CC BY
36
12. Bone R.C. Toward a theory regarding the patogen- 13. Weiss L.P. Functional organization of hematopoi-esis of the systemic inflammatory response syndrome what etic tissue. In: Hoffman R.H. et al. (ads). Hematology:
we do and do not about cytokine regulation // Crit. Care. Basic principles and Practice, 2nd ed. New York: Churcill Med. - 1996. - Vol. 24. - № 1. - P. 163-172. Livingstone, 1995. - P. 193-206.
Координаты для связи с авторами: Добрых Вячеслав Анатольевич - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней ДВГМУ тел. +7-914-203-36-90, e-mail: sdobrykh@yandex.ru; Овчинникова Людмила Алексеевна - врач-лаборант 301-го ВКГ, Тен Татьяна Климентьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры пропедевтики внутренних болезней ДВГМУ; Уварова Ирина Владимировна - ассистент кафедры пропедевтики внутренних болезней ДВГМУ; Онищенко Ирина Витальевна - заочный аспирант кафедры пропедевтики внутренних болезней ДВГМУ.
□□□
УДК 616.5-018.7-006:[616.013.92:612.015.8]:616-038 О.А. Лебедько1,2, С.Г. Сапунцова1, М.Ю. Флейшман1, А.Ю. Мартыненко1, С.С. Тимошин1
ПРОЦЕССЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ЛОКАЛЬНЫЙ ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС В ПОКРОВНЫХ ЭПИТЕЛИЯХ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
1 Дальневосточный государственный медицинский университет,
680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-32-63-93, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru;
2Институт охраны материнства и детства СО РАМН,
680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, тел. 8-(4212)-98-05-91, г. Хабаровск
Резюме
Изучали состояние процессов пролиферации (методом иммуногистохимии по экспрессии Ki-67) в эпителии кожи при атопическом дерматите (АД) и красном плоском лишае (КПЛ), в эпителии слизистой оболочки терминального отдела повздошной кишки при болезни Крона, в эпителии слизистой оболочки прямой кишки при геморрагической лихорадке с почечным синдромом (ГЛПС). Во всех случаях наблюдалась гиперрегенераторная реакция эпителия. При АД индекс Ki-67 позитивных ядер увеличился (p<0,05) до 28,40±2,00 %, при КПЛ - до 32,60±1,90 % по сравнению с 8,65±1,31 % в контроле. Индекс меченых ядер при болезни Крона составил 24,05±1,17 %, в контроле - 10,64±0,62 % (p<0,05). При ГЛПС индекс экспрессии Ki-67 увеличился в 3,4 раза и составил 33,25±5,24 % по сравнению с 9,89±1,87 % в контроле (p<0,05). Гиперрегенерация эпителия сопровождалась развитием локального оксидативного стресса. Показатели спонтанной, Fe2+ - индуцированной, Н2О2 - индуцированной-люминолзависи-мой хемилюминесценции гомогенизированных биоптатов кожи при КП и АД, повздошной кишки при болезни Крона и прямой кишки при ГЛПС в 1,5-3,8 раза превышали соответствующие контрольные уровни. Обсуждается универсальность сочетания активации пролиферации и локального оксидативного стресса в покровных эпители-ях при различных патологических процессах.
Ключевые слова: эпителий, пролиферация, оксидативный стресс, заболевания человека.
O.A. Lebed’ko12, S.G. Sapuntsova1, M.Yu. Fleyshman1, A.Yu. Martynenko1, S.S. Timoshin1
STATE OF PROLIFERATION ASSOCIATED WITH THE LOCAL OXIDATIVE STRESS IN THE SURFACE
EPITHELIUM IN VARIOUS DISEASES
1Far Eastern State Medical University;
Mother and Child Care Institute of Siberian Branch of Russian Academy for Medical sciences, Khabarovsk
Summary
We studied the status of proliferation processes (Ki67-immunohistochemistry) in skin epithelium from patients with atopic dermatitis (AD) and lichen planus (LP), in mucosal epithelium of the terminal part of the ileum from patients with Crohn’s disease, in rectal mucosa epithelium from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS). Epithelial hyperregeneration was observed in all patient groups. The index of Ki-67-positive nuclei increased (p<0,05) to 28,40±2,00 % in patients with AD and to 32,6±1,9 % in patients with LP vs. 8,65±1,31 % in the reference sample. Labeling index increased (p<0,05) to 24,05±1,17 % in patients with Crohn’s disease vs. 10,64±0,62 % in the reference sample. The index expression of Ki-67 in patients with HFRS was 3,4 fold higher compared to the reference group (33,25±5,24 % vs. 9,89±1,87 %, p<0.05). Epithelial hyperregeneration followed by the development of local oxidative stress. Spontaneous,
Fe2+-induced and H202-induced luminol-dependent chemiluminescence in homogenized bioptates from the skin of patients with AD and LP, the ileum mucosa of patients with Crohn’s disease, rectum mucosa of patients with HFSP was 1,8-2,3-fold higher compared to the reference groups. Universality of a combination of activation of proliferation and local oxidative stress in the surface epithelium in various pathological processes is discussed.
