CC BY
43
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ И ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ КЛОНАЛЬНОСТИ В РАЗГРАНИЧЕНИИ ОПУХОЛЕВОЙ И РЕАКТИВНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ БОЛЬШИХ ГРАНУЛЯРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ
Flow cytometry and PCR-based T-cell clonality testing
for discriminating between reactive and neoplastic proliferation
of large granular lymphocytes
Чернова Н. Г.1, Сидорова Ю. В.1, Захарько Е. И.1, Наумова Е. В.2, Рыжикова Н. В.1, Гальцева И. В.1, Двирнык В. Н.1, Смирнова С. Ю.1, Судариков А. Б.1, Кохно А. В.1, Моисеева Т. Н.1, Луговская С. А.2, Звонков Е. Е.1, Савченко В. Г.1
1 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
2 Кафедра клинической лабораторной диагностики ФГБУЗ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
Chernova N. G.1, Sidorova Yu. V.1, Zakharko E. I.1, Naumova E. V.2, Ryzhikova N. V.1, Galtseva I. V.1, Dvirnyk V. N.1, Smirnova S. Yu.1, Sudarikov A. B.1, Kokhno A. V.1, Moiseeva T. N.1, Lugovskaya S. A.2, Zvonkov E. E.1, Savchenko V. G.1
1 National Research Center for Hematology, Moscow, Russian Federation
2 Department of clinical laboratory diagnostics, Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow, Russian Federation
■Ш РЕЗЮМЕ
Введение. Пролиферация больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) может быть ассоциирована с вирусной инфекцией, аутоиммунными заболеваниями или быть проявлением хронического лимфопролиферативно-го заболевания NK-клеток (ХЛПЗ^^ и Т-клеточного лейкоза из больших гранулярных лимфоцитов ^-Л БГЛ). Дифференциальная диагностика пролиферации БГЛ до сих пор представляет определенные трудности. Цель: оценить значение иммунофенотипирования методами проточной цитометрии и ПЦР-исследования Т-кле-точной клональности в разграничении реактивной и опухолевой пролиферации БГЛ.
Материалы и методы. Проведен анализ основных клинико-лабораторных показателей у 68 пациентов с БГЛ-лимфоцитозом (20 мужчин и 48 женщин) в возра -сте от 22 до 79 лет (медиана возраста 53 года). Всем больным было выполнено цитологическое исследова -ние мазка периферической крови, иммунофенотипи-рование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии, исследование Т-клеточной кло-
ABSTRACT
Background. Proliferation of large granular lymphocytes (LGL) can be associated with viral infections, autoimmune disorders, chronic lymphoproliferative disorder of NK-cells (CLPD-NK), or T-cell large granular lymphocytic leukemia (T-LGL). Differential diagnosis between reactive and neoplastic LGL proliferation could be a challenge. Objective. To evaluate the role of morphological, immunophenotypic (flow cytometry) and molecular genetic (PCR-based T-cell clonality) studies in differential diagnosis of LGL proliferation.
Materials and methods. 68 patients with increased peripheral blood LGL counts were enrolled in the study. Male/female ratio was 20/48; the median age was 53 (22—79) years. Blood smear, immunophenotyping by flow cytometry, and PCR-based T-cell clonality assays (TCRG (Vy-Jy) and TCRG (Dp-Jp and Vp-Jp)) were performed in all cases.
Results. We found that morphology, immunophenotype, relative and absolute LGL counts, or heterogenic expression of T-cell markers can not distinguish between
нальности методом ПЦР по реаранжировкам генов у- и Р-цепей T-клеточного рецептора.
Результаты. В результате исследования было пока -зано, что морфологические и иммунофенотипические признаки, относительный и абсолютный лимфоцитоз, гетерогенность экспрессии Т-клеточных маркеров не позволяют разграничить опухолевую и реактивную пролиферацию БГЛ. Наиболее специфичным для разграничения реактивного и опухолевого БГЛ -лимфоци-тоза оказалось одновременное выявление монокло-нальности по TCRG (Vy-Jy) и TCRG (VP-JP) локусам или выявление полной реаранжировки TCRG (VP-JP).
Ключевые слова: большие гранулярные лимфоциты, хроническое лимфопролиферативное заболевание NK-клеток, Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов, проточная цитометрия, ПЦР-исследование Т-клеточной клональности, клональные реаранжировки
Для цитирования: Чернова Н. Г, Сидорова Ю. В., Захарько Е. И., Наумова Е. В., Рыжикова Н. В., Гальцева И. В., Двирнык В. Н., Смирнова С. Ю., Судариков А. Б., Кохно А. В., Моисеева Т. Н., Лугов-ская С. А., Звонков Е. Е., Савченко В. Г. Проточная цитометрия и ПЦР-исследование Т-клеточной клональности в разграничении опухолевой и реактивной пролиферации больших гранулярных лимфоцитов. Гематология и трансфузиология. 2018; 63(2):124—133 doi: 10.25837/HAT.2018.48..2..003
Для корреспонденции: Чернова Наталья Геннадьевна, к. м. н., врач-гематолог отделения интенсивной высокодозной химиотерапии лим-фом с круглосуточным и дневным стационаром ФГБУ «НМИЦ гема -тологии» Минздрава России, 126167 г. Москва, Россия E-mail: ngchernova@mail.ru
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила 19.03.18 Принята к печати 15.10.2018
neoplastic and reactive LGL proliferation. Clonal TCRG (Vy-Jy) and TCRG (DP-JP) gene rearrangements were observed in reactive LGL lymphocytes and T-LGL. Complete rearrangements of TCRG (VP-JP) genes were specific for malignancies and were not detected in any case of reactive lymphocytosis.
