CC BY
8
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019
Прохватилова Е.В., Тетерятникова Н.Н., Захарова И.Б., Белицкая Л.И., Викторов Д.В., Топорков А.В.
ПРОВЕДЕНИЕ ЭТАПОВ ГОСУДАРСТВЕННОЙ РЕГИСТРАЦИИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ДНК БУРКХОЛЬДЕРИЙ ГРУППЫ «РБЕийОМАИБЬ
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 400131, Волгоград, Россия
Для клинической лабораторной диагностики разработано медицинское изделие (МИ), предназначенное для обнаружения и одновременной дифференциации ДНК трех видов буркхольдерий группы «pseudomallei» - возбудителя мелиоидоза (B. pseudomallei), возбудителя сапа (B. mallei) и B. thailandensis по набору генов в-лактамаз молекулярных классов B и D с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим способом детекции. Оценены функциональные свойства МИ, проведены испытания, завершены этапы экспертизы и регистрации в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения. При проведении клинических испытаний подтверждена эффективность применения набора реагентов при исследовании различных проб клинического материала и выделенных культур микроорганизмов. Установлено, что показатель диагностической чувствительности набора реагентов для выявления и дифференциации возбудителей сапа, мелиоидоза и B. thailandensis составляет не менее 99 %, диагностической специфичности - не менее 99 %, при доверительной вероятности 90 % при анализе каждого из показателей.
Ключевые слова: мелиоидоз; сап; B. thailandensis; полимеразная цепная реакция с электрофоретическим способом детекции; набор реагентов.
Для цитирования: ПрохватиловаЕ.В., ТетерятниковаН.Н., ЗахароваИ.Б., Белицкая Л.И., Викторов Д.В., Топорков А.В. «Проведение этапов государственной регистрации набора реагентов для обнаружения и дифференциации ДНК буркхольдерий группы «pseudomallei». Клиническая лабораторная диагностика. 2019; 64 (3): 180-185. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-3-180-185
ProkhvatilovaE.V., TeteryatnikovaN.N., ZakharovaI.B., BelitskayaL.I., ViktorovD.V., ToporkovA.V. PREPARATION FOR STATE REGISTRATION OF THE REAGENT KIT FOR THE DETECTION AND DIFFERENTIATION OF THE DNA OF BURKHOLDERIA «PSEUDOMALLEI» GROUP
Federal Government Health Institution "Volgograd Research Institute for Plague Control of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights' Protection and Human Well-being, 400131, Volgograd, Russia
The reagent kit designed to detect and .simultaneously differentiate the DNA of three species of Burkholderia pseudomallei -causative agents of melioidosis (B. pseudomallei), glanders (B. mallei) and B. thailandensis by the set of genes ofв-lactamases with B and D molecular classes using a multiplex polymerase chain reaction with electrophoretic detection was developed for clinical laboratory diagnosis. The functional properties of the reagent kit were evaluated, tests were carried out, the stages of examination and registration in the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights' Protection and Human Well-being were completed. During clinical testing the effectiveness of the reagent kits in the study of various samples of clinical material and isolated cultures of microorganisms was confirmed. It has been established that the indicator of diagnostic sensitivity of the reagent kit for the detection and differentiation of the glanders, melioidosis and B. thailandensis causative agents was less than 99 %, diagnostic specificity - not less than 99 % with a confidence probability of 90 % in the analysis of each of the indicators.
Key words: melioidosis; glanders; B. thailandensis; polymerase chain reaction with electrophoretic detection; reagent kit. For citation: Prokhvatilova E.V., Teteryatnikova N.N., Zakharova I.B., Belitskaya L.I., Viktorov D.V., Toporkov A.V. Preparation for state registration of the reagent kit for the detection and differentiation of the DNA of burkholderia «pseudomallei» group. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2019; 64 (3): (in Russ.) DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-3-180-185
For correspondence: Prokhvatilova E.V., сandidate of medical sciences, associate professor, head of the Department of biological and technological control; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru Information about authors:
Prohvatilova E.V., http://orcid.org/0000-0001-9947-7711 Teteryatnikova N.N., https://orcid.org/0000-0001-8928-2152 Zakharova I.B., https://orcid.org/0000-0002-7808-7658 Belickaya L.I., http://orcid.org/0000-0002-1803-9443 Viktorov D.V., http://orcid.org/0000-0002-2722-7948 Toporkov A.V., http://orcid.org/0000-0002-3449-4657 Acknowledgments. This study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 10.01.2019 Accepted 04.02.2019
Для корреспонденции: Прохватилова Елена Валерьевна, канд. мед. наук, доц., зав.отделом биологического и технологического контроля; е-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Введение. Высокопатогенные для человека и различных видов животных буркхольдерии B. pseudomallei, B. mallei, а также B. thailandensis выделены в отдельную группу «pseudomallei» и обладают фенотипическим и генетическим сходством, что значительно затрудняет проведение лабораторных исследований по видовой идентификации и дифференциации данных видов микроорганизмов.