Key words: epithelium, proliferation, oxidative stress, human diseases.
Представления об участии свободных радикалов в реализации различных цитофизиологических процессов в последнее время пополняются новыми данными, в т. ч. сведениями о вовлеченности активных форм кислорода в процессы сигнальной трансдукции, опосредующие различные события клеточного цикла [8, 9, 14]. В исследованиях [15] показано участие системы «процессинг свободных радикалов - детоксикация свободных радикалов» в регуляции внутриядерного синтеза ДНК. Следует отметить, что сведения о роли активных форм кислорода в модуляции пролиферативной активности в условиях целостного организма носят единичный характер [8].
Цель настоящего исследования - изучение процессов пролиферации и свободнорадикального окисления в покровных эпителиях при различных заболеваниях.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования были избраны: эпителий кожи при атопическом дерматите и красном плоском лишае, эпителий слизистой оболочки терминального отдела повздошной кишки при болезни Крона и эпителий слизистой оболочки прямой кишки при геморрагической лихорадке с почечным синдромом. На проведение исследования было получено согласие локальных этических комитетов соответствующих лечебно-профилактических учреждений, всеми пациентами были подписаны добровольные информированные согласия об участии в исследовании.
Обследовано 18 больных с атопическим дерматитом (АД) и 16 больных с красных плоским лишаем (КПЛ) в периоде обострения заболевания. Перед началом лечения проводили забор биоптатов кожи из пораженных участков. Контролем служили биоптаты нормальной кожи 24 пациентов, подвергнутых плановой хирургической операции по поводу грыж белой линии живота, левой и правой подвздошных областей.
Кроме того, в исследование были включены 45 больных с впервые выявленной болезнью Крона легкой и средней степени тяжести, с поражением терминального отдела подвздошной кишки в стадии обострения. Диагноз болезни Крона установлен на основании критериев Европейской организации по изучению болезни Крона и язвенного колита (2004 г.). Группу контроля составили 30 человек с функциональным заболеванием - синдромом раздраженного кишечника. Для исследования терминального отдела подвздошной кишки проводили фиброколоноилео-скопию по стандартной методике аппаратами фирмы «01утрш» с торцевой оптикой. Выполнялась прицельная ступенчатая биопсия слизистой оболочки терминального отдела подвздошной кишки.
Также было обследовано 10 больных ГЛПС. Диагноз у всех заболевших подтвержден серологическим методом. Поводом для проведения ректороманоскопии с последующей пункционной биопсией было наличие
у пациентов на момент исследования диарейного синдрома. Во всех случаях, последующее двухкратное бактериологическое исследование кала не выявило наличия патогенной кишечной микрофлоры у больных ГЛПС. Ректоскопия проводилась с помощью ректоскопа с волокнистым световодом Ре-ВС-3-1 (модель 632) на 5-10-й день от начала заболевания. Указанный период болезни соответствует периоду ранней апирек-сии (ранний период заболевания) по классификации Шапиро С.Е. и Ковальского ГС. [6]. Биопсия производилась стандартными ложкообразными щипцами на расстоянии 20-25 см от анального отверстия. Группу контроля составили 14 пациентов, которых обследовали по эпидемиологическим показаниям и при этом не было выявлено какой-либо патологии.