Keywords: large granular lymphocytes, chronic lymphoproliferative disorder of NK-cells, T-cell large granular lymphocytic leukemia, flow cytometry, PCR-based T-cell clonality testing, reactive lymphocytosis For citation: Chernova N. G., Sidorova Yu. V., Zakharko E. I., Naumova E. V., Ryzhikova N. V., Galtseva I. V., Dvirnyk V. N., Smirnova S. Yu., Sudarikov A. B., Kokhno A. V., Moiseeva T. N., Lugovskaya S. A., Zvonkov E. E., Savchenko V. G. Flow cytometry and PCR-based T-cell clonality testing for discriminating between reactive and neoplastic proliferation of large granular lymphocytes. Russian Journal of Hematology and Transfusiology (Gematologiya i transfuziologiya). 2018; 63(2):124—133 (in Russian) doi: 10.25837/HAT.2018.48..2..003
For correspondence: Chernova Natalia, MD, PhD, hematologist in National Research Center for Hematology, Moscow, 125167 Russian Federation. E-mail: ngchernova@mail.ru Information about authors:
Chernova N. G., http://orcid.org/0000-0002-0827-4052; Sidorova Yu. V., http://orcid.org/0000-0003-1936-0084; Zakharko E. I., https://orcid.org/0000-0002-1884-352X; Naumova E. V., http://orcid.org/0000-0002-6048-5746; Ryzhikova N. V., http://orcid.org/0000-0003-2424-9524; Galtseva I. V., https://orcid.org/0000-0002-8490-6066; Dvirnyk V. N., http://orcid.org/0000-0002-9877-0796; Smirnova S. Yu., http://orcid.org/0000-0001-6220-8868; Sudarikov A. B., https://orcid.org/0000-0001-9463-9187; Kokhno A. V., http://orcid.org/0000-0003-0261-5941; Moiseeva T. N., https://orcid.org/0000-0001-9591-8508; Lugovskaya S. A., http://orcid.org/0000-0002-6405-3422; Zvonkov E. E., http://orcid.org/0000-0002-2639-7419; Savchenko V. G., https://orcid.org/0000-0001-8188-5557. Financial disclosure. The study had no sponsorship. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 19 Mar 2018 Accepted 15 Oct 2018
Введение
Термин «Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов» ввел Т. Ьои§Ьгап в 1993 г. для описания клональной пролиферации зрелых посттими-ческих клеток [1]. Большие гранулярные лимфоциты (БГЛ) —— это антигенпримированные цитотоксические Т-, ККТ-лимфоциты и КК-клетки [2]. В норме у взрослого человека БГЛ составляют 10——15% общего числа мононуклеарных клеток периферической крови [3]. Большинство БГЛ представлено СО3-- КК-клетками, и
лишь около 15% составляют СО3+ цитотоксические Ти ККТ-лимфоциты. Клональная пролиферация СО3-/ С056+-клеток в классификации ВОЗ (2017) обозначена термином «хроническое лимфопролиферативное заболевание КК-клеток» (ХЛПЗ-КК), а СВ3+/СЭ8+-клеток —— термином «Т-клеточный лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов» (Т-ЛБГЛ). Клональная пролиферация цитотоксических Т-лимфоцитов составляет около 85% всех случаев БГЛ-лимфопролиферации [4].
Т-ЛБГЛ диагностируют преимущественно в возрасте 55-—60 лет [5, 6]. В литературе не отмечено значительных различий в заболеваемости мужчин и женщин или в географическом распространении болезни. Этиология Т-ЛБГЛ до конца не известна, однако отмечена четкая связь с аутоиммунными заболеваниями. У 30% больных наблюдается сочетание Т-ЛБГЛ с ревматоидным артритом, при других ревматологических заболеваниях Т-ЛБГЛ встречается значительно реже [7—9]. При Т-ЛБГЛ в гемограмме наблюдается относительный и/или абсолютный БГЛ-лимфоцитоз. При цитологическом исследовании мазка периферической крови опухолевые БГЛ не отличаются от нормальных: лимфоциты средних или крупных размеров с эксцентрично расположенным ядром, умеренно конденсированным хроматином, обильной слабо базофильной цитоплазмой, грубыми и/или нежными азурофильными гранулами [4]. Общее количество лейкоцитов может быть нормальным или слегка повышенным, у 85% больных наблюдается гранулоци-топения (количество гранулоцитов не превышает 0,5 X 109/л), у 50% -— анемия, у 20% -— тромбоцитопения [4].
Опухолевые лимфоциты при Т-ЛБГЛ, как и их нормальные аналоги, имеют зрелый цитотоксический Т-клеточный иммунофенотип и экспрессируют поверхностные маркеры С03, С08, С02, С016, С056, С057 [4]. В отличие от нормальных БГЛ, на опухолевых клетках наблюдается снижение и/или отсутствие и/или гетерогенность экспрессии Т-клеточных маркеров, в частности С02, С05, С07 [10]. По наличию Т-клеточных маркеров С03, С04 и С08 на поверхности опухолевых клеток выделяют 4 иммунофенотипиче-ских варианта: С08-позитивный (С03+С04-С08+), С04-позитивный (С03+С04+С08-), дубль-позитивный (СВ3+СВ4+СЭ8+), дубль-негативный (СВ3+СЭ4-С08) [3, 11, 12]. В зависимости от типа Т-клеточного рецептора (ТСК) выделяют два варианта Т-ЛБГЛ: у5 и ар. В большинстве случаев Т-ЛБГЛ имеется реаран-жировка генов Р-цепи ТСК (ТСКБ), в редких случаях ТСЯБ остается в герминальной конфигурации, и имеется реаранжировка только у-цепи ТСК (ТСЯ-О) [13].
Диагноз Т-ЛБГЛ устанавливают на основании повышения в периферической крови показателей БГЛ с характерной морфологией и иммунофенотипом выше 2 X 109/л в течение более чем 6 мес без какой-либо причины [4, 11]. Однако на сегодняшний день нет единого мнения относительно того, какие значения БГЛ-лимфоцитоза достаточны для верификации диагноза Т-ЛБГЛ [11]. Считается, что реактивный БГЛ-лимфоцитоз не должен превышать 0,5 X 109/л, а для Т-ЛБГЛ характерно большее количество БГЛ. Если количество БГЛ в периферической крови превышает 2,0 X 109/л, диагноз Т-ЛБГЛ не вызывает сомнений [4].
В этой статье представлен собственный опыт дифференциальной диагностики БГЛ-лимфоцитоза, им-мунофенотипические и молекулярные аспекты верификации Т-ЛБГЛ и реактивного лимфоцитоза.
Цель работы —— оценить значение иммунофеноти-пирования методом проточной цитометрии и ПЦР-ис-следования Т-клеточной клональности в разграничении реактивной и опухолевой пролиферации БГЛ.
