CC BY
31
ORIGINAL RESEARCH
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
DOI: https://doi.oig/10.36233/0507-4088-76 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Противовирусная активность комплексного германийорганического соединения ацикловира в системах in vitro и in vivo в отношении вируса простого герпеса (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2)
Алимбарова Л.М.1, Амбросов И.В.2, Матело С.К.2, Баринский И.Ф.
1ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия; 2ООО «ВДС Фарма», 123592, Москва, Россия
Введение. Значительный рост заболеваемости различными формами герпесвирусной инфекции (ГВИ) диктует необходимость поиска новых подходов к модификации одного из базовых противовирусных препаратов ацикловира (АЦВ) (Aciclovir; ACV) и его лекарственных форм с целью улучшения их биофармацевтических характеристик и повышения эффективности терапии. Одним из перспективных в данном аспекте является комплексное германийорганическое соединение ацикловира (КГОСА).
Цель исследования - изучение противовирусной активности КГОСА в отношении вируса простого герпеса (ВПГ) (герпесвируса человека, ГВЧ) (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2) на моделях ГВИ in vitro и in vivo.
Материал и методы. С использованием вирусологического и статистического методов изучена активность КГОСА в лечебной схеме в отношении ВПГ 1 типа (ВПГ-1) (ГВЧ-1) (штамм «Кл»), ВПГ-2 (ГВЧ-2) (штамм «ВН») на моделях ГВИ in vitro на культуре клеток Vero и генитального герпеса (ГГ), вызванного ВПГ-2 (штамм «ВН»), у самцов морских свинок (Canis porcellus).
Результаты и обсуждение. Установлено, что КГОСА ингибирует репликацию ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках Vero. На модели ГГ у инфицированных животных препарат также обладает анти-ВПГ-активностью, приводящей к уменьшению выраженности симптоматики, тяжести и продолжительности заболевания, интенсивности и длительности выделения вируса. Наиболее выраженная активность соединения выявлена при применении в виде геля 3% местно 5 раз в день в течение 5 сут на ранних сроках после заражения. Отсроченное использование КГОСА (через 48 ч после инфицирования) также демонстрировало статистически значимую эффективность, сравнимую с таковой коммерческих референс-препаратов, в т.ч. содержащих АЦВ или его пролекарства: ацикловир (крем 5%), АИЛ (ацикловир+интерферон альфа-2Ь+лидокаин, мазь 3%), пенци-кловир (крем 1%). КГОСА значимо снижал выраженность симптомов ГГ, уменьшал период вирусовыделе-ния, а также инфекционную активность возбудителя по сравнению с этими параметрами у животных группы контроля и особей, получавших плацебо. Активность препарата, по-видимому, обусловлена его улучшенными биофармацевтическими характеристиками относительно АЦВ, а также наличием ряда биологических активностей у входящих в его состав компонентов.
Заключение. Результаты исследования позволяют рассматривать КГОСА как основу для разработки терапевтических средств для ГВИ, обладающих противовирусной активностью.
Ключевые слова: вирус простого герпеса; герпесвирусная инфекция; генитальный герпес; комплексное германийорганическое соединение ацикловира; противовирусная активность; морские свинки
Для цитирования: Алимбарова Л.М., Амбросов И.В., Матело С.К.,| Баринский И|ф|| Противовирусная активность комплексного германийорганического соединения ацикловира в системах in vitro и in vivo в отношении вируса простого герпеса (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2). Вопросы вирусологии. 2021; 66(5): 368-382. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-76
Для корреспонденции: Алимбарова Людмила Михайловна, канд. мед. наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории сравнительной вирусологии с Российским центром по герпесу ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия. E-mail: virology@mail.ru
Участие авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Финансирование. Исследование проведено за счёт государственного бюджета.
Конфликт интересов. Для исследования субстанция предоставлена ООО «ВДС Фарма» (резидент Биомедицинского кластера Инновационного центра «Сколково»); в состав авторов входят сотрудники фирмы. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом организации (Протокол № 2/1 от 04.02.2016).