Оба вида, B. pseudomallei, B. mallei - относятся к микроорганизмам II группы патогенности, являются возбудителями особо опасных инфекционных болезней мели-оидоза и сапа, соответственно, и включены в перечень потенциальных биологических агентов биотерроризма (ПБА) [2]. Burkholderia thailandensis - микроорганизм III группы патогенности, однако способен вызывать инфекции различной степени тяжести с разнообразными клиническими проявлениями, схожими с мелиоидозом, что в значительной мере затрудняет его дифференциальную диагностику с B. pseudomallei.
Разнообразный характер течения инфекционных заболеваний, вызванных B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, не имеющих специфических симптомов и синдромов и протекающих, как правило, с образованием абсцессов в органах и тканях и явлениями сепсиса, чаще всего исключает возможность установить своевременный и точный диагноз на основе клинических данных. Ввиду фенотипического и генетического сходства B. pseudomallei B. mallei и B. thailandensis иммунологические методы (МФА, РНГА, ТИФМ), основанные на определении антигенов или антител, как правило, не решают проблемы дифференциальной диагностики данных инфекций. В современных условиях наибольшее значение и перспективность для этого имеют геннодиагностические системы (наборы), предназначенные для обнаружения ДНК микроорганизмов, и адаптированные для ПЦР с высокочувствительным способом регистрации результатов и мультипараме-трической детекции [1].
Специалистами ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспо-требнадзора (Референс центра по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза) завершены исследования по разработке «Набора реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы «pseudomallei» в формате мультиплексной полимераз-ной цепной реакции с электрофоретической детекцией «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016», предназначенного для обнаружения ДНК и одновременной дифференциации 3-х видов буркхольде-рий группы «pseudomallei» - возбудителя мелиои-доза (B. pseudomallei), возбудителя сапа (B. mallei) и B. thailandensis по набору генов ß-лактамаз молекулярных классов B и D в пробах выделенных культур микроорганизмов, клинического и секционного материала методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретическим способом детекции (далее - мультиплексной ПЦР) [3-5].
Данное МИ позволяет с помощью ПЦР обнаруживать специфические фрагменты ДНК у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Одна пара группоспецифиче-ских праймеров обеспечивает амплификацию фрагмента гена ß-лактамазы класса B у B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis. Вторая пара группоспецифических праймеров обеспечивает амплификацию фрагмента гена
microbiology
ß-лактамазы класса B у B. pseudomallei и B. mallei. Третья пара группоспецифических праймеров обеспечивает амплификацию фрагмента гена ß-лактамазы класса D у B. pseudomallei и B. thailandensis. Детекцию продуктов амплификации осуществляют с помощью электрофореза в агарозном геле [3 - 5].
Целью настоящего исследования явились испытание и оценка возможности применения в медицинской лабораторной практике набора реагентов, предназначенного для обнаружения ДНК и одновременной дифференциации 3-х видов буркхольдерий группы «pseudomallei» - возбудителя мелиоидоза (B. pseudomallei), возбудителя сапа (B. mallei) и B. thailandensis по набору генов ß-лактамаз молекулярных классов B и D в пробах выделенных культур микроорганизмов, клинического материала (кровь, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, отделяемое язв, пунктаты из лимфатических узлов, экссудаты, абсцессы, рвотные массы, испражнения), секционного материала (биоптаты печени, селезенки, легкого, сердца, почки, головной мозг) методом мультиплексной ПЦР.
Материал и методы. В состав медицинского изделия «Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы «pseudomallei» в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с элек-трофоретической детекцией «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL В/D - EPh» по ТУ 21.20.23014-01898084-2016» (далее - «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL В/D - EPh») входят следующие компоненты:
ПЦР - смесь № 1 - 1 пробирка по 0,5 мл;
ПЦР - смесь № 2 - 1 пробирка по 0,1 мл;
Taq-ДНК-полимераза - 1 пробирка по 0,02 мл;
ПКО (положительный контрольный образец) - 1 пробирка по 0,4 мл;
ОКО (отрицательный контрольный образец) - 1 пробирка по 0,4 мл;
вода деионизованная - 1 пробирка по 0,4 мл;
минеральное масло - 2 пробирки по 1,0 мл.