Материалы и методы
Проведен анализ основных клинико-лабораторных показателей у 68 пациентов с БГЛ-лимфоцитозом (20 мужчин и 48 женщин) в возрасте от 22 до 79 лет (медиана возраста 53 года), обратившихся в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России с 2010 по 2017 год.
Всем больным было выполнено цитологическое исследование мазка периферической крови, иммунофено-типирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии, исследование Т-клеточной клональности методом ПЦР по реаранжировкам генов у- и ß-цепей T-клеточного рецептора. БГЛ-лимфоци-тоз верифицировался при выявлении в лейкоцитарной формуле увеличенного количества БГЛ (более 10——15% мононуклеарных клеток или более 5% всех лейкоцитов) при наличии относительного и/или абсолютного лимфоцитоза по данным клинического анализа крови и иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии. Комплексное клинико-лабораторное обследование, в том числе исследование пунктата костного мозга, проводили при подозрении на Т-ЛБГЛ, ХЛПЗ-NK или другие заболевания кроветворной системы.
Иммунофенотипическое исследование образцов периферической крови и костного мозга выполняли методом многоцветной проточной цитометрии на FACS Canto II (Becton Dickinson, США) или проточном цитометре Navios (Beckman Coulter, США) c использованием реагентов производства Becton Dickinson, BeckmanCoulter и Dako. Диагностические панели включали CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD45, CD56, CD57, TCRaß, TCRyS.
Оценку T-клеточной клональности проводили по реаранжировкам генов у- и ß-цепей TCR (Vy-Jy и Vß-Jß, Dß-Jß). Для этого использовали метод мультиплексной ПЦР по протоколу BIOMED-2 [14] и последующий фрагментный анализ на секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CША). Флюоресценцию амплификатов и их профиль (распределение по длинам) оценивали при помощи компьютерной программы GeneMapper v. 4.0 (Applied Biosystems, США).
Ре зул ьтаты
На основании проведенного обследования пациентов с БГЛ-лимфоцитозом было выделено три группы: 1-я группа (n = 8) —— хроническое ХЛПЗ-NK; 2-я группа (n = 42) —— Т-ЛБГЛ; 3-я группа (n = 17) —— реактивный БГЛ-лимфоцитоз. У 1 больного наблюдалось развитие лимфомы Ходжкина на фоне Т-ЛБГЛ.
Среди 8 больных ХЛПЗ-МК было 5 мужчин и 3 женщины, медиана возраста —— 55,5 (37——69) года (табл. 1) Средние показатели лейкоцитов были 10,3 (2,7—18,6) х 109/л, нейтрофилов — 2,78 (1,03 — 5,72) х 109/л, лимфоцитов — 6,8 (1,4 — 13,3) х 109/л, гемоглобина —— 135 (86——160) г/л, тромбоцитов —— 282 (161——383) х 109/л. Среднее содержание лимфо-
цитов составило 63 (50——79)%, нейтрофилов —— 29 (19—40)%.
В большинстве случаев размер селезенки оставался в пределах нормы, и только у 1 больного продольный размер превышал 12 см.
При иммунофенотипировании лимфоцитов периферической крови была выявлена лимфоидная популяция
Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с БГЛ-лимфоцитозом Table 1. Clinico-laboratory characteristics of patients with LGL lymphocytosis
Параметр Parameter ХЛПЗ-NK, n = 8 CLPD-NK, n = 8 Т-ЛБГЛ, n = 42 T-LGL, n = 42 Реактивный БГЛ - лимфоцитоз, n = 17 Reactive LGL lymphocytosis, n = 17
Соотношение м/ж Ratio m/f 5/3 9/33 5/12
Медиана возраста Median age 55,5 (37—69) 57 (29—79) 48 (22—77)
Лейкоциты, x 109/л Leukocytes, x ]09/l 10,3 (2,7—18,6) 8,8 (1,8—51,1) 5,4 (1,2—10,7)
Гемоглобин, г/л Hemoglobin, g/l 135 (86—160) 111 (66—160) 119 (53 — 161)
Тромбоциты, x 109/л Platelets, x ]09/l 282 (161—383) 217 (19—459) 217 (6—342)
Нейтрофилы, x 109/л Neutrophils, x ]09/l 2,8 (1,03—5,72) 1,5 (0—8,5) 1,9 (0—8,5)
Нейтрофилы, % Neutrophils, % 29 (19—40) 19 (1—55) 32 (3—49)
Лимфоциты, x 109/л Lymphocytes, x ]09/l 6,8 (1,4—13,3) 6,8 (1,2—49,1) 2,4 (1,2—7)
Лимфоциты, % Lymphocytes, % 63 (50—79) 73 (38—96) 60,5 (45—96)
Гетерогенность экспрессии Т-клеточных маркеров Heterogeneity of expression of T-cell markers 2 из 8 2 of 8 34 (85%) из 40 34 (85%) of 40 8 (47,1%) из 17 8 (47,1%) of 17
Варианты БГЛ - лимфоцитоза Variants of LGL lymphocytosys n TCRG (Vy-JY) TCRB (DP-JP) TCRB (VP-JP) TCRB (DP-JP и/или VP-JP) TCRB (DP-JP and/or P-JP)
ХЛПЗ-NK CLPD-NK 8 0 0 0 0
T-ЛБГЛ T-LGL 42 36 (85,7%) 22 (52,4%) 33 (78,6%) 37 (88,1%)
TCRaP-вариант T-ЛБГЛ TCRafi-positive T-LGL 30 25 (83,3%) 17 (56,7%) 29 (96,7%) 30 (100%)
TCRyS-вариант T-ЛБГЛ TCRyS-positive T-LGL 12 11 (91,7%) 5 (41,7%) 4 (33,3%) 7 (58,3%)
Реактивный БГЛ - лимфоцитоз Reactive LGL lymphocytosis 17 3 (176%) 1 (5,9%) 0 1 (5,9%)
Таблица 2. ПЦР-исследование Т-клеточной клональности у пациентов с ХЛПЗ-NK, T-ЛБГЛ и реактивным БГЛ -лимфоцитозом Table 2. PCR studies of T-cell clonality in patients with CLPD-NK, T-LGL and reactive LGL lymphocytosis
с фенотипом СО3-СО4-СО8±СО16+СО56±, гетерогенность экспрессии маркера СО7 наблюдалась у 2 больных. Среднее содержание КК-клеток составило 60,9 (26,6-—89,7)% общего количества лимфоцитов, среднее абсолютное содержание — 4,091 (0,805—7,740) х 109/л. При исследовании Т-клеточной клональности по реа-ранжировкам генов у- и Р-цепей ТСК (Уу-Лу и УР-ЛР, ОР-ЛР) ни у кого не выявлено клональных перестроек генов цепей Т-клеточного рецептора (табл. 2).