Пролиферативную активность в биоптатах кожи, слизистой оболочки подвздошной кишки и слизистой оболочки толстого кишечника оценивали по уровню экспрессии Ki-67. Биоптаты, фиксированные в «Имму-нофикс», проводили по батарее спиртов и ксилолов до заключения в гистовакс по стандартной методике. Срезы толщиной 5-7 мкм монтировали на обработанные полиллизином стекла («Sigma»). Использовали первичные готовые к применению антитела Rb Anti-Ki-67 (SP6) MAb фирмы SPRING bioscience в комплексе с полимерной системой детекции NovoLink «Novocastra Laboratories Ltd.». Для оценки специфичности имму-ногистохимической реакции использовали метод негативного контроля. Срезы, вместо первичных антител, инкубировали с 1 % неиммунной сывороткой и далее проводили как с первичными антителами. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция отсутствовала. Докрашивали срезы гематоксилином Лилли-Майера. Индекс экспрессии Ki-67 (процент им-мунопозитивных ядер) определяли после просмотра не менее тысячи клеток генеративной зоны.
Оценку биогенеза свободных радикалов в гомогенизированных биоптатах кожи, слизистой оболочки повздошной кишки и слизистой оболочки толстого кишечника осуществляли методом хемилюминесценции (ХМЛ). ХМЛ регистрировали на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Алгоритм ХМЛ-исследования свободнорадикального статуса включал определение следующих параметров интенсивности спонтанного и активированного свечения [2]: Ssp - интенсивность процессинга свободных радикалов; h - содержание гидроперекисей липидов; Sind-1 - скорость образования перекисных радикалов; Н -параметр, величина которого обратно коррелирует с перекисной резистентностью субстрата; Sind-2 - параметр, величина которого обратно коррелирует с активностью антиоксидантной антирадикальной защиты. Интенсивность ХМЛ, измеренную в милливольтах, рассчитывали на 1 г. влажной ткани и выражали в относительных единицах.
Результаты и обсуждение
Полученные данные свидетельствуют об однотипной активации синтеза ДНК во всех исследуемых группах. В различных видах покровного эпителия, выполняющего специфические функции при различных этиологии и патогенезе заболеваний, имела место ги-перрегенераторная реакция.
Индекс Ю67-позитивных ядер увеличился при атопическом дерматите до 28,40±2,00 % и при красном плоском лишае - до 32,60±1,90 %. В неизмененной коже доноров этот показатель составил 8,65±1,31 % (р<0,05). Наряду с увеличением индекса Ю67-позитивных ядер, имеет место расширение генеративной зоны. В неизмененной коже Ю67-позитивные ядра локализовались в базальном и нижнем отделах шиповатого слоя. При атопическом дерматите и красном плоском лишае меченые ядра идентифицировались в базальном, более высоких отделах шиповатого слоя. Единичные меченые ядра встречались в зернистом слое и нижнем отделе шиповатого слоя.
Гиперрегенераторная реакция наблюдалась также в эпителии слизистой оболочки подвздошной кишки. В неизмененной слизистой оболочке индекс Ю67-позитивных ядер составил 10,64±0,62 %, у пациентов с болезнью Крона он составил 24,05±1,17 %, р<0,05.
Данные иммуногистохимического анализа био-птатов слизистой оболочки прямой кишки при ГЛПС свидетельствуют об аналогичной направленности изменений пролиферативного статуса. В то время как в контрольной группе индекс экспрессии Ю-67 составил 9,89±1,87 %, у больных ГЛПС он увеличился в 3,4 раза и составил 33,25±5,24 % (р<0,05).
Результаты ХМЛ-анализа указывают на формирование локального оксидативного стресса во всех группах исследования (таблица). В биоптатах кожи при АД показатель Ssp превышал аналогичный в контроле в 1,6 раза, при КПЛ - в 1,8 раза. При АД концентрация гидроперекисей липидов (Ь) превышала контрольные значения в 2,1 раза, при КПЛ - в 2,3 раза, скорость накопления перекисных радикалов липидной природы ^^-1) возросла при АД в 1,6 раза, при КПЛ - в 1,9 раза. Нарушение процессинга свободных радикалов было обусловлено угнетением систем детоксикации: показатель Sind-2, значение которого обратно активности антиоксидантной антирадикальной системы, возрос в 2,1 раза при АД и в 2,2 раза при КПЛ. Снизилась устойчивость к перекисному окислению, на что указывает повышение показателя Н в 2,1 раза при АД и в 2,5 раза при КПЛ.