В зависимости от степени потенциального риска применения в медицинских целях набор реагентов «Ам-плиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D -EPh» относится к классу 3.
Поскольку аналогов набору реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL В/D - EPh», зарегистрированных на территории Российской Федерации не существует, испытания проводились без использования препарата для сравнения.
Штаммы микроорганизмов. При проведении клинических испытаний набора реагентов использовали 15 штаммов B. pseudomallei, 13 штаммов B. mallei, 5 штаммов B. thailandensis и 24 штаммов гетерологичных микроорганизмов, их них 2 штамма Burkholderia cepacia, 5 штаммов Pseudomonas aeruginosa, 2 штамма Klebsiella pneumoniae, 3 штамма Escherichia coli, 1 штамм Proteus mirabilis, 2 штамма Staphylococcus аureus, 1 штамм Staphylococcus epidermidis, 6 штаммов Vibrio cholera.
Для определения показателя чувствительности методом ПЦР с применением испытуемого МИ были использованы бактериальные суспензии B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis в концентрации 1*104 м.к./мл и бактериальные суспензии гетерологичных микроорганизмов в концентрации 1*107 м.к./мл.
Для оценки диагностической чувствительности МИ при исследовании проб клинического и секционного материала были подготовлены:
МИКРОБИОЛОГИЯ
- пробы клинического материала (кровь человека, мокрота, моча, спинномозговой жидкости, содержимое язв, абсцессов и экссудаты, испражнений человека), искусственно контаминированные B. pseudomallei С-141, B. mallei Р-1, B. thailandensis 2.1 до конечной концентрации 1х104 м.к./мл и P. aeruginosa 4000 до конечной концентрации 1х107 м.к./мл.
- пробы секционного материала (печень, селезенка, легкое), искусственно контаминированные B. pseudomallei С-141, B. mallei Р-1, B. thailandensis 2.1 до конечной концентрации 1х104 м.к./мл и P. aeruginosa 4000 до конечной концентрации 1х107 м.к./мл.
Объем каждого образца исследуемой пробы - 0,05 мл. Все пробы до постановки опыта хранились при температуре минус 18 °С, во время опыта при плюс 4 °С, но не более 3 суток. Все пробы были одновременно исследованы методом ПЦР с применением набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» и микробиологическим методом (высевом на соответствующие плотные питательные среды из каждого разведения).
Подготовка проб чистых культур микроорганизмов для мультиплексной ПЦР. Культивирование B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis и гетероло-гичных микроорганизмов осуществляли на агаре Лу-риа («HiMedia», Индия, ФСЗ 2009/03707), рН (7,0±0,2), инкубировали в течение 24-48 часов при температуре (37±1) °С. Из выросших культур готовили суспензии в 2 мл 0,9 %-ого раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10МЕ)), что соответствует 1х109 м.к./мл для B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. mirabilis, S. aureus, S. epidermidis и 5 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-59-86П (5МЕ)), что соответствует 1,1х109 м.к./мл для V. cholerae. Затем проводили десятикратные разведения подготовленных суспензий клеток в 0,9 % стерильном растворе натрия хлорида до конечной концентрации 1х103 м.к./мл. Для исследования использовали бактериальные суспензии B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis в диапазоне от 1х103 до 1х105 м.к./мл и гетерологичных микроорганизмов плотностью 1х107 м.к./мл.
Количество клеток в приготовленных разведениях проверяли путем высева из концентрации 1х103 м.к./ мл по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма на чашки Петри с агаром Луриа. Через 24-48 ч инкубации в термостате при температуре (37±1) °С подсчитывали количество колоний, выросших на поверхности агара.
Проведение ПЦР. Выделение ДНК осуществляли методом аффинной сорбции на частицах силикагеля с использованием коммерческого набора «Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-сорб» (ФСР 2008/03993, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией к указанному набору.