Диагноз Т-ЛБГЛ был установлен у 42 больных (9 мужчин и 33 женщин) в возрасте от 29 до 79 лет (медиана возраста 57 лет) (см. табл. 1), во всех случаях БГЛ-лимфоцитоз сохранялся более 6 мес без какой-либо известной причины. Увеличение продольного размера селезенки более 12 см наблюдалось у 17 (40,5%) из 42 больных.
Средние показатели гемоглобина -— 111 (66-—160) г/л, лейкоцитов ■— 8,8 (1,8——51,1) х 109/л, тромбоцитов ■— 217 (19—459) х 109/л, нейтрофилов — 1,46 (0—8,5) х 109/л , лимфоцитов —— 6,8 (1,2—49, 1) х 109/л; содержание лимфоцитов —— 73 (38——96)%, нейтрофилов —— 19 (1——55)%.
Показания к началу иммуносупрессивной терапии (снижение гемоглобина менее 100 г/л, и/или гранулоци-топения менее 0,5 х 109/л, и/или тромбоцитопения менее 50 х 109/л) были отмечены у 20 (47,6%) из 42 больных.
При иммунофенотипировании лимфоцитов периферической крови аР-вариант Т-ЛБГЛ был установлен у 30 (71,4%) из 42 больных, у5-вариант —— у 12 (28,6%). Были выделены следующие варианты иммунофенотипа: СО3+СО4СО8+СО16СО56- — у 13 (43,4%), СО3+СО4-СО8+ с экспрессией СО16 и/ или СО56 — у 9 (30%), СО3+СО4+СО8- с вариабельной экспрессией СО16 и СО56 —— у 4 (13,3%), СО3+СО4+СО8+ с вариабельной экспрессией СО16 и СО56 —— у 4 (13,3%) из 30 больных аР-вариантом Т-ЛБГЛ. У 12 больных у5-вариантом Т-ЛБГЛ опухолевые клетки характеризовались СО3+СО4-им-мунофенотипом, экспрессия маркеров СО8, СО16, СО56 была вариабельной. Дубль-негативный вариант (СО3+СО4-СО8-) Т-ЛБГЛ был определен у 5 больных. Относительные и абсолютные показатели опухолевой БГЛ-популяции представлены в табл. 3.
Таблица 3. Средние относительные и абсолютные показатели опухолевой популяции при Т-ЛБГЛ Table 3. The mean relative and absolute values of the tumor population with T-LGL (flow cytometry)
Варианты иммунофенотипа Т-ЛБГЛ Variants of immunophenotype T-LGL n Средние относительные и абсолютные показатели опухолевой БГЛ-популяции в ПК (данные ПЦ) The mean relative and absolute values of the tumor population with T-LGL in PB (flow cytometry) Референсные значения* Т-лимфоцитов с соответствующим иммунофенотипом в ПК The reference values* of T-lymphocytes with the corresponding immunophenotype (flow cytometry)
% x 109/ л X 109/l % x 109/ л X 109/l
a ß CD3+CD4-CD8+ CD16-CD56- 13 63,5 (33,4—85,2) 4,4 (0,2—28,5) 19—27 0,3—0,8
CD3+CD4-CD8+ CD16+ и/или CD56+ CD3+CD4-CD8+ CD16+ and/or CD56+ 9 69,2 (172—86,5) 4,0 (0,22—8) 0,5—6 0,007—0,165
CD3+CD4+CD8-с вариабельной экспрессией CD16 и CD56 CD3+CD4+CD8-with variable expression CD16 and CD56 4 90,3 (82,3—98) 15,5 (2,8—35,9) 33—55 0,576—1,336
CD3+CD4+CD8+ с вариабельной экспрессией CD16 и CD56 CD3+CD4+CD8+ with variable expression CD16 and CD56 4 38,7 (14—65,5) 1,9 (0,4—3,4) 0—3 —
Y S CD3+CD4-CD8±CD16±CD56± 12 571 (22,9—88,1) 3,9 (0,4—18,2) 1,8—74 0,22—0,115
ПК — периферическая кровь, ПЦ — проточная цитометрия, * — референсные значения относительного и абсолютного количества основных популяций Т-лимфоцитов в ПК представлены в работе Хайдукова С. В. и Байдун Л. В. [15].
PB — peripheral blood, * — reference values of the relative and absolute number of subpopulalions of T-lymphocyles in the PB are presented in the work, of S. V. Khaydukov and L. V. Baidun [15].
Таблица 4. Характеристика больных с реактивным БГЛ-лимфоцитозом Table 4. Characteristics of patients with reactive LGL lymphocytosis
Пол/ Заболевание, Срок разрешения ИФТ Гетерогенность TCRG(Vy-Jy) TCRB(DP-JP) TCRB (VP-JP) TCRB (Dp-jp
Возраст сопровождающееся реактивным БГЛ - лимфоцитоза, Immunophenotype экспрессии Т-клеточ- и/ или
Gender/ БГЛ-лимфоцитозом мес ных маркеров vp-jp)
age Disease accompanied by reactive The term of Heterogeneity of TCRB (Dp-jp
LGL lymphocytosis resolution of LGL expression of T-cell and/ or
lymphocytosis, mos markers vp-jp]
ж/22 f/22 нет no 4 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no поли poly поли poly поли poly поли poly
ж/48 f/48 нет no 6 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no поли poly поли poly поли poly поли poly
ж/46 f/46 нет no 5 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no поли poly поли poly поли poly поли poly
M/31 m/31 нет no 7 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56+ нет no поли poly поли poly поли poly поли poly
ж/39 f/39 нет no 8 CD3+CD4- CD8+CD16-CD56-& CD3+CD4-CD8-CD16+CD56+ CD2, CD5, CD7 поли poly поли poly поли poly поли poly
ж/52 f/52 нет no 3 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- CD5, CD7 сомн dub моно mono поли poly моно mono
ж/52 f/52 нет no 4 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no поли poly поли poly поли poly поли poly
ж/63 f/63 нет no 5 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no поли poly сомн dub поли poly сомн dub
ж/57 f/57 нет no 5 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56+ CD3, CD5, CD7 сомн dub поли poly поли poly поли poly
m/26 m/26 через 7 лет после алло-ТКМ по поводу рецидива АККЛ, ALK+ 7 years after allo-HSCT for recurrence of ALCL, ALK + 4 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- нет no сомн dub поли poly поли poly поли poly
ж/66 f/66 через 1,5 мес после лечебно-диагностической спленэктомии (ДВККЛ селезенки, богатая гистиоцитами) 1,5 months after the treatment-diagnostic splenectomy (THRLBCL of spleen) 8 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56- CD2, CD5, CD7 поли poly поли poly поли poly поли poly
M/24 m/24 Дебют экстранодальной NK/T-лимфомы, назальный тип Extranodal NK/T-lymphoma, nasal type 2 CD3+CD4-CD8+CD16-CD56+ CD5, CD7 поли poly поли poly поли poly поли poly
О m О ь
X
о
¡5
LO
О
са са
I 1 J < ?
