CC BY
194
ОБЗОРЫ»! ЛИТЕРАТУРЫ
© Л. Л. Ахмалтдинова, 2016 УДК 579
Л. Л. Ахмалтдинова
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Лаборатория коллективного пользования Карагандинского государственного медицинского университета
В обзоре отражена история, направления и перспективы развития приложений проточной цитометрии в клинической и санитарной микробиологии. Наиболее простым подходом является классическое использование моноклональных антител к возбудителю с флуоресцентной меткой. Одной из преимуществ проточной цитометрии является прямой подсчет количества микробных клеток в культуральной жидкости. Важнейшие приложения касаются оценки жизнеспособности бактерий и метаболического статуса. Это активно применяется в разработке экспресс-тестов определения антибиотикочувствительности. Ограничением проточной цитометрии является необходимость исследования микроорганизмов в жидкой среде. Ограничена таксономическая способность проточной цитометрии. Нет возможности продолжительного наблюдения за единичными клетками и оценки межклеточных взаимодействий (например, в биопленке). Есть перспективы объединения возможностей проточной цитометрии и других современных инструментов (полимеразно-цепной реакции, масс-спектрометрии) для получения комплексных решений. Есть перспективы расширения возможностей проточной цитометрии на исследования вирусных частиц.
Ключевые слова: проточная цитомерия, антибиотикорезистентность, клиническая микробиология
Возможности проточной цитометрии (ПЦ) не ограничиваются анализом человеческих клеток. Прогресс в микробиологии, где с введением полимеразно-цепной реакции (ПЦР), Fish, секвенирования в бактериологию возросла важность качественных и количественных характеристик единичных клеток, привел к развитию новых приложений ПЦ для микробиологии. Впервые применение ПЦ было описано для обнаружения E. coli в образце крови с чувствительностью 10 кл/мл. Но до середины 90-х гг. работы по ПЦ в микробиологии были единичными. Первыми появились подходы для применения ПЦ в промышленной микробиологии и в водной биологии [45], но дефицит стандартизированных процедур и интерпретации до сих пор является преградой для широкого внедрения в клиническую микробиологическую практику.
Наиболее простым подходом было классическое использование моноклональных антител к возбудителю с флуоресцентной меткой. Подобные протоколы были разработаны для Salmonella, Legionella, Pseudomonas, Cryptosporidium parvum для диагностики обсеме-ненности воды [3, 12]. Наименьший предел обнаружения был установлен 2*103 клеток/мл [3, 15]. Такой быстрый метод скрининга может быть теоретически применим к любому патогену, если существуют специфические антитела, однако это является одновременно преимуществом метода - одновременное типирование, и недостатком - ограничение наличия необходимых антител.
Одной из возможностей ПЦ является прямой подсчет количества микробных клеток в культуральной жидкости. Классический нефелометрический метод дает полуколичественный счет, а оптический анализ может дать точные количественные характеристики. Методы уже применяются для анализа питьевой воды и сточных вод в санитарии [10, 18, 19, 24, 29]. Возможности количественного счета сильно зависят от технических возможностей конкретного прибора и морфологических особенностей клеток и нуждаются в стандартизации. Заслугой прямого подсчета количества микроорганизмов путем ПЦ является то, что он не зависит от способности к культивированию и пригоден для определения в среде термофилов, олиготрофов и автотрофов. Преимуществом перед микроскопией является меньшая трудоемкость, высокая скорость и возможность определять минимальные концентрации микробов в водной среде (103-104 клеток/мл).
