. Защита капусты от болезней в период вегетации // Картофель и овощи. 2014. № 1. С. 20-23.
2. Джалилов Ф.С., КорсакИ.В., МонахосГ.Ф. Сравнение методов оценки устойчивости капусты к сосудистому бактериозу // Известия ТСХА. 1995. Вып. 2. С. 147-153.
3. Игнатов А.Н., Монахос Г.Ф., Джалилов Ф.С. Появление расы 0 в результате спонтанной мутации изолята расы 1 Xanthomonas campestris pv. campestris — возбудителя сосудистого бактериоза крестоцветных // Известия ТСХА. 2000. Вып. 4. С. 71-75.
4. Игнатов А.Н., Артемьева А.М., Чесноков Ю.В., Политыко В.А., Матвеева Е.В., Ораевский А.А., Шаад Н.В. Устойчивость к возбудителю сосудистого бактериоза и листовой пятнистости у Brassica rapa L. и B. napus L. // Сельскохозяйственная биология. 2011. № 1. С. 85-91.
5. Мазурин Е.С. Методы диагностики возбудителя сосудистого бактериоза капусты и меры защиты: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М.: ТСХА, 2009. 23 с.
6. Чекалин Н.М. Генетические основы селекции зернобобовых культур на устойчивость к патогенам. Полтава: Изд-во «1нтерграфта», 2003. 186 с.
7. Guo H., Dickson M.H., Hunter J.E. Brassica napus Sources of resistance to black rot in crucifers and inheritance of resistance // HortScience, 1991. Vol. 26(12). Р. 1545-1547.
8. Kamoun S., Kadmar H.V., Tola E., Kado C.I. Incompatible interaction between crucifers and Xanthomonas campestris involve a vascular hypersensitive response: role of the hrpX locus // Molecular Plant- Microbe Interaction. 1992. V. 5. P. 22-33.
9. Lema M., Soengas P., Velasco P., Francisco M., Cartea M.E. Identification of sources of resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica napus crops // Plant Disesase. 2011. V. 95. P. 292-297.
10. Мargarita L., Pablo V., Pilar S., Marta F., Mariа E.C. Screening for resistance to black rot in Brassica oleracea crops // Plant Breeding. 2012. V. 131. P. 607-613.
11. Shaw J.J., Kado C.I. Whole plant wound inoculation for consistent reproduction of black rot of crucifers // Phytopathology. 1988. V 78. P. 981-986.
12. Staub T., Williams P.H. Factors influencing black rot lesion development in resistant and susceptible cabbage // Phytopathology. 1972. V. 62. P. 722-728.
13. Taylor J.D., Conway J., Roberts S.J., Astley D., Vicente J.G. Sources and origin of resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica genomes // Ba^r^^gy. 2002. Vol. 92. №. 1. P. 105-111.
14. Vicente J.G., Conway J., Roberts S.J., Taylor J.D. Identification and origin ofXanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars // Phytopathology. 2001. V. 91. P. 492-499.
33
15. Vicente J.G., IgnatovA., Conway J., RobertsS.J., Taylor J.D. Development of an improved Brassica differential series for the identification of races of Xanthomonas campestris pv. cam-pestris // 7th Int. Cong. Plant Pathol., Edinburgh, UK. 1998. P. 2.2.71.
16. Williams P.H. Black rot: a continuing threat to world crucifers // Plant Disease. 1980. V. 64. № 8. P. 736-742.
PLANT REACTION TO VARIOUS INOCULUM CONCENTRATIONS OF XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS IN BLACK ROT RESISTANT BRASSICAS
G.F. MONAKHOS, VO THI NGOK HA, F.S. DZHALILOV
(Russian Timiryazev State Agrarian University)
Some new sources of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris were identifed during screening of cabbage inbred lines and commercial Fj hybrids against different levels of pathogen inoculum. Inbred line CR2-1 possessed a recessive gene-controlled resistance that depended on the bacterial inoculum concentration. Resistance of B. carinata accession PI 199947 to races 1, 3 and 4 controlled by Rb gene was effective against all inoculum levels. It was advised to use 104-105 CFU/ml concentration for initial screening of brassicas breeding material to get more reliable results. It is necessary to use susceptible standards. The plant disease reaction should start to be recorded on the 7th day after inoculation.
Key words: black rot of cabbage, Xanthomonas campestris pv. campestris, resistance.
Монахос Григорий Федорович — к. с.-х. н., ген. директор ООО «Селекционная станция им. Н.Н. Тимофеева» (127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 977-11-74; е-mail: breedst@mail.ru).
Во Тхи Нгок Ха — асп. кафедры защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-02-20; e-mail: ngochavo.88@ gmail.com).
Джалилов Февзи Сеид-Умерович — д. б. н., проф., зав. лабораторией защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49; тел.: (499) 976-12-79; e-mail: labzara@mail.ru).
Monakhos Grigoriy Fedorovich — PhD in Agricultural Sciences, Director General of LLC «N.N. Timofeev plant-breeding station» (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; tel.: +7 (499) 977-11-74; е-mail: breedst@mail.ru).
Vo Thi Ngok Ha — PhD-student of the Department of Plant Protection, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; tel.: +7 (499) 976-02-20; e-mail: ngochavo.88@gmail.com).
Dzhalilov Fevzi Seid-Umerovich — Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Laboratory of Plant Protection, Russian Timiryazev State Agrarian University (127550, Moscow, Timiryazevskaya street, 49; tel.: +7 (499) 976-12-79; e-mail: labzara@mail.ru).
34