оо со с е
и и
0 о
1 s
о О
S Е
0 | £ и
1 Т (D О ^ 2 I I- * с ° <и
ü J а « С J<
¡5 I 5 о
В Î 2 8£
(D щ К <U <U
a <u
ф X
6 5
а U £
о+ Û
û и
û
U
о о
а и Е х ж
^ ( ] I О 1= ш и
X -с
а. -1=
à
^ to О с О. ш
i 1 <В "о
Ü ¡3 ? 1
1«
и
TS 0
J
ü -Ï vo -а о .о
? О ^ m но L s 0
f GLL m
<D H 3 s of f si
® ? ро ам мес m r te o n io to
a. ^ e lut o
* ^ о- ehT ol s h p
er m
ly
м e
ы
н cû и a
т м r\ s
0 Р
- 1- "О ^
5. о fr ? С О
■Ш
1 i I
■ I u
"F оО
Lü
S
si
' со ?
H 2 vo v а
/ а ee
О m с о COO са О
¡4
6 5
û
U <)
о+ а û U
û
и
LÜ
S
, со ? ^
н 2
VO V
а
чэ
0 о
1 S
о о
S Е
8
а
и
5,
а
U
o
6 5
а
4и
и £ ïo а
а и
а
и
4
CS uô S
, CO ?
H 2 vo v а
00 со
»
И
о -о
8
û
и
К-Û и
5,
а
и
3,
а
и
o
6 5
а
4и
и £
Ï0 Q
û U ^
û
и
6
CS uô S
' со ? ^
H 2 vo v а
о о
Ю ЧЭ
И
P тз
и
P "О
0 о
1 s
о О
S Е
o
6 5
û
SV
U £
o+ Û û U
û
U
es uô S
, СО
y Q ? ^
I-2 vo v а
ю
о % а о
0
1
s Ü a
ü
0 &
с !È
1 œ
0 (
1 (
S " р
о =
® о
* ^
и Ï
g I
^ Ï
+ ID
< ï
^^ §
< t
, л
а \о
S s
0 S -fr "
1 ^
о а
® iL
g Ф
0 а -
1 о =
х -Й-
И ï _
0 LÛ
jE S ■
a s
ï О
1 I 5
Г" ®
i it:
El Г i ^ ^ i а ii i)
и -6
ï 8 S £
s id
п
u et S
о.
СЛ с
а £
Гетерогенность экспрессии хотя бы одного из Т-кле-точных маркеров СО2, СО5, СО7 была отмечена в 34 (85%) из 40 оцененных случаев.
При исследовании Т-клеточной клональности по реаранжировкам генов у- и Р-цепей ТСК (Уу-Лу и УР~ Лр, ОР-ЛР) в 41 (97,6%) из 42 случаев были выявлены перестройки генов либо ТСКО, либо ТСКВ, лишь в одном случае у5-варианта Т-ЛБГЛ наблюдались реаран-жировки генов только 5-цепи ТСК (см. табл. 2).
У 17 больных БГЛ-лимфоцитоз имел реактивный характер, со временем относительные и/или абсолютные показатели БГЛ нормализовались. Соотношение мужчин и женщин — 5/12, медиана возраста — 48 (22——77) лет (см. табл. 1).
Среднее содержание лейкоцитов было 5,4 (1,2—— 10,7) х 109/л, нейтрофилов — 1,9 (0 — 8,5) х 109/л, лимфоцитов —— 2,4 (1,2——7,0) х 109/л, гемоглобина —— 119 (53 — 161) г/л, тромбоцитов — 217 (6—342) х 109/л. Среднее процентное содержание лимфоцитов составило 60,5 (45—96)%, нейтрофилов — 31,8 (3—49)%.
В 11 из 17 случаев реактивный БГЛ-лимфоцитоз был представлен популяцией цитотоксических лимфоцитов (СБ3+СБ4-СО8+СО16-СО56-), в 7 — ККТ-лимфоцитами (СО3+СО4-СО8+ с экспрессией СО16 и/ или СО56), причем у одной больной был отмечен реактивный БГЛ-лимфоцитоз за счет обеих популяций. В 8 (47,1%) из 17 случаев наблюдалась гетерогенность экспрессии хотя бы одного Т-клеточного маркера (СО2, СО3, СО5, СО7, СО8). В 5 из 17 случаев повышение относительного и абсолютного содержания БГЛ-лимфоцитов было значимым и превышало верхнюю границу нормы более чем в 2 раза.
При исследовании Т-клеточной клональности по реаранжировкам генов ТСКО (Уу-Лу) и ТСКБ (УР-ЛР, ОР-ЛР) перестройки генов у-цепи Т-клеточного рецептора были выявлены в 3 случаях, еще в 5 случаях результат носил сомнительный характер. Неполная реаранжировка генов ТСКВ (ОР-ЛР) была определена только в одном случае, тогда как ни в одном случае реактивного БГЛ-лимфоцитоза не было выявлено полной реаранжировки генов ТСКВ (УР-ЛР) (см. табл. 2).