В биоптатах слизистой оболочки подвздошной кишки при болезни Крона также наблюдалось достоверное превышение всех показателей по отношению к группе контроля: Ssp - в 2 раза, Sind-1 - в 1,8 раза, Ь - в 2,3 раза, Sind-2 - в 2,1 раза, Н - в 2,3 раза.
В сравнении с контрольными показателями, в био-птатах слизистой оболочки прямой кишки у пациентов с ГЛПС зарегистрировано усиление генерации свободных радикалов ^р) - в 1,5 раза, повышение концентрации гидроперекисей липидов (Ь) в 3,8 раза. Перекисная резистентность и антиоксидантная анти-радикальная защита были снижены, о чем свидетель-
ствуют увеличение соответствующих показателей: Н в 2,5 раза, Sind-2 в 1,2 раза.
ХМЛ-показатели локального оксидативого статуса при различных заболеваниях (М±т)
Ssp Инд. ХМЛ ^е2) Инд. ХМЛ (люминол-Н2О2)
И | 8та-1 Н | 8та-2
биоптаты кожи больных атопическим дерматитом (АД) и красным плоским лишаем (КПЛ)
Группа сравнения 0,083 ± 0,005 0,071 ± 0,003 0,195 ± 0,007 0,104 ± 0,005 0,135 ± 0,011
Группа «АД» 0,136 ± 0,009* 0,150 ± 0,008* 0,309 ± 0,010* 0,217 ± 0,011* 0,286 ±0,017*
Группа «КПЛ» 0,148 ± 0,009* 0,165 ± 0,009* 0,371 ± 0,010* 0,258 ± 0,010* 0,303 ± 0,015*
биоптаты слизистой оболочки подвздошной кишки у пациентов с болезнью Крона
Группа сравнения 0,110 ± 0,020 0,120 ± 0,010 0,283 ± 0,012 0,172 ± 0,011 0,243 ± 0,023
Группа «болезнь Крона» 0,222 ± 0,021* 0,284 ± 0,029* 0,510 ± 0,020* 0,364 ± 0,021* 0,520 ± 0,020*
биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника у больных в ранний период геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС)
Группа сравнения 0,131 ± 0,005 0,128 ± 0,010 0,315 ± 0,013 0,202 ± 0,009 0,277 ± 0,010
Группа «ГЛПС» 0,202 ± 0,020* 0,486 ± 0,037* 0,346 ± 0,040* 0,502 ± 0,024* 0,329 ± 0,023*
Примечание. * - р<0,05 по отношению к группе сравнения.
Активация процессов клеточного деления при повторных и хронических воздействиях неблагоприятных факторов имеет приспособительный характер, направленный на поддержание целостности эпителиального пласта. В случаях отсутствия активации или угнетения пролиферативных процессов имеет место образование язв и эрозий [5].
Важную роль в стимуляции синтеза ДНК играет активация процессинга активных форм кислорода [15]. При этом следует иметь в виду, что в клетках млекопитающих присутствует свыше 20 редокс-сенситив-ных факторов транскрипции (МР-кВ, АР-1, р53 и др.), которые, наряду с регуляцией пролиферативных процессов, определяют выраженность воспалительной реакции, экспрессию цитокинов и факторов роста [7].
По-видимому, стимуляция пролиферативных процессов в условиях усиления образования факторов транскрипции, цитокинов и факторов роста не может привести к полному восстановлению эпителиального пласта. Возможно, в данном случае оно достигается повторными циклами «пролиферация-апоптоз-проли-ферация». Эта система ремоделирования эпителиального пласта в полной мере завершается, по-видимому, после нормализации гомеостаза. Известно, что в первые часы острого стрессорного воздействия имеет место так называемое «реактивное торможение» митозов, обусловленное G2 - М блоком. В ранее проведенных исследованиях нами было установлено, что реактивное торможение митозов в эпителии роговицы крыс в первые часы при однократном воздействии различных стрессоров (гипоксии, гипотермии и иммобилизаци-онном воздействии) сменялось гиперрегенераторной
реакцией [3, 4, 5]. Согласно данным литературы, в этих условиях наблюдается гиперпродукция активных форм кислорода, в т. ч. радикальной природы [12].