Способность выявлять различные физиологические состояния микробных клеток особенно важна для оценки жизнеспособности. Круг приложений для оценки жизнеспособности очень велик: клиника, промышленная микробиология, научные исследования. Эта возможность позволит как типировать микроорганизмы, так и выявлять их чувствительность к токсичным или лекарственным препаратам. Для определения физиологического состояния наиболее часто используют краситель пропидия йодид (PI) и SYBR Green I
и Syto. Так, в работе [2] при изучении обсеме-ненности водной среды с использованием красителя SYBR Green I выделяют 2 группы - с высокой и низкой интенсивностью окрашивания, которые помечают как группы с высокой и низкой интенсивностью нуклеинового обмена. Возможно, это связано с интенсивностью метаболизма внутри микробной популяции, и применение проточной цитометрии позволяет оценить метаболическое состояние внутри культуры клеток. Аналогичным образом PI был использован для контроля бактериальной жизнеспособности для легионелл [1] и кишечной палочки [5]. PI также используется для оценки бактериальной жизнеспособности в поверхностных водах [14], исследованиях эффекта хлорирования питьевой воды [31] и для контроля бактериальной жизнеспособности в водопроводной и бутилированной воде [5]. Ци-тометрический анализ жизнеспособности и функциональных характеристик осложняется тем фактом, что бактерии иначе, чем эукарио-ты, могут взаимодействовать с красителями и изменять их проявления. Однако есть несколько подходов: а) измерять количество клеток с поврежденной или целостной мембраной, по способности пропускать краситель или накапливать его (пропидия йодид, этидия бромид, Sybr, Syto), б) фиксировать клеточное дыхание с помощью тетразолевых красителей, в) фиксировать мембранный потенциал (DiBac4, Ox-onol, Rhodamine-13) г) определять активность ферментов внутри клетки (CFDA, BCECF-AM) [6, 25, 37, 38].
Предложен метод оценки жизнеспособности лактобактерий Lactococcus /Lactobacillus/, которые применяют в качестве про-биотиков, с помощью ПЦ. Лучшую дискриминацию между погибшими и жизнеспособными клетками получили с использованием красителей SFDA/TOTO, результаты полностью подтверждались классическими методами. Метод предложено использовать в пищевой и фармацевтической промышленности [6].
В исследовании [22] использовали зеленый флуоресцентный протеин (аналог флуоресцентного пигмента насекомых) для определения жизнеспособности E oii, сравнивая люминесцентный и флуоресцентный анализ (использовали Syto-9) жизнеспособности, анализ показал сравнимые результаты. ПЦ также стала полезным инструментом в изучении бактериального клеточного цикла [46].
Определение антибиотикорезистентно-сти является одной из актуальнейших проблем клинической микробиологии. Стандартные ме-
тоды диагностики антибиотикочувствительно-сти трудоемки и занимают до 24 ч после выделения чистой культуры (всего анализ длится до 72 ч), что является одним из факторов задержки назначения адекватной антибактериальной терапии. Использование технологий, которые приведут к снижению трудозатрат и увеличат скорость получения результатов, является экономически целесообразным и способствует повышению эффективности анти-биотикотерапии. Существующие экспресс-методы диагностики антибиотикочувствитель-ности (микроскопия, рамановская спектроскопия, MALDI-TOF спектроскопия, резонанс масс-спектроскопия, FluidScope-технология, изотер-мальная микрокалориметрия, magnetic bead rotation, nano-pore технологии имеют высокую стоимость, нуждаются в специфическом узкоспециализированном дорогостоящем оборудовании и не имеют преимуществ по трудозатратам или затратам времени перед цитометриче-ским методом детекции микроорганизмов. Применение проточной цитометрии в первую очередь позволит увеличить скорость и определить динамические характеристики взаимодействия антибиотика и патогенов [26].
Однако возникает еще одна проблема: в классической бактериологии под жизнеспособностью оценивается способность давать рост популяции, колониеобразующая способность. Однако на уровне одной клетки в проточной цитометрии в большей степени жизнеспособность - это стабильность мембраны клетки и метаболическая активность, и даже эти параметры могут быть не взаимосвязаны. Разные индикаторы могут давать разные результаты и попытка объединить их и является главным в адаптации цитометрических тестов к клинической бактериологии [42].
Еще одна проблема состоит в том, что следует считать минимальной подавляющей концентрацией антибиотика в цитометрии и применимы ли минимальные подавляющие концентрации в одинаковой степени и в цитометрии. Скорее всего, имеет смысл вводить минимальную флуоресцентно-подавляющую концентрацию антибиотика, которую некоторые авторы принимают за подавление 50% жизнеспособности после 4-часовой концентрации (использовали Candida, противогрибковые антибиотики, в качестве красителя акридиновый оранжевый) [43].