Поступила 17.08.2021 Принята в печать 07.10 2021 Опубликована 31.10.2021
ORIGINAL ARTICLE
DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-76
Antiviral activity of the organic germanium complex with aciclovir against herpes simplex virus (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2) in the in vitro and in vivo systems
Ludmila M. Alimbarova1, Igor' V. Ambrosov2, Svetlana K. Matelo2,
1FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow, Russia; 2«VDS Pharma» LLC, 123592, Moscow, Russia
Introduction. A significant increase in the incidence of various forms of herpesvirus infection (HVI) determines the need to search for new approaches to the modification of one of the basic antiviral drugs aciclovir (ACV) and its dosage forms to improve their biopharmaceutical characteristics and increase the effectiveness of therapy. In this aspect, an innovative organic germanium complex with aciclovir (OGCA) is promising.
The aim of the study was to assess the antiviral activity of OGCA against the herpes simplex virus (HSV) (human herpes virus, HHV) on the HVI models both in vitro and in vivo.
Material and methods. We studied the activity of OGCA in a therapeutic regimen against HSV-1 (HHV-1) (Kl strain), HSV-2 (HHV-2) (VN strain) using virological and statistical research methods in the in vitro model of HVI on Vero cell culture and the model of genital herpes (GH) caused by HHV-2 (VN strain) in male guinea pigs (Canis porcellus).
Results and discussion. It was found OGCA inhibits the replication of HHV-1 and HHV-2 in Vero cells, and has anti-HHV activity in the GH model in male guinea pigs, leading to a decrease in the severity and duration of the disease, the intensity and duration of viral shedding. The most pronounced activity was detected when preparation was applied topically 5 times a day for 5 days at the early stages of infection (3% gel). The delayed use of OGCA (48 hours after infection) also had statistically significant efficacy compared to commercial reference drugs containing aciclovir or its pro-drugs: aciclovir (5% cream), AIL (acyclovir+interferon alfa-2b+lidocaine, 3% ointment), penciclovir (1% cream). OGCA significantly reduced the number of days of the pathogen shedding, as well as its infectivity, compared to animals in the control group and ones receiving placebo. The activity of OGCA, apparently, is due to its improved biopharmaceutical characteristics compared to aciclovir, as well as the presence of a number of biological activities of its constituent components.
Conclusion. The results of the study allow us to consider OGCA as the basis for the development of antiviral agents for the treatment of HVI.
Key words: herpes simplex virus; herpesvirus infection; genital herpes; organic germanium complex with aciclovir; antiviral activity; guinea pigs
For citation: Alimbarova L.M., Ambrosov I.V., Matelo S.K.,| Barinsky I.F.| Antiviral activity of the organic germanium complex with aciclovir against the herpes simplex virus (Herpesviridae: Alphaherpesvirinae: Simplexvirus: Human alphaherpesvirus 1/2) in the in vitro and in vivo systems. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2021; 66(5): 368-382 (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-76
For correspondence: Ludmila M. Alimbarova, Ph.D. (Med.), Associate Professor, Lead Researcher of the Comparative Virology Laboratory with the Russian Centre for Herpes, FSBI «National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of Russia, 123098, Moscow, Russia. E-mail: virology@mail.ru Information about the authors: Alimbarova L.M., https://orcid.org/0000-0002-8972-3111 Ambrosov I.V., https://orcid.org/0000-0001-7418-8171 Matelo S.K., https://orcid.org/0000-0002-1752-042X Barinsky I.F., https://orcid.org/0000-0001-6959-9988 Contribution: the authors contributed equally to this article. Funding. The study was funded by the State budget.
Igor' F. Barinsky1
ORIGINAL RESEARCH
Conflict of interest. For the study, the substance was presented by «VDS Pharma» LLC (Resident of the Biomedical Cluster of the Skolkovo Innovation Center); the authors include employees of the company. The authors declare no conflict of interest.
Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the institution (Protocol No. 2/1 dated 04.02.2016).
Received 17 August 2021 Accepted 07 October 2021 Published 31 October 2021
Введение
Вирусы простого герпеса (ВПГ) (герпесвирусы человека, ГВЧ) 1 и 2 типов широко распространены в человеческой популяции и способны вызывать разные по степени тяжести заболевания (назальный/лабиальный герпес, herpes nasalis/labialis; генитальный герпес (ГГ), herpes genitalis; офтальмогерпес; энцефалит; полиорганные поражения и др.) [1, 2]. По эпидемиологическим оценкам, в мире ВПГ-1 (ГВЧ-1) инфицировано 66,6% населения в возрасте от 0 до 49 лет, или 3,4 млрд человек, и ВПГ-2 (ГВЧ-2) - 13,2% населения в возрасте от 15 до 49 лет, или 491,5 млн человек [3,4].
Среди всех противовирусных средств, используемых в клинической практике, препаратом 1 линии при лечении различных форм герпе-свирусной инфекции (ГВИ) является ацикловир (АЦВ) (Aciclovir, ACV; 9-([2-гидроксиэтокси]ме-тил]-гуанин, C8H11N5O3) - синтетический аналог пуринового нуклеозида [2, 5]. Механизм действия АЦВ основан на том, что он, конкурентно взаимодействуя с ДНК-полимеразой ВПГ, включается вместо дезоксигуанозина в вирусную ДНК, блокирует её синтез и репликацию вируса [5, 6]. Однако применение АЦВ (пероральное в эпизодическом или супрессивном режимах, парентеральное либо местное) в ряде случаев не приводит к ожидаемому результату [2, 5-8]. Отсутствие эффекта может быть обусловлено рядом факторов, в т.ч. связанных с биофармацевтическими параметрами препарата и его лекарственных форм: низкая всасываемость в желудочно-кишечном тракте в результате гидро-фильности и малой пероральной биодоступности (~20%); незначительная растворимость в воде (1,3 мг/мл при 25° C и 2,5 мг/мл - при 37° C); сниженная трансдермальная диффузия при использовании топических форм [2, 5, 7]. На эффективность также могут оказывать влияние индивидуальные характеристики пациента (особенности функционирования органов и систем, прежде всего иммунной [2]) и биологические особенности вируса (способность к латенции, персистенции, формирование штаммов ВПГ, устойчивых к действию АЦВ) [2, 6-8].
Повышение эффективности терапии больных с разными формами ГВИ диктует необходимость поиска новых путей модификации АЦВ и его лекарственных форм с целью улучшения их биофармацевтических характеристик [2, 5, 9]. Так, одним из подходов к решению указанной проблемы в отношении топической терапии является разработка комбинированных пре-
паратов, например содержащих АЦВ и противовоспалительные соединения [9, 10] или интерферон (IFN) [2]. Другим подходом к улучшению биодоступности АЦВ является синтез новых молекул по принципу «me-too drug». Примерами таких производных, полученных химической модификацией АЦВ, служат валацикловир и фамцикловир, которые легче проникают в клетку и превращаются в ней в целевое вещество, подавляющее размножение ВПГ [6, 11]. Вала-цикловир, представляя собой пролекарство, трансформирующееся в организме в валин (Val, V) и АЦВ, обладает по сравнению с ним лучшей биодоступностью (55%) и более высокой скоростью всасывания в кишечнике. Тем не менее он, так же как и АЦВ, эффективен в больших дозах (до 1000-2000 мг/сут) [2, 6, 11]. Фамцикловир (пролекарство пенцикловира (2-амино-1,9-дигидро-9-[4-гидрокси-3-(гидроксиме-тил)бутил]-6Н-пурин-6-он)) характеризуется более высокими показателями биодоступности (до 77%) и эффективности, однако его водная растворимость ограничена быстрым образованием преципитиру-ющих труднорастворимых моногидратов (2-3%) [2, 6, 11].