Интересно, что у 7 из 17 больных этой группы реактивный БГЛ-лимфоцитоз был выявлен на фоне опухолевых заболеваний кроветворной системы (табл. 4).
Проведенное комплексное обследование, включающее морфологическое, цитогенетическое и молекулярное исследования костного мозга, позволило верифицировать диагноз. Различия иммунофеноти-пических маркеров опухолевых клеток и реактивных цитотоксических ККТ-лимфоцитов позволили исключить лейкемизацию опухолевого процесса у больного экстранодальной КК/Т-лимфомой. У больной В-крупноклеточной лимфомой селезенки, богатой гистиоцитами, реактивный БГЛ-лимфоцитоз наблюдался через полтора месяца после спленэктомии. В гемограмме количество лейкоцитов было 8,3 х 109/л,
лимфоцитоз до 70%, причем 59% лимфоцитов содержали крупные азурофильные гранулы. Иммунофеноти-пическое исследование лимфоцитов периферической крови выявило увеличение абсолютного числа цито-токсических Т-лимфоцитов (CD3+CD4CD8+CD16-CD56 ) с гетерогенностью экспрессии маркеров CD2, CD5 и CD7; В-лимфоциты были поликлональны. Молекулярное исследование образца периферической крови не выявило реаранжировок генов TCRG и TCRB. После завершения терапии по поводу В-клеточной лимфомы селезенки при повторном цитологическом и иммунофенотипическом исследованиях лимфоцитов периферической крови (через 8 мес) было отмечено уменьшение лейкоцитоза до 4,9 X 109/л, процентного содержания лимфоцитов —— до 46% и БГЛ —— до 28%. У остальных 5 больных при дополнительном обследовании был верифицирован диагноз миелодиспласти-ческого синдрома. Морфологическое исследование костного мозга выявило признаки дисмиелопоэза, в миелограмме отмечено увеличение количества бласт-ных клеток. При иммунофенотипировании лимфоцитов периферической крови в 2 из 5 случаев было выявлено преобладание популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD4CD8+CD16CD56), в 3 случаях —— NKT-лимфоцитов (CD3+CD4CD8+ с экспрессией CD16 и/или CD56) с гетерогенной экспрессией Т-клеточных маркеров CD2, CD3, CD5, CD7 и CD8. При молекулярном исследовании образцов периферической крови у 3 из 5 больных с реактивным БГЛ-лимфоцитозом на фоне миелодиспластического синдрома была выявлена Т-клеточная клональность по перестройкам генов TCRG, тогда как перестройки генов TCRB не были обнаружены ни в одном из случаев. У одного больного наблюдали развитие лимфо-мы Ходжкина на фоне CD4-позитивной Т-клеточной лимфопролиферации, протекающей с аплазией кроветворения. Т-ЛБГЛ дебютировал с анемии (Hb 54 г/л), тромбоцитопении менее 50 X 109/л и лейкопении менее 2,4 X 109/л. В лейкоцитарной формуле был отмечен лимфоцитоз 92%. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови выявило CD3+CD4+CD8CD16-CD56-TCRaP+-популяцию лимфоидных клеток. При молекулярном исследовании Т-клеточной клонально-сти в образцах крови и костного мозга были определены перестройки генов TCRG и TCRB. Больному была начата иммуносупрессивная терапия циклоспорином. Через 9 мес с момента манифестации заболевания было обнаружено увеличение размеров печени и селезенки, периферических и висцеральных лимфатических узлов. Размер конгломерата медиастинальных лимфатических узлов составлял 69 X 24 мм. При гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях биоптата внутригрудного лимфатического узла был верифицирован диагноз лимфомы Ходжкина, ассоциированной с вирусом Эпштейна——Барр. При молекулярном исследовании Т-клеточной клональности
в биоптатах селезенки и лимфатического узла были выявлены те же клональные продукты, что в образцах крови и костного мозга.
Обсуждение
На большом клиническом материале представлен опыт дифференциальной диагностики БГЛ-лимфоци-тоза. Было продемонстрировано, что БГЛ-лимфоцитоз может быть проявлением ХЛПЗ-КК, Т-ЛБГЛ и реактивного процесса.
Т-ЛБГЛ развивается в результате накопления он-когенных мутаций в реактивных БГЛ [16]. Поликло-нальный иммунный ответ, сопровождающийся хронической антигенной стимуляцией цитотоксических Т-лимфоцитов на эндогенный или экзогенный антиген, служит первоначальным стимулом к экспансии одного из клонов БГЛ [17, 18]. Моноклональный БГЛ-лимфоцитоз на первых этапах протекает индолен-тно, но в дальнейшем в 60-—70% случаев сменяется агрессивным клиническим течением с развитием ци-топенического синдрома и связанных с ним осложнений [19].
Верификация Т-ЛБГЛ и дифференциальная диагностика БГЛ-лимфоцитоза представляет определенные трудности. В настоящее время не выявлены па-тогномоничные хромосомные аномалии, характерные иммунофенотипические маркеры и отличительные морфологические признаки, обнаружение которых позволяет безошибочно установить диагноз Т-ЛБГЛ.