Однако практические исследования показали хорошую воспроизводимость между числом колониеобразующих бактерий и окрашенной популяцией (в частности, CFDA) в ПЦ,
и при соблюдении протокола можно говорить об идентичности [28].
Выявлены динамические характеристики взаимодействия спирта и бактерий (на примере S. aureus и Е. coli) [47]. Опробовано определение Time kill и методика дискриминации погибших клеток с помощью красителя PI. Предложен метод типирования метициллин-резистентных и метициллин-чувствительных штаммов S. aureus (MRSA и MSSA). При культивировании в среде с оксациллином и окрашивании коммерческими наборами на определение жизнеспособности методом проточной цитометрии можно разделить на гистограммах метициллин-устойчивые и метицилин -чувствительные штаммы [40, 41].
Также ПЦ позволила типировать ванко-мицин-резистентные штаммы Enterococcus fae-calis с помощью флуоресцентного ванкомицина и простого пропидия йодида [21]. Группа исследователей [20] доказала, что не только методология, но и усовершенствование статистического анализа цитометрических данных позволяет качественно разделять чувствительные и устойчивые штаммы, даже в сложных случаях - анализ антибиотикочувствительно-сти синегнойной палочки или кишечной палочки с антибиотиками. Анализ занял 4 ч, против 42 ч стандартными методами. В качестве метки авторы использовали мальтогексозу, меченную флуорохромом.
Использование ПЦ в исследованиях грибковой флоры - одно из наиболее перспективных направлений анализа антибиотикочув-ствительности. Грибы в целом более крупные, что даже облегчает анализ ПЦ, но особенности клеточной стенки могут по-разному реагировать с флуорецентными красителями для ПЦ [9, 33, 34, 44]. Содержание хитина в клеточной стенке грибковых клеток также возможно делать с помощью ПЦ [9]. Было предложено выявить не только антибиотикочувствитель-ность, но и особенности физиологии, фармако-динамики [32].
Выявление продуцентов бета-лактамаз очень важно в клинической практике, классические методы трудоемки, молекулярно-генетические методы дороги и выявляют только единичные мишени-гены из множества возможных генов антибиотикорезистентности. ПЦ в этом случае является быстрым и точным решением для клинической микробиологии [11].
В исследовании ПЦ применяли для целей метагеномного исследования как инструмент идентификации, концентрирования и сортировки необходимой популяции [4]. На принципе ПЦ основан анализатор UF-1000, ко-
торый может произвести прямой подсчет количества бактерий в образце мочи без предварительного посева. Несмотря на узкую специализацию его пытаются использовать не только при инфекциях мочевого тракта, но и при анализе крови, ликвора, слюны [7, 16, 17, 36].
Сама по себе проточная цитометрия не позволяет проводить идентификацию флоры, но сочетание с прямой детекцией MALDI-TOF [25] позволило создать наиболее быстрый метод. Мало того, авторы модифицировали методику для определения антибиотикочувстви-тельности. Авторы утверждают, что результаты точны, воспроизводимы, подтверждаются коммерческими тестами, позволяют определить чувствительность к препаратам в течение 3 ч.
Ограничениями ПЦ является необходимость исследования микроорганизмов в жидкой среде. Ограничена таксономическая способность ПЦ. Нет возможности продолжительного наблюдения за единичными клетками и оценки межклеточных взаимодействий (например, в биопленке).
Перспективы ПЦ: диагноз вирусной инфекции требует не только обнаружения вируса, но и точной количественной вирусной нагрузки в образцах. Основным препятствием для обнаружения вирусов ПЦ является их маленький размер. С конца 1990-х гг. несколько докладов показали обнаружение вирусов в различных образцах окружающей среды с помощью ПЦ. Например, пелагические морские вирусы обнаружены с помощью SYBR Green I окрашивания [27], хотя разделение вируса сигнала и фона не было оптимальным. Специально разработанный цитометр был оптимизирован для обнаружения вирусов и наночастиц [13], однако применение его еще ограничено.