Перспективным в данном аспекте является новое комплексное германийорганическое соединение ацикловира (КГОСА), синтезированное в соответствии с принципом «me-too drug» и состоящее из 2 атомов германия (Ge), координированных 4 остатками лимонной кислоты, молекулы АЦВ и аминокислоты аргинина (Arg, R) [12]. Введение в состав вещества германийорганического соединения обусловлено наличием у последнего противоопухолевой, иммуноадъювантной, противовирусной, анальгезирующей, антиоксидантной, противовоспалительной, регенерирующей активностей, а также способности благоприятно влиять на деятельность различных органов и систем [13]. Известно, что Ge, являясь эссенциальным микроэлементом, необходим для нормального функционирования иммунной системы человека [13, 14]. Установлено, что в составе германийорганических соединений он может оказывать воздействие на CD4+ клетки, NK-клетки, моноциты/макрофаги, В-лимфоциты, опосредованно влиять на выработку ряда цитокинов (интерлейкинов (IL) -3, -4, -13; фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor) альфа (TNF-a); IFN-y), а также антител [13, 15].
Цель настоящей работы - изучение противовирусной активности КГОСА в отношении ВПГ на моделях ГВИ in vitro и in vivo.
Материал и методы
Вирусы. В исследовании использовали вирусы ВПГ-2 (штамм «ВН») и ВПГ-1 (штамм «Кл»), полученные из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Биологическую активность вирусов определяли стандартным методом титрования [16] в клеточной культуре Vero и рассчитывали по методу Рида и Менча [17], выражая в логарифмических единицах (lg ТЦИД50/0,1 мл; ТЦИД50 - тканевая цито-патическая инфекционная доза).
Культура клеток. Выделение возбудителей из образцов биологического материала, пассирование и титрование проводили на перевиваемой культуре клеток почек африканских зелёных мартышек (Chlorocebus sabaeus) Vero, полученной из коллекции культур тканей ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи». В качестве ростовой и поддерживающей сред использовали среду Игла (ПанЭко, Россия), содержащую 10 и 2% эмбриональной телячьей сыворотки (fetal bovine serum, FBS) (ПанЭко) соответственно, а также 2 мМ L-глу-тамина (Sigma, США) и антибиотики: 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 40 мкг/мл гентамицина (ПанЭко). Клеточную культуру в концентрации ~1,0 х 105 кл/мл рассеивали в 96-луночные пластиковые культуральные планшеты (Costar, Великобритания) и культивировали в термостате при температуре +37 ± 0,5 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% диоксида углерода (CO2). Эксперименты проводили на суточных культурах Vero.
Препараты. КГОСА (Ge2[C6H5O7]4[C8HnN5O3] [C6H14N4O2]) представляет собой комплексное герма-нийорганическое соединение АЦВ (рис. 1). На долю последнего в составе молекулы вещества приходится 15% (в массовом отношении).
КГОСА (Россия) - гель 3% для наружного применения. В качестве плацебо использовали основу геля КГОСА; в качестве референс-препаратов - коммерческие противовирусные препараты в соответствии с инструкциями их производителей: ацикловир (Великобритания) - лиофилизат для приготовления ин-фузий и крем 5% для наружного применения, в 1 г которого содержится 50 мг ацикловира; Пенцикловир
(Германия) - крем 1% для наружного применения, 1 г которого содержит 10 мг пенцикловира; АИЛ (Россия) - мазь для наружного применения, содержащая ацикловир 3% + IFNa-2b рекомбинантный человеческий 20 000 МЕ/г + лидокаин 1%.
При изучении противовирусной активности in vitro 5 мг каждого из исследуемых соединений (КГОСА, АЦВ) растворяли в 1 мл дистиллированной воды (H2O) для получения маточных растворов с концентрацией 5 мг/мл. Данные растворы фильтровали через фильтры Swinnex (Merck Millipore, Германия) с размером пор 0,22 мкм, разливали по аликвотам и сохраняли при -70 °С. Непосредственно перед проведением исследований in vitro из маточных растворов готовили разведения тестируемых веществ на питательной среде Игла.
