CC BY
16
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина t.XVL ISSN 1311-9427. Научна сесия „Медицина и дентална меди1еииа", 3»1 Октомври - 1 Ноември 2014. Scientific researches of the Union of Scientists in Balgaria-Plovdiv, series G. Medicinc, Pharmacy and Dental medicine, Vol.XVI, ISSN 1311-9427 Medicine and Stomatology Session 31. October-1. November 20Г4.
ПРОУЧВАНЕ ВЪРХУ ОСВОБОЖДАВАНЕТО НА СТВОЛОВИ КЛЕТКИ В ПЕРИФЕРНА КРЪВПОД ВЛИЯНИЕ НА HABERLEA RHODOPENSIS И APHANIZOMENON FLOS-AQUAE
И.Кандиларов1, Т.Денева2, П.Павлов2, Д.Пенков3, В». Кокова1, Л.Пейчев1 1Катедра по фармакология и лекарствена токсикология, МУ Пловдив
2Катедра по клина ч1еа лаборатория, МГУ" Пловдив 3Секция по технология на лекарствата и Биофармация, МГУ Пловдив
A study of mobilization of hematopoietic/progenitor stem cells in peripheral blood of rats, treated with Haberlea rhidopensis and Aphanizomenon flos-
aquae —i—
Intradditian. Hemopoietic/progenitor stem cells (HPSC) can differentiate into blood cells -leucocytes, erythrocites and platelets. The blood levels of HPSC can be increased by some substances. Aim. The aim of the current article is study the influence of Haberlea rhodopensis (HR) and Aphanizomenon flos-aquae (AFA) on the stem cells levels in peripheral blood of rats.
Materials and methods. 40 male Wistar rats were divided in 4 groups (n=10) and treated as follows: 1-st group with Aqua destillata in dose 1 ml/100 gr bw p.o; 2-nd - with 500 mg/kg bw AFA p.o.; 3-rd - with Aqua destillata in dose 1 ml/100 gr bw i.p.; 4-th with 50 mg/kg bw HR i.p. Two hours after the treatment HPSC levels in the peripheral blood were studied. Results. Our results showed a significant increase in blood levels of HPSC in the peripheral blood of rats after treatment with HR and AFA compared with controls. Administration of HR leads of decreased levels of erithrocytes and leucocytes and AFA increased the levels. The count of platelets in peripheral blood of rats, treated with HR was higher than control group. This count was lower in AFA group compared with controls. Canilusians. HR and AFA increased the count of HPSC in the peripheral blood. The influence of the substances on the differentiation is different. HR leads to elevated levels of platelets and AFA - of leucocytes and erithrocytes. Krywards: HPSC, Haberlea rhodopensis, Aphanizomenon flos-aquae, blood cells, rats.
Въгедение
Хемопоетичните прогениторни/стволови клетки (HPSC) изпълняват редица важни функции в организма. Те имат свойството да се диференцират в клетки на трите кръвни реда -левкоцити (Leu), еритроцити (Er) и тромбоцити (Thr) и да формират компоненти на имунната система. Способността на тези клетки да се трансформират в клетки на увредени органи (сърце, мозък, бял дроб, панкреас и др.) ги прави обект на интензивни изследвания. Прилагането им с лечебна цел започва в края на миналия век. Терапията с HPSC може да бъде приложена за лечение на злокачествени хематологични заболявания, инсулт, инфаркт, фрактури на кости, автоимунни болести като множествена склероза, захарен диабет, и др. Терапевтичното приложение на HPSC се извършва автоложно или алогенно чрез 34
трансплантация на костен мозък, венозни инфузии на клетъчна маса от незрели ембрионални клетки или зрели стволови клетки. Всички тези методи са инвазивни и носят висок риск както за донора, така и за реципиента.
При физиологични условия малък брой стволови клетки циркулират в периферната кръв. Увеличаване на техния брой може да се постигне и чрез фармакологично въздействие, например с гранулоцит колони-стимулиращ фактор (G-CSF), AMD-3100 и др. Хемокина а-stromal derived factor-1 (SDF-1a) привлича циркулиращи HPSC от периферната кръв към тъкани, които са претърпели болестно или травматично увреждане. SDF-1a активира рецептор на повърхността на циркулиращите стволови клетки, който е свързан с трансмембранен G-протеин (CXCR4) (1).