Кратковременные последствия физиологических функций микробного сообщества после изменения внешней среды не могут быть измерены ни классическими, ни молекулярно-генетическими методами. Адекватный подбор флуоресцентного индикатора позволит на примере отдельных клеток зафиксировать изменения в метаболическом статусе.
Сканирующая ПЦ имеет большую разрешающую способность и имеет перспективы в микробиологии. Так, позволяет оценить морфологию каждой клетки в популяции и субклеточных структур, что имеет перспективы как для оценки клеточного метаболизма, так и в прикладных целях - для оценки антибиотикорезистентности в короткие сроки после взаимодействия с антибиотиком (менее 30 мин) [23].
Оптимизация приложений ПЦ также может раскрыть новые грани метода. Так, система визуализации Amnis позволяет точно изучать органеллы и высчитывать митотический индекс делящейся популяции [30].
Более интересными и ожидаемыми представляются системы «все в одном», где будут совмещены возможности цитометрии, MALDI-TOF и возможно даже компоненты ПЦР, которые позволят дать полный и точный анализ культуры или смеси культур. Хотя в целом такая система уже мало будет напоминать классическую ПЦ. Так, в системе Luminex уже сейчас совмещены возможности ПЦ и ПЦР-анализа, и есть разработки, позволяющие контролировать биобезопасность и типировать микроорганизмы, вирусы и биотоксины [8, 35, 39, 48].
ЛИТЕРАТУРА
1 Allegra S. Use of flow cytometry to monitor Legionella viability /S. Allegra, F. Berger, P. Berthelot //Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - V. 74. - P. 7813-7816.
2 Bouvier T. A comparative study of the cytometric characteristics of High and Low nucleic -acid bacterioplankton cells from different aquatic ecosystems /T. Bouvier, P. A. Giorgio, J. M. Gasol //Environ. Microbiol. - 2007. - V. 9. - P. 2050-2066.
3 Barbosa J. M. A flow cytometric protocol for detection of Cryptosporidium spp /J. M. Barbosa, S. A. Costa-de-Oliveira, A. G. Rodrigues // Cytometry A. - 2008. - V. 73. - P. 44-47.
4 Belinda C. F. Flow Cytometry in Environmental Microbiology: A Rapid Approach for the Isolation of Single Cells for Advanced Molecular Biology Analysis /C. F. Belinda, J. W. Tristrom, L. B. Peter //Microbial Systems Biology. - 2012. - V. 881. - P. 3-26.
5 Berney M. Rapid, cultivation-independent assessment of microbial viability in drinking water /M. Berney, M. Vital, I. Hulshoff et al. //Water Res. - 2008. - V. 42. - P. 4010-4018.
6 Boi P. Evaluation of Escherichia coli viability by flow cytometry; a method for determining bacterial responses to antibiotic exposure /P. Boi, A. Manti, A. Pianetti //Cytometry B Clin. Cy-tom. - 2015. - V. 3. - P. 149-153.
7 Buoro S. Automated Cerebrospinal Fluid Cell Counts Using the New Body Fluid Mode of Sysmex UF-1000i /S. Buoro, S. Esposito, M. Ales-sio et al. //J. Clin. Lab. Anal. - 2015. - P. 1-11.
8 Choudhary M. L. Comparison of the conventional multiplex RT-PCR, real time RT-PCR and Luminex xTAG® RVP fast assay for the detection of respiratory viruses /M. L. Choudhary, S. P.
Anand, S. A. Tikhe et al. //J. Med. Virol. - 2016. -V. 1. - P. 51-57.
9 Costa-de-Oliveira S. Determination of chitin content in fungal cell wall: an alternative flow cytometric method /S. Costa-de-Oliveira, A. P. Silva, I. M. Miranda et al. //Cytometry A. -2013. - V. 83. - P. 324-328.