Морф ологическое и иммунофенотипическое исследования со стандартной панелью моноклональ-ных антител позволяют лишь констатировать факт относительного и/или абсолютного БГЛ-лимфоцито-за, который имеет опосредованное значение. В ряде случаев реактивного БГЛ-лимфоцитоза мы наблюдали значительное увеличение популяции цитоток-сических лимфоцитов. В то же время при Т-ЛБГЛ, протекающем с лейкопенией, выявляли относительный БГЛ-лимфоцитоз при абсолютной лимфопении. Относительное и абсолютное количества опухолевых БГЛ различались в зависимости от варианта иммунофенотипа, однако небольшое число случаев с 003+004+008+ и 003+004+008- не позволило нам провести статистический анализ. Гетерогенность экспрессии Т-клеточных маркеров не является пато-гномоничным признаком опухолевого процесса [10]. В нашем исследовании наблюдалась гетерогенность экспрессии Т-клеточных маркеров (002, 005, 007, 008) при ХЛПЗ-КК, реактивном БГЛ-лимфоцитозе и Т-ЛБГЛ, хотя, несомненно, снижение или отсутствие экспрессии Т-клеточных маркеров при Т-ЛБГЛ встречалось с большей частотой. Моноклональность Т-лимфоцитов по перестройкам генов ТСКО также не является однозначным доказательством опухолевого процесса [20, 21]. При нормальном иммунном ответе на инфекционный агент или на опухолевый процесс
при аутоиммунных процессах может появляться мо-ноклональная популяция цитотоксических лимфоцитов. Например, при инфекционном мононуклео-зе у 40% пациентов выявляется моноклональная по реаранжировкам генов ТСКО популяция лимфоцитов [22]. При аутоиммунной гемолитической анемии до 50% пациентов имеют моноклональную картину реаранжировок генов ТСКО и клональную экспансию 008+ лимфоцитов [23]. Выявление Т-клеточной клональности лимфоцитов возможно при выраженной реакции «трансплантат против хозяина» [24]. В то же время описаны редкие случаи развития Т-ЛБГЛ после аутологичной и аллогенной трансплантаций [25, 26], которые должны быть отграничены от олигоклональных Т-клеточных популяций, часто наблюдаемых у реципиентов гемопоэтических клеток [24]. Клональная популяция Т-лимфоцитов может определяться даже у здоровых доноров без признаков каких-либо заболеваний [27].
Моноклональный реактивный БГЛ-лимфоцитоз может наблюдаться при опухолевых процессах и маскировать основное заболевание. Например, в исследуемой нами группе больных среди 17 случаев реактивного цитотоксического лимфоцитоза у 7 пациентов были выявлены другие опухолевые гематологические заболевания.
При анализе реаранжировок генов ТСКО и ТСКВ в образцах периферической крови мы получили интересные данные. Оказалось, что наиболее специфичными маркерами для разграничения Т-ЛБГЛ и реактивного БГЛ-лимфоцитоза является одновременное выявление моноклональности по ТСКО и ТСКВ-локусам или выявление полной моноклональной реаранжировки гена ТСКВ (УР-ЛР). Эти события не были выявлены ни в одном из случаев реактивного цитотоксического лим-фоцитоза.
Отсутствие опухолевых и ревматических заболеваний, клинически значимой вирусной инфекции, В-симптомов, снижения концентрации гемоглобина, числа тромбоцитов и гранулоцитов позволяет проводить динамическое наблюдение за больным с БГЛ-лимфоцитозом. Лечение Т-ЛБГЛ назначается только при наличии строгих показаний. По данным литературы, при диагностике заболевания две трети больных не нуждаются в лечении [12, 18].
Таким образом, выявление БГЛ-лимфоцитоза в периферической крови не дает основаниий для верификации Т-ЛБГЛ, а лишь служит поводом для полного обследования с целью исключения заболеваний и состояний, которые могут сопровождаться пролиферацией БГЛ.
На большом клиническом материале была продемонстрирована дифференциальная диагностика БГЛ-лимфоцитоза, представлены иммунофенотипические и молекулярные аспекты разграничения опухолевой и реактивной пролиферации больших гранулярных лимфоцитов.
Информация об авторах
Чернова Наталья Геннадьевна (Chernovа N. G.), к. м. н., врач-гематолог отделения интенсивной высокодозной химиотерапии лимфом с круглосуточным и дневным стационаром ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, ngchernova@mail.ru
Сидорова Юлия Владимировна (Sidorova Y. V.), к. м. н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, iouliavl@rambler.ru
Захарько Екатерина Игоревна (Zakharko E. I.), врач централизованной клинико-диагностической лаборатории, руководитель группы проточной цитометрии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, flowlabgnc@gmail.com
Наумова Елена Владимировна (Naumova E. V.), к. м. н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики ФГБУЗ ДПО РМАНПО МЗ РФ, e_naum@mail.ru
Рыжикова Наталья Валерьевна (Ryzhikova N. V.), научный сотрудник лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, nataly25-76@mail.ru
Гальцева Ирина Владимировна (Galtseva I. V.), к. м. н., заведующая научно-клинической лабораторией иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга, ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, irag@blood.ru
Двирнык Валентина Николаевна (Dvirnyk V. к. м. н., заведующая централизованной клинико-диагностической лабораторией, ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, vdvirnyk@mail.ru
Смирнова Светлана Юрьевна (Smirnova S. Yu.), научный сотрудник лаборатории молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, smirnova-s-ju@yandex.ru
Судариков Андрей Борисович (Sudarikov A. B.), д. б. н., заведующий лабораторией молекулярной гематологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, dusha@blood.ru
Кохно Алина Владимировна (Kokhno A. V.), к. м. н., ведущий научный сотрудник отделения интенсивной высокодозной химиотерапии гемобла-стозов и депрессий кроветворения с круглосуточным и дневным стационаром ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, alina@blood.ru
Моисеева Татьяна Николаевна (Moiseeva Т к. м. н., заведующая консультативным гематологическим отделением с дневным стационаром по проведению интенсивной и высокодозной химиотерапиии ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, taniamoiseeva@mail.ru
Луговская Светлана Алексеевна (Lugovskaya S. A.), д. м. н., профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ФГБУЗ ДПО РМАНПО МЗ РФ, slugovskaya@mail.ru
Звонков Евгений Евгеньевич (Zvonkov E. E.), д. м. н., заведующий отделением интенсивной высокодозной химиотерапии лимфом с кругло-
суточным и дневным стационаром ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, dr.zvonkov@gmail.com
Савченко Валерий Григорьевич (Savchenko V. G.), академик РАН, генеральный директор ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, director@blood.ru
Литература
6. Виноградова Ю. Е., Луценко И. Н., Кременецкая А. М. и др. Структура T/NK-клеточных лимфатических опухолей в Гематологическом научном центре РАМН. Проблемы гематологии и переливания крови. 2005; 4:30—34.
12. Виноградова Ю. Е., Луценко И. Н., Самойлова Р. С. и др. Клинические и иммуноморфологические варианты T/NK-клеточных лимфо-лейкозов из больших гранулярных лимфоцитов. Гематология и транс-фузиология. 2009; 54(2):14—18.
15. Хайдуков С. В., Байдун Л. В. Современные подходы к оценке клеточной составляющей иммунного статуса. Медицинский алфавит. 2015; 2(8):44—51.