Gitte S Jensen и съавтори (2007) (2) установяват, че приемът на StemEnhance® (хранителна добавка, съдържаща AFA) води до увеличаване с 25±1% на броя на циркулиращите стволови клетки.
За други вещества от растителен произход също е установено повишаване на броя стволови клетки в кръвта след приложението им. Fucoidan е сулфатиран полизахарид, изолиран от Fucus vesiculosus (вид кафяви водорасли), за който е установено, че след еднократно инжектиране предизвиква значително повишаване на плазмените нива на SDF-1a, като това повишаване е дозозависимо и корелира с мобилизацията на HPSC (3).
Цел и задачи
Цел на настоящото изследване е проучване на влиянието на HR и AFA върху освобождаването на стволови клетки в периферната кръв на плъхове.
Материали и методи
40 мъжки бели плъха порода Wistar се поставят при стандартни условия: температура на въздуха 26,5±1 °C, влажност 45% и свободен достъп до храна и вода. Животните се разделят на четири групи с по 10 броя във всяка група. Групите се третират със следните вещества: 1-ва, контролна група, третирана перорално с дестилирана вода по 1 ml/ 100 gr телесна маса; 2-ра група, третирана перорално с AFA в доза 500 mg/kg bw; 3-та, контролна група, третирана интраперитонеално с дестилирана вода по 1 ml/100 gr телесна маса и 4-та група, третирана интраперитонеално с HR в доза 50 mg/kg bw. Два часа след третирането се взема проба от периферна кръв за изследване на пълна кръвна картина (ПКК), диференциална кръвна картина (ДКК) и HPSC (CD34+ клетки). Използват се микровети, обработени с антикоагулант - калиева сол на ЕДТА.
Екстрактът от Haberlea rhodopensis е приготвен в секция по Технология на лекарствата и Биофармация на МУ - Пловдив. Разтворът на AFA е получен след разтваряне на капсули StemEnhance® в дестилирана вода.
Броят на CD34+ клетки се определя с флоуцитометър (FC500-Beckman Coulter). Получените резултати се обработват със статистическа програма SPSS v. 19.0. Резултатите са представени като процент спрямо броя на съответните клетки в плацебо групата (прети за 100%).
Дизайнът на експеримента е одобрен от Българска Агенция по Безопасност на храните с разрешително №86 от 09.01.2014 и от Комисията по Научна етика на МУ - Пловдив (становище от заседание №3/26.06.2014).
Резултати
800
700
600
х 500
Ц 400 х
о 300
а
ю
200 100
***
***
I-~-1
Диаг. 1. Ефекти на АРА и ЫЯ върху броя на СБ34+ клетки в периферната кръв на плъхове (п=10).
Забележка: Броят клетки в опитните групи е представен като процент от броя клетки на плацебо групата, приет за 100 %; *** р □ 0,001 - спрямо плацебо.
Резултатите от изследванията на периферна кръв показват статистически значима разлика в броя СБ34+ клетки и при двете опитни групи. АРА и ЫЯ предизвикват значително повишаване на този брой спрямо контролната група (Диаг. 1).
МО
плацебо АРА хаберлел
Диаг 2. Ефекти на АРА и ЫЯ върху броя левкоцити в периферната кръв на плъхове (п=10). Забележка: Броят клетки в опитните групи е представен като процент от броя клетки на плацебо групата, приет за 100 %.
При ЫЯ се наблюдава тенденция към намаляване на броя левкоцити спрямо контролата, докато при АРА тенденцията е към увеличаване (вж. Диаг. 2).
Диаг 3. Ефекти на АРА и ЫЯ върху броя еритроцити в периферната кръв на плъхове (п=10). Забележка: Броят клетки в опитните групи е представен като процент от броя клетки в плацебо групата, приет за 100 %.
Приложението на ЫЯ доведе до намаляване на броя еритроцити, докато при АРА предизвика увеличаване на този брой, но без сигнификантна разлика спрямо плацебо групата (вж. Диаг. 3).
Диаг 4. Ефекти на АРА и ЫЯ върху броя тромбоцити в периферната кръв на плъхове (п=10).
Забележка: Броят клетки в опитните групи е изразен като процент от броя клетки в плацебо групата, приет за 100 %.
При ЫЯ се наблюдава тенденция към увеличаване на броя тромбоцити спрямо контролата,
докато при АРА тенденцията е към намаляване (вж. Диаг. 4).