Постановку реакций проводили с использованием амплификатора типа С1000 (Термоциклер C1000, «BioRad», США) с наборами реагентов «Амплиген Буркхоль-дерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh». Детекцию результатов ПЦР осуществляли методом электрофореза при напряженности электрического поля 5 В/см в течение 40 мин в 1,5 % агарозном геле, используя коммерческий набор «Комплект реагентов для электрофорети-ческой детекции продуктов амплификации в агарозном
геле «ЭФ», вариант генотип-300» (ФСР 2008/03146, ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Учёт и интерпретацию результатов ПЦР-анализа проводили по наличию или отсутствию на электрофореграм-ме специфических фрагментов ДНК в сравнение с «положительным контролем».
Для определения межпостановочной и межсерийной воспроизводимости одинаковые положительные пробы исследовали повторно с использованием двух серий набора реагентов «Амплиген Буркхоль-дерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» (серия 6/18, дата изготовления 20.02.2018, годен до 08.2018 г; серия 7/18, дата изготовления 20.02.2018, годен до 08.2018 г.). Для определения внутрипостановочной воспроизводимости одинаковые положительные пробы исследовали в пяти повторах с использованием двух серий набора «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh».
В качестве метода сравнения использовали микробиологический метод исследования микроорганизмов рода Burkholderia в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп пато-генности (опасности)», МУ 4.2.2787-10 «Лабораторная диагностика мелиоидоза», МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика сапа» с последующей идентификацией буркхольдерий группы «pseudomallei» на основании роста на дифференциально-диагностических средах (агар Эшдауна, триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина, минимальный агар с L-арабинозой).
При проведении мультиплексной ПЦР с «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» и микробиологического метода исследуемые образцы рассматривали как инфекционно-опасные, поэтому этапы подготовки проб проводили в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Статистическую обработку результатов клинических испытаний проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий», утвержденными 14.11.2013 г. ФГБУ «ЦМИ-КЭЭ» Росздравнадзора и ФГБУ «ВНИИИМТ» Росздрав-надзора, ГОСТ Р 53022.3-2008 «Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов». Статистическую достоверность полученных результатов испытаний оценивали в зависимости от числа параллельных опытов при доверительной вероятности 90 %, используя формулу биноминального распределения Бернулли.
Результаты и обсуждение. Необходимость разработки МИ «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh», основанного на технологии мультиплексной ПЦР, была обусловлена отсутствием геннодиагностических наборов реагентов для обнаружения и одновременной дифференциации 3-х видов буркхольдерий группы «pseudomallei» - возбудителя мелиоидоза (B. pseudomallei), возбудителя сапа (B. mallei) и B. thailandensis в различных объектах исследования.
microbiology
Таблица 1
Результаты исследований чувствительности МИ «Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы «pseudomallei» в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016» с помощью
ПЦР с электрофоретическим способом детекции
Наименование проб Число проб Положительный ответ в ПЦР «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» Результат микробиологического
Серия 6/18 Серия 7/18 метода
Пробы чистых культур, содержащие B. pseudomallei в концентрации 1х104 м.к./мл 35 35 35 35
Пробы чистых культур, содержащие B. mallei в концентрации 1х104 м.к./мл 31 31 31 31
Пробы чистых культур, содержащие B. thailandensis в концентрации 1х104 м.к./мл 15 15 15 15
Пробы клинического материала, содержащие B. pseudomallei в концентрации 1х104 м.к./мл 18 18 18 18
Пробы клинического материала, содержащие B. mallei в концентрации 1х104 м.к./мл 18 18 18 18
Пробы клинического материала, содержащие B. thailandensis в концентрации 1х104 м.к./мл 18 18 18 18
Пробы секционного материала, содержащие B. pseudomallei в концентрации 1х104 м.к./мл 11 11 11 11
Пробы секционного материала, содержащие B. mallei в концентрации 1х104 м.к./мл 11 11 11 11
Пробы секционного материала, содержащие B. thailandensis в концентрации 1х104 м.к./мл 11 11 11 11
Итого положительных проб, содержащих B. pseudomallei в концентрации 1х104 м.к./мл 64 64 64 64
Итого положительных проб, содержащих B. mallei в концентрации 1х104 м.к./мл 60 60 60 60
Итого положительных проб, содержащих B. thailandensis в концентрации 1х104 м.к./мл 44 44 44 44
Итого положительных проб, содержащих буркхольдерии группы «pseudomallei» в концентрации 1х104 м.к./мл 168 168 168 168
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - образцы анализировали в 2 повторах.