10 Falcioni T. Comparison of disruption procedures for enumeration of activated sludge floc bacteria by flow cytometry /T. Falcioni, A. Manti, P. Forte //Cytometry B Clin. Cytom. -2006. - V. 70. - P. 149-153.
11 Faria-Ramos I. A novel flow cytometric assay for rapid detection of extended-spectrum beta-lactamases /I. Faria-Ramos, M. J. Espinar, R. Rocha //Clin. Microbiol. Infect. - 2013. - V. 19.
- P. E8-E15.
12 Faria-Ramos I. Detection of Legionella pneumophila on clinical samples and susceptibility assessment by flow cytometry /I. Faria-Ramos, S. Costa-de-Oliveira, J. Barbosa //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2012. - V. 1. - P. 3351-3357.
13 Ferris M. M. Rapid enumeration of respiratory viruses /M. M. Ferris, M. O. McCabe, L. G. Doan //Anal. Chem. - 2002. - V. 74(8). - P. 1849-1856.
14 Freese H. M. Bacterial abundance, activity, and viability in the eutrophic River Warnow, Northeast Germany /H. M. Freese, U. Karsten, R. Schumann //Microb. Ecol. - 2008. - V. 51. - P. 117-127.
15 Füchslin H. P. Rapid and quantitative detection of Legionella pneumophila applying im-munomagnetic separation and flow cytometry /H. P. Füchslin, S. Kötzsch, H. A. Keserue // Cytometry A. - 2010. - V. 77. - P. 264-274.
16 Geerts N. Urine flow cytometry can rule out urinary tract infection, but cannot identify bacterial morphologies correctly /N. Geerts, A. R. Jansz, K. J. Boonen //Clin. Chim. Acta. - 2015. -V. 26. - P. 448-486.
17 Gutiérrez-Fernández J. Sysmex UF-1000i performance for screening yeasts in urine / J. Gutiérrez-Fernandez, C. Riazzo, S. San-bonmatsu, J. de Dios Luna //APMIS. - 2014. - V. 122. - P. 324-328.
18 Hammes F. Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes /F. Hammes, M. Berney, Y. Wang //Water Res.
- 2008. - V. 42. - P. 269-277.
19 Hoefel D. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques /D. Hoefel, W. L. Grooby, P. T. Andrews //J. Microbiol. Methods. - 2006. - V. 55. - P. 585-597.
20 Huang T. H Rapid Cytometric Antibiotic Susceptibility Testing Utilizing Adaptive Multidimensional Statistical Metrics /T. H. Huang, X. Ning, X. Wang //Anal. Chem. - 2015. - V. 87. -P. 1941-1949.
21 Jarzembowski T. Flow Cytometry Approach Study of Enterococcus faecalis Vancomycin Resistance by Detection of Vancomycin@FL Binding to the Bacterial Cells /T Jarzembowski., A. Jozwik, K. Wisniewska //Curr. Microbiol. -2010. - V. 61. - P. 407-410.
22 Lehtinen J. Fluoro-luminometric realtime measurement of bacterial viability and killing /J. Lehtinen, M. Virta, E. M. Lilius //J. Microbiol Methods. - 2003. - V. 55. - P. 173-186.
23 Konokhova A. I. High-precision characterization of individual E. coli cell morphology by scanning flow cytometry /A. I. Konokhova, A. A. Gelash, M. A. Yurkin //Cytometry A. - 2013. - V. 83. - P. 568-575.
24 Lebaron P. Does the high nucleic acid content of individual bacterial cells allow us to discriminate between active cells and inactive cells in aquatic systems /P. Lebaron, P. Servais, H. Agogue //Appl. Environ. Microbiol. - V. 67. -P. 1775-1782.
25 March G. A. A new approach to determine the susceptibility of bacteria to antibiotics directly from positive blood culturebottles in two hours /G. A. March, M. C. Garcia-Loygorri, M. Simarro //J. Microbiol. Methods. - 2015. - V. 109. - P. 49-55.