Результаты наших исследований, а также данные литературы свидетельствуют, что при повторном или
хроническом воздействиях экстремального фактора, сопровождающихся активацией процессов свободнорадикального окисления, в покровных эпителиях имеет место гиперрегенераторная реакция, которая оценивается как неспецифический механизмом адаптации.
Литература
1. Вдовенко С.В, Тимошин С.С. Влияние гипоксии на процессы клеточного деления эпителия роговицы и языка белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1983. - Т. 96. - № 8. -С. 86-87.
2. Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я., Задворная О.В. Свободнорадикальный статус неокортекса белых крыс и его модификация экзогенными производными тестостерона // Дальневосточный медицинский журнал. - 2011. - № 4. - С. 95-99.
3. Мельник Е.И., Тимошин С.С. Влияние хронического стрессорного воздействия на процессы клеточного деления эпителия роговицы и языка белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1983. - № 1. - С. 93-94.
4. Радивоз М.И., Тимошин С.С., Баранов А.П., Мурзина Н.Б. Влияние многократного сублетального перегревания на цитогенетические процессы в эпителии роговицы и клетках костного мозга белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1982. - № 4. - С. 98-100.
5. Тимошин С.С., Алексеенко С.А., Боровская Т.Ф. и др. Нарушение процессов пролиферации эпителия слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта при язвах и эрозиях // Архив патологии. -1991. - Т. 53. - № 3. - С. 37-40.
6. Шапиро С.Е., Ковальский ГС. Вопросы патогенеза и классификации клинических форм и вариантов геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом на Дальнем Востоке. - Хабаровск, 1968. - С. 169-176.
7. Brigelius-Flohe R., Flohe L. Basic principles and emerging concepts in the redox control of transcription factors // Antioxid. Redox. Signal. - 2011. - Vol. 15. -№ 8. - P. 2335-2381.
8. Chiu J., Dawes I.W. Redox control of cell proliferation // Trends. Cell Biol. - 2012. - Vol. 22. -№ 11. - P. 592-601.
9. Circu M.L., Aw T.Y. Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis // Free Radic. Biol. Med. - 2010. - Vol. 48. - № 6. - P. 749-762.
10. Forman H.J., Maiorino M., Ursini F. Signaling functions of reactive oxygen species // Biochemistry. -
2010. - Vol. 49. - № 5. - P. 835-842.
11. Locasale J.W., Cantley L.C. Metabolic flux and the regulation of mammalian cell growth // Cell Metab. -
2011. - Vol. 14. - № 4. - P. 443-451.
12. Menon S.G., Goswami P.C. A redox cycle within the cell cycle: ring in the old with the new // Oncogene. -2007. - Vol. 26. - № 8. - P. 1101-1109.
13. Ray P.D., Huang B.W., Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling // Cell Signal. - 2012. - Vol. 24. - № 5. -P. 981-990.
14. Sarsour E.H., Kumar M.G., Chaudhuri L., et al. Redox control of the cell cycle in health and disease // Antioxid. Redox Signal. - 2009. - Vol. 11. - № 12. -P. 2985-3011.
15. Shlomai J. Redox control of protein-DNA interactions: from molecular mechanisms to significance in signal transduction, gene expression, and DNA replication // Antioxid. Redox Signal. - 2010. - Vol. 13. -№ 9. - P. 1429-1476.
Координаты для связи с авторами: Лебедько Ольга Антоновна - д-р мед. наук, зав. лабораторией комплексных методов обследования НИИ ОMиД СО РАЖН, ведущий научный сотрудник ЦНИЛ ДВПиУ, тел. +7914-542-70-61, e-mail: leoaf@mail.ru; Сапунцова Наталья Геннадьевна - канд. мед. наук, доцент кафедры дерматовенерологии ДВПиУ; Флейшман Марина Юрьевна - доктор мед. наук, главный научный сотрудник ЦНИЛ ДВПиУ; Мартыненко Александр Юрьевич - канд. мед. наук, доцент кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ДВПиУ; Тимошин Сергей Серафимович - д-р мед. наук, профессор, зав. ЦНИЛ ДВП^У
□□□