Аналитические характеристики набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL В/D - EPh» были определены по результатам предварительных (контрольных испытаний) испытаний. Согласно конструкторской документации аналитическая чувствительность при идентификации и дифференциации ДНК B. pseudomallei составила не менее 1*104 м.к./мл, ДНК B. mallei - не менее 1*104 м.к./мл и ДНК B. thailandensis - не менее 1*104 м.к./мл. При определении показателя аналитической специфичности установлено, что набор реагентов не выявляет ДНК гетерологичных микроорганизмов в концентрации 1*107 м.к./мл.
В 2016 г. при проведении технических испытаний набора были подтверждены заявленные разработчиками функциональные характеристики и диагностическая эффективность МИ, а также согласованы вид, класс потенциального риска применения в соответствии с номенклатурной классификацией МИ. В результате испытаний проведена оценка и анализ данных, относящихся к функциональным свойствам МИ, доработка технической и эксплуатационной документации и оформлен акт испытаний. Полученные результаты были оценены экспертами как положительные и подтвердили эффек-
тивность и безопасность применения диагностического набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh».
В 2017 г. «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» был представлен к государственной регистрации в Федеральную службу по надзору в сфере здравоохранения в качестве медицинского изделия. В соответствии с Правилами государственной регистрации медицинских изделий, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 г. № 1416, регистрация МИ осуществлялась на основании результатов технических и клинических испытаний, а также результатов экспертизы документов регистрационного досье.
Экспертами подтверждено, что набор реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D -EPh» может быть использован для идентификации и одновременной дифференциации B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis с помощью мультиплексной ПЦР с электрофоретическим способом детекции. Результаты клинических испытаний МИ «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» представлены в табл. 1, 2.
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
Результаты исследований специфичности МИ «Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы «pseudomallei» в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией «Амплиген Буркхоль-дерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016» с помощью ПЦР с электрофоретическим способом
детекции
Наименование проб Число проб Отрицательный ответ в ПЦР «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» Результат микробиологи-
Серия 6/18 Серия 7/18 ческого метода
Пробы чистых культур, содержащие близкородственные и гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1*107 м.к./мл 49 49 49 49
Пробы клинического материала, содержащие гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1*107 м.к./мл 18 18 18 18
Пробы секционного материала, содержащие гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1*107 м.к./мл 11 11 11 11
Итого отрицательных проб, содержащих близкородственные и гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1*107 м.к./мл 78 78 78 78
При клинических испытаниях МИ «Амплиген Бурк-хольдерии группы «pseudomallei» PL B/D - EPh» на 336 положительных пробах (162 пробы суспензий микроорганизмов, 108 проб клинического материала и 66 проб секционного материала, искусственно контами-нированных бактериальными агентами), содержащих буркхольдерии группы «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis) в концентрации 1*104 м.к./ мл был получен положительный результат в 100 % случаев, на 156 отрицательных пробах (98 проб суспензий микроорганизмов, 36 проб клинического материала и 22 пробы секционного материала, искусственно контами-нированных бактериальными агентами), содержащих близкородственные и гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1*107 м.к./мл - отрицательный результат в 100 % случаев.
Таким образом, доказана диагностическая эффективность МИ «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» PL B/D - EPh» по ТУ 21.20.23-01401898084-2016:
- диагностическая чувствительность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90 %, при анализе 336 положительных проб, содержащих буркхольдерии группы «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis) в концентрации 1*104 м.к./мл получен положительный результат в 336 случаях,
- диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90 %; при исследовании 156 отрицательных проб, содержащих близкородственные и гетерологичные микроорганизмы (B. cepacia, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. mirabilis, S. aureus, S. epidermidis, V. cholerae) в концентрации 1*107 м.к./мл получен отрицательный ответ в 156 случаях.
Корректное определение видовой принадлежности буркхольдерий группы «pseudomallei» (B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis) и специфичность набора реагентов подтверждалось параллельным использованием референсного классического микробиологического метода исследования.
В 2018 г. после завершения всех этапов экспертизы документов МИ «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» PL B/D - EPh» Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения принято положительное решение о государственной регистрации МИ,
оформлено регистрационное удостоверение и разрешены производство, реализация и применение МИ в медицинской лабораторной практике.
Заключение. Одним из направлений совершенствования генной диагностики инфекционных болезней, в том числе ООИ, является разработка и внедрение в медицинскую лабораторную практику наборов реагентов для мультиплексной технологии ПЦР, обеспечивающей одномоментное выявление нескольких возбудителей в одной реакции, сокращение времени и снижение себестоимости лабораторного анализа [1].