26 March Rossello G. A. Rapid antibiotic susceptibility test in Clinical Microbiology /G. A. March Rossello, M. A Bratos Perez //Enferm. In-fecc. Microbiol. Clin. - 2015. - V. 103. - P. 9-17.
27 Marie D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry / D. Marie, C. P. Brussaard, R. Thyrhaug //Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V. 65. - P. 45-52.
28 Matsuoka H. Flow cytometric method for in situ preparation of standard materials of a small defined number of microbial cells with colony-forming potentiality /H. Matsuoka, K. Nakano, N. Takatani //J. AOAC Int. - 2014. - V. 97. - P. 479-483.
29 Pallinger E. Flow cytometry: is it a novel tool in microbiological diagnostics? //Orv. Hetil. -2013. - V. 4154. - P. 1207-1218.
30 Parris C. N. Enhanced Y-H2AX DNA damage foci detection using multimagnification and extended depth of field in imaging flow cytometry /C. N. Parris, S. Adam Zahir, H. Al-Ali // Cytometry A. - 2015. - V. 87. - P. 717-723.
31 Phe M. H. Nucleic acid fluorochromes and flow cytometry prove useful in assessing the
effect of chlorination on drinking water bacteria / M. H. Phe, M. Dossot, H. Guilloteau //Water. Res.
- 2005. - V. 39. - P. 3618-3628.
32 Pina-Vaz C. Evaluation of antifungal susceptibility using flow cytometry //Methods Mol. Biol. - 2010. - V. 638. - P. 281-289.
33 Posteraro B. Antifungal susceptibility testing: current role from the clinical laboratory perspective /B. Posteraro, R. Torelli //Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis. - 2014. - V. 6. - e2014030.
34 Posteraro B. The future of fungal susceptibility testing /B. Posteraro, M. Sanguinetti // Future Microbiol. - 2014. - V. 9. - P. 947-967.
35 Regan J. F. Environmental monitoring for biological threat agents using the autonomous pathogen detection system with multiplexed poly-merase chain reaction /J. F. Regan, A. J. Makarewicz, B. J. Hindson //Anal. Chem. - 2008.
- V. 80. - P. 7422-7429.
36 Shang Y. J. Systematic review and meta-analysis of flow cytometry in urinary tract infection screening /Y. J. Shang, Q. Q. Wang, J. R. Zhang // Clin. Chim. Acta. - 2013. - V. 23. - P. 90-95.
37 Shapiro H. M. Flow cytometry of bacterial membrane potential and permeability //Methods Mol. Med. - 2008. - V. 142. - P. 175-186.
38 Shapiro H. M. Multiparameter Flow cytometry of bacterial //Methods in Molecular biology: Flow cytometry protocols 2nd /Edited by T. S. Hawley and R. F. Hawley. - Humana Press Inc, 2004. - 34 p.
39 Sharma P. A Multiplex Assay for Detection of Staphylococcal and Streptococcal Exotoxins /P. Sharma, N. Wang, A. S. Chervin //PLoS One. - 2015. - V. 25. - eCollection e0135986.
40 Shrestha N. K. Rapid Differentiation of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus by Flow Cytometry after Brief Antibiotic Exposure /N. M. Scalera, D. A. Wilson //J. Clin. Microbiol. - 2011. - V. 49. - P. 2116-2120.
41 Shrestha N. K. Immuno-flow cytometry for the rapid identification of Staphylococcus aureus and the detection of methicillin resistance / N. K. Shrestha, D. A. Wilson, N. M. Scalera //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2012. - V. 31. - P. 1879-1882.
42 Strauber H. Viability states of bacteria -specific mechanisms of selected probes // Cytometry A. - 2010. - V. 77. - P. 623-634.
43 Vale-Silva L. A. Comparison of the E-test and a rapid flow cytometry-based method with the reference CLSI broth microdilution protocol M27-A3 for the echinocandin susceptibility testing of Candida spp. /L. A. Vale-Silva, P. Pinto, V. Lopes //Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. -2012. - V. 31. - P. 941-946.
44 Vale-Silva L. A. Antifungal susceptibility testing by flow cytometry: is it the future? // Mycoses. - 2006. - V. 49. - P. 261-273.