Обсъждане
Получените от нас резултати показват сигнификантно повишаване на броя циркулиращи стволови клетки в периферната кръв на плъхове след третирането с екстракт от ЫЯ и АРА спрямо контролната група. Това ни дава основание да предположим, че тези вещества могат да бъдат използвани като стем-клетъчни либератори.
Gitte S Jensen и сътр. (2007) (2) получават сходни резултати при изследване на StemEnhance® при хора. Те установяват 25 процентно увеличение на броя на циркулиращите стволови клетки след прием на тази хранителна добавка. В достъпната литература не бяха открити данни от проучвания на ефектите на HR върху процесът на освобождаване на HPSC в периферната кръв. Не бяха открити данни и за промените в броя кръвни клетки след въздействие с тези вещества. Получените от нас данни за промените в броя еритроцити, левкоцити и тромбоцити не показват сигнификантни разлики спрямо съответния брой при плацебо групата. Третирането с HR доведе до намаляване на броя еритроцити и левкоцити в периферната кръв, а това с AFA -до повишаване на този брой.
Според други изследвания интраперитонеалното приложение на тотален екстракт от растението води до статистически значимо намаляване на общия брой левкоцити в периферната кръв на мишки (9,7 x 109±1,0 ; p<0,05) в сравнение с контролната група (15,6 x 109±1,7) (4).
Stellos K. и сътр. (2007) (5) установяват, че взаимодействието на тромбоцитите с ендотелните прогениторни клетки повлиява хемотаксиса, адхезията, активирането и диференциацията на прогениторните клетки. Освобождаването на SDF-1 от тромбоцитите при тяхното натрупване стимулира неоваскуларизацията чрез мобилизиране на прогениторните клетки и индуциране на тяхната диференциация в ендотелни клетки. Резултатите за броя тромбоцити показват тенденция към повишаване при приложение на HR и намаляване при приложението на AFA.
Вероятно тези изменения се дължат на различната диференциация на стволовите клетки. Възможно е HR да насочва диференциацията на HPSC към образуване на тромбоцити, а AFA - към левкоцити и еритроцити. Процесът на диференциация на стволовите клетки изисква определен период от време и можем да предположим, че именно това е причината за липсата на статистически значима разлика спрямо контролната група. Заключение
Получените от нас резултати показват сигнификантно повишаване на броя циркулиращи стволови клетки в периферната кръв на плъхове след третиране с екстракт от HR и AFA спрямо контролната група. Възможно е HR да насочва диференциацията на HPSC към образуване на тромбоцити, а AFA - към левкоцити и еритроцити.
Проучването е финансирано по вътреуниверситетски проект Н0-14/2013г. на МУ- Пловдив на тема "Проучване върху възможности за фармакологично освобождаване на зрели стволови клетки в периферната кръв на опитни животни". Библиография
1. Апостолова Е. Възможности за фармакологично мобилизиране на хематопоетични стволови/прогениторни клетки в периферната кръв-обзор. Сборник Научни трудове на Съюза на Учените в България-Пловдив, том XIV, 2013 г., ISSN 1311-9427, стр. 50-53.
2. Gitte S. Jensen, Aaron N. Hart, Lue A.M. Zaske, Christian Drapeau, et al. Mobilization of human CD34+CD133+ and CD34+CD133- stem cells in vivo by consumption of an extract from Aphanizomenon flos-aquae—related to modulation of CXCR4 expression by an L-selectin ligand? Cardiovascular Revascularization Medicine July 2007 vol. 8, Issue 3, Pages 189-202.
3. Sweeney EA, Papayannopoulou T. Increase in circulating SDF-1 after treatment with sulfated glycans. The role of SDF-1 in mobilization., Ann N Y Acad Sci. 2001 Jun;938:48-52; discussion 52-3.
4. Апостолова Е, Т. Денева, П. Павлов, Л. Пейчев, Р. Радев, В. Стоянова. Промени в някои хематологични показатели при опитни животни под влияние на Haberlea rhodopensis (Friv.) и Silicea 5 CH, Сборник Научни трудове на Съюза на Учените в България-Пловдив, том XIII, 2013 г., ISSN 13119427, стр. 102-105.
5. Stellos K, Gawaz M. Platelet interaction with progenitor cells: potential implications for regenerative medicine. Thromb Haemost. 2007 Nov;98(5):922-9.