Сотрудниками Референс-центра по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора разработан «Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы «pseudomallei» в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL В/D - EPh» по ТУ 21.20.23-01401898084-2016», предназначенный для обеспечения готовности медицинских организаций к проведению лабораторной диагностики инфекционных болезней, вызванных B. pseudomallei, B. mallei и B. thailandensis, в случаях их завоза на территорию Российской Федерации, а также при возникновении чрезвычайных ситуаций.
Благодарности. Выражаем благодарность сотрудникам ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора: к.м.н., зав. отделом биологического и технологического контроля Лобовиковой О.А.; к.м.н., зав. отделом стандартизации, качества и метрологии Шульгиной И.В.; к.м.н. и.о. зав. отделом диагностики инфекционных болезней Портенко С.А.; к.м.н., зав. лабораторией молекулярной диагностики Осиной Н.А.; н.с. лаборатории оперативной диагностики инфекционных болезней Касьян Ж.А. за организацию и проведение испытаний, подтверждающих безопасность и уровень качества медицинского изделия «Амплиген Буркхольдерии группы «pseudomallei» ßL B/D - EPh» по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016».
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2019; 64(3) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-3-180-185
ЛИТЕРАТУРА
1. Онищенко Г.Г., Ежлова Е.Б., Пакскина Н.Д., Брагина И.В., Ше-енков Н.В., Кутырев В.В. и др. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. ред. М.: Шико; 2009.
2. Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С., Нетесов С.В., Щелкунов С.В. Биотерроризм как национальная и глобальная угроза. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2000; 6: 83-6.
3. Захарова И.Б., Романова А.В., Тетерятникова Н.Н., Замараев В.С., Викторов Д.В. Молекулярное типирование и анализ полиморфизма генов ß-лактамаз патогенных видов Burkholderia. Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. 2012; 2 (42): 98-101.
4. Захарова И.Б., Шпак И.М., Тетерятникова Н.Н., Кузютина Ю.А., Ткаченко Г.А., Лемасова Л.В. и др. Лабораторный скрининг и идентификация Burkholderia pseudomallei. Практическое руководство. Топорков А.В., Кузнецова А.Н., Х. Зы Нгуен ред. Волгоград: Волга-Пресс; 2018.
5. Zakharova I., Teteryatnikova N., Toporkov A., Viktorov D. Development of a multiplex PCR assay for the detection and differentiation of Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Burkholderia thailandensis, and Burkholderia cepacia complex. Acta Tropica. 2017; 174: 1-8.
REFERENCES
1. Onischenko G.G., Ejlova E.B., Pakskina N.D., Bragina I.V., Sheen-kov N.V., Kutyirev V.V. et al. Laboratory diagnosis of dangerous infectious diseases. Practical guidance. [Laboratornaya diagnos-
MICROBIOLOGY
tika opasnyih infektsionnyih bolezney: Prakticheskoe rukovodstvo. Onischenko G.G., Kutyirev V.V., eds]. Moscow: Shiko; 2009. (in Russian)
2. Onischenko G.G., Sandahchiev L.S., Netesov S.V., Schelkunov S.V. Bioterrorizm kak natsionalnaya i global'naya ugroza. Zhurnal mik-robiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2000; 6: 83-6. (in Russian)
3. Zakharova I.B., Romanova A.V., Teteryatnikova N.N., Zamaraev V.S., Viktorov D.V. Molekulyarnoe tipirovanie i analiz polimorfizma genov ß-laktamaz patogennyih vidov Vurkholderia. Vestnik Volgo-gradskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta. 2012; 2 (42): 98-101. (in Russian)
4. Zakharova I.B., Shpak I.M., Teteryatnikova N.N., Kuzyutina YU.A., Tkachenko G.A., Lemasova L.V. et al. Laboratory scrin-ing and authentication of Burkholderia pseudomallei. Practical guidance. [Laboratornyiy skrining i identifikatsiya Burkholderia pseudomallei. Prakticheskoe rukovodstvo. Toporkov A.V., Kuz-netsova A.N., H. Zyi Nguen, eds.] .Volgograd: Volga-Press; 2018. (in Russian)
5. Zakharova I., Teteryatnikova N., Toporkov A., Viktorov D. Development of a multiplex PCR assay for the detection and differentiation of Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Burkholderia thailandensis, and Burkholderia cepacia .Acta Tropica. 2017; 174: 1-8. (in Russian)
Поступила 10.01.19 Принята к печати 04.02.19