45 Wang Y. Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology /Y. Wang, F. Hammes, K. De Roy //Trends Biotechnol. - 2010. - V. 28. - P. 416-424.
46 Williams A. J. Level 2 validation of a flow cytometric method for detection of Esche-richia coli O157:H7 in raw spinach /A. J. Williams, W. M Cooper, C. V. Summage-West //Int. J. Food. Microbiol. - 2015. - V. 21. - P. 215-216.
47 Wozniak-Kosek A. Flow cytometry analysis of the activity of disinfecting agents tested
L L. Akhmaitdinova
FLOW CYTOMETRY IN CLINICAL MICROBIOLOGY Shared Laboratory of Karaganda state medical universtty
with Staphylococcus aureus and Escherichia coli // Pol. J. Microbiol. - 2005. - V. 54. - P. 21-27.
48 Zacharias N. Application of flow cytometry and PMA-qPCR to distinguish between membrane intact and membrane compromised bacteria cells in an aquatic milieu /N. Zacharias, T. Kiste mann, C. Schreiber //Int. J. Hyg. Environ. Health. - 2015. - V. 8. - P. 714-722.
49 Ziglioa G. Assessment of activated sludge viability with flow cytometry /G. Ziglioa, G. Andreottolaa, S. Barbestib //Water Research. -2002. - V. 36. - P. 460-468.
Поступила 25.08.2016 г.
The review reflects the history, trends and development prospects of applications of flow cytometry in clinical and sanitary microbiology. The simplest approach is the classic use of monoclonal antibodies to a causative agent with a fluorescent tag. One of the advantages of the flow cytometry is a direct calculation of the microbial cells number in the culture fluid. The most important applications relate to assess of the bacteria viability and metabolic status. It is actively used in the development of rapid tests to determine the antibiotic susceptibility. Limitation of the flow cytometry is a need for studies of microorganisms in a liquid medium. A taxonomic ability of the flow cytometry is limited. There is no possibility of a prolonged observation of single cells and assessment of intercellular communication (for example, in the biofilm). There are prospects for joining potentials of the flow cytometry and other modern instruments (PCR, mass spectrometry) to obtain integrated solutions. There are prospects for expanding potentials of the PC to the studies of viral particles.
Keywords: flow cytometry, clinical microbiology, antibiotic susceptibility
Л Л. Ахмалтдинова
КЛИНИКАЛЫК МИКРОБИОЛОГИЯДАFЫ AFbmbl ЦИТОМЕТРИЯ КараFанды мемлекеттк медицина университет
Шолуда клиникалык пен санитарлык микробиологиядары арынды цитометрия (АЦ) косымшаларынын тарихы, барыттары мен даму болашактары керсеттген. Ен карапайым тэст флуоресцентпк танбамен коздыррышка карсы моноклоналды денелердi классикалык пайдалану болып табылады. АЦ-нын артыкшылыктарынын б1р1 культуралды суйыктыктары микробтык жасушаларды ткелей есептеу болып табылады. Ен манызды косымшалар бактериялардын ^рштк кабте™ жэне метаболизмдк мэртебен баралаура катысты. Бул антибиотик™ сезпш^кл аныктаудын жедел сынактарын эзiрлеуде белсендi колданылады. А| шектеулiктерi микроарзаларды суйык ортада зерттеу кажетттИ болып табылады. АЦ-нын таксономикалык кабшет шектелген. Белек жасушаларды созылмалы кадаралау жэне жасушааралык езара эрекеттердi (мысалы, биокабыкшада) баралау мYмкiндiгi жок. Кешендi шешiмдер алу Yшiн АЦ-нын жэне баска заманауи аспаптардын (ПТР, масс-спектрометрия) мYмкiндiктерiн б1р1кт1ру келешектерi бар. АЦ мYмкiнiдктерiн вирустык белшектердi зерттеуге кенейту келешектерi бар.
Клт сездер: арынды цитометрия, клиникалык микробиология, антибиотик™ сезпш^кп