16. Воробьев А. И., Воробьев И. А., Грецов Е. М. и др. Вопросы теоретической гематологии. Терапевтический архив. 2003; 75(9):22 — 29. 22. Сидорова Ю. В., Никитин Е. А., Меликян А. Л. и др. Определение T-клеточной клональности при инфекционном мононуклеозе методом ПЦР-SSCP-TCR у. Гематология и трансфузиология 2004; 49(6):1—7 Остальные источники см. в References.
References
1. Loughran T. P. Jr. Clonal diseases of large granular lymphocytes. Blood. 1993; 82(1):1 —14.
2. Sokol L., Loughran T. P. Jr. Large granular lymphocyte leukemia. Oncologist. 2006; 11(3):263—273. DOI: 10.1007/s11899-007-0038-7
3. Lamy T., Loughran T. P. Jr. Large granular lymphocyte leukemia. Cancer Control. 1998; 5(1):25—33.
4. Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L. et al. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC; 2017 348—350.
5. Zambello R., Trentin L., Facco M. et al. Analysis of the T cell receptor in the lymphoproliferative disease of granular lymphocytes: superantigen activation of clonal CD3+ granular lymphocytes. Cancer Res. 1995; 55(24):6140—6145.
6. Vinogradova Yu. E., Lutsenko I. N., Kremenetskaya A. M. et al. Structure of T/NK-cell lymphomas in the National Research Center for Hematology of the Russian Academy of Medical Sciences. Russian Journal of Problems of Hematology and Blood Transfusion (Problemy gematologii i perelivaniya krovi). 2005; 50(4):30—34. (In Russian)
7 Lamy T., Loughran T. P. Jr. Clinical features of large granular lymphocyte leukemia. Semin Hematol. 2003; 40(3):185—195.
8. Sampalo Lainz A., Lopez-Gomez M., Jimenez-Alonso J. Proliferation of large granular lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Rev Clin Esp. 1995; 195(6):373 — 379.
9. Starkebaum G. Chronic neutropenia associated with autoimmune disease. Semin Hematol. 2002; 39(2):121 — 127
10. Morice W. G., Kurtin P. J., Leibson P. J. et al. Demonstration of aberrant T-cell and natural killer-cell antigen expression in all cases of granular lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 2003; 120(6):1026—1036.
11. Semenzato G., Zambello R., Starkebaum G. et al. The lymphoproliferative disease of granular lymphocytes: updated criteria for diagnosis. Blood. 1997; 89(1):256—260.
12. Vinogradova Yu. E., Lutsenko I. N., Samoylova R. S. et al. Clinical and immunomorphological variants of large granular lymphocyte T/NK lymphocytic leukemia. Russian Journal of Hematology and Transfusiology (Gematologiya i transfuziologiya). 2009; 54(2):14—18. (In Russian)
13. Vie H., Chevalier S., Garand R. et al. Clonal expansion of lymphocytes bearing the gamma delta T-cell receptor in a patient with large granular lymphocyte disorder. Blood. 1989; 74(1):285—290.
14. Dongen J. J., Langerak A. W., Bruggemann M. et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproli-ferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 2003; 17(12):2257—2317. DOI: 10.1038/sj.leu.2403202.
15. Khaydukov S. V., Baydun L. V. Modern approach to assessing cellular constituents immune status. Russian Journal of Medical Alphabet. (Meditsinskiy alfavit). 2015; 2(8):44—51. (In Russian)
16. Vorobiev A. I., Vorobiev I. A., Gretsov E. M. et al. Problems of the theoretical hematology. Russian Journal of Therapeutic Archive (Terapevticheskiy arkhiv). 2003; 75(9):22—29. (In Russian)
17 O'Keefe C. L., Plasilova M., Wlodarski M. et al. Molecular analysis of TCR clonotypes in LGL:a clonal model for polyclonal responses. J Immunol. 2004; 172(3):1960—1969.
18. Wlodarski M. W., O'Keefe C., Howe E. C. et al. Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses: nonrandom nature of the T-cell-receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia. Blood. 2005; 106(8):2769—2780. DOI: 10.1182/blood-2004-10-4045.
19. Pandolfi F., Loughran T. P. Jr., Starkebaum G. et al. Clinical course and prognosis of the lymphoproliferative disease of granular lymphocytes. A multicenter study. Cancer. 1990; 65(2):341—348.
20. Sidorova Yu. V., Chernova N. G., Ryzhikova N. V. et al. Clonal rearrangements and malignant clones in peripheral T-cell lymphoma. Acta Naturae (English version). 2015; 7(3):116—125.
21. Smirnova S., Sidorova Y., Chernova N. et al. CD8+ T-cell clones persistent in bone marrow and peripheral blood during course of CD4+ angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Haematologica. 2017; 102(1):578, E1403.
22. Sidorova Yu. V., Nikitin E. A., Melikyan A. L. et al. Use of PCR-SSCP-TCR y method to determine T-cell clonality in infectious mononucleosis. Russian Journal of Hematology and Transfusiology (Gematologiya i transfuziologiya). 2004; 49(6):1—7 (In Russian)
23. Smirnova S. J., Sidorova J. V., Biderman B. V. et al. Expansion of CD8+ cells in autoimmune hemolytic anemia. Autoimmunity. 2016; 49(3):147— 154. DOI: 10.3109/08916934.2016.1138219.
24. French L.E., Alcindor T., Shapiro M. et al. Identification of amplified clonal T cell populations in the blood of patients with chronic graft-versus-host disease:positive correlation with response to photopheresis. Bone Marrow Transplant. 2002; 30(8):509—515. DOI: 10.1038/ sj.bmt.1703705.
25. Narumi H., Kojima K., Matsuo Y. et al. T-cell large granular lymphocytic leukemia occurring after autologous peripheral blood stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant. 2004; 33(1):99—101. DOI: 10.1038/sj.bmt.1704298.
26. Au W. Y., Lam C. C., Lie A. K. et al. T-cell large granular lymphocyte leukemia of donor origin after allogeneic bone marrow transplantation. Am J Clin Pathol 2003; 120(4):626—630. DOI: 10.1309/VA75-5A03-PVRV-9XDT. 27 Sychevskaya K. A., Smirnova S., Sidorova J. et al. Clonal T-lymphocyte populations in healthy donors. Blood. 2017; 130(1):3598.