Животные. Исследования выполняли на самцах морских свинок (Canis porcellus) массой 250-350 г. Все особи были получены из питомника лабораторных животных «Столбовая» (филиал ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская область, Россия) и содержались на стандартном рационе в условиях вивария. При выполнении лабораторных экспериментов придерживались требований правил Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой в Страсбурге 18 марта 1986 г. и подтверждённой там же 1 июня 2006 г. (ETS N 123), (https://www.coe.int/t/e/legal_affairs/le-gal_cooperation/biological_safety_and_use_of_ani-mals/laboratory_animals/GT123(2002)63%20E%20 PART%20B%20Ferrets%20rev2.pdf).
Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом организации (Протокол № 2/1 от 04.02.2016).
Дизайн исследования. Изучение активности препаратов in vitro и in vivo проводили в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета МЗ РФ [16].
Рис. 1. Структура комплексного германийорганического соединения ацикловира. Fig. 1. Structure of the organic germanium complex with aciclovir.
ORIGINAL RESEARCH
Исследование in vitro включало 2 схемы: определение цитотоксического действия препаратов в интакт-ной культуре Vero, а также оценку их противовирусной активности.
Цитотоксическое действие препаратов оценивали на культуре неинфицированных клеток Vero по влиянию на их морфологию и жизнеспособность по стандартной методике [6, 18], описанной ранее [19]. Количество жизнеспособных клеток определяли методом исключения витального красителя трипано-вого синего (0,4% раствор). Число жизнеспособных (неокрашенных) и нежизнеспособных (окрашенных голубым цветом) клеток подсчитывали в камере Горя-ева. Жизнеспособность клеток в популяции (V) рассчитывали по формуле:
V (в %) = -х 100 (1), Nt
где N - число жизнеспособных (неокрашенных) клеток; Nt - общее число клеток. Значение СС50 (cytotoxicity concentration) - 50% цитотоксической концентрации препарата, снижающей жизнеспособность обработанных клеток на 50% по сравнению с необработанными, рассчитывали по стандартной методике [20].
Противовирусную активность препаратов in vitro оценивали по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток, а также их влиянию на репликацию вируса в клеточных культурах в соответствии с методиками, разработанными M. Cotarelo и соавт. [21], J. Kruppenbacher и соавт. [22], как описано нами ранее [19].
Культуру клеток Vero культивировали согласно приведённому выше описанию, после чего среду роста удаляли, клетки отмывали раствором Хенкса и заражали тест-вирусом в дозе 100 ТЦИД50. Далее культуры инкубировали в течение 1 ч в термостате при +37,0 ± 0,5 °С, супернатант удаляли, клетки повторно отмывали раствором Хенкса, добавляли к ним исследуемые препараты в разных концентрациях в составе поддерживающей среды и инкубировали в термостате при +37,0 ± 0,5 °С на протяжении 96 ч. Эксперименты сопровождали соответствующими контролями. В качестве позитивного и негативного контролей использовали соответственно инфицированные и неинфицированные клеточные культуры, к которым добавляли поддерживающую среду Игла. Контролем цитотоксичности служили неинфицированные культуры клеток, инкубируемые в присутствии тестируемых препаратов. Учёт результатов осуществляли методом световой микроскопии по общепринятому способу на 4 сут после контакта клеток с инфекционным материалом, после появления выраженного (100%) ЦПД в контрольных пробах (позитивный контроль) [19]. Для получения статистически достоверных результатов эксперименты выполняли трижды.
Эффективность препарата количественно выражали как IC50 (inhibitory concentration) - 50% ин-гибирующая концентрация препарата, снижающая на 50% развитие вирусиндуцированного ЦПД. IC50
рассчитывали посредством регрессионного анализа дозозависимых кривых [20]. Селективный индекс (selective index, SI) препарата рассчитывали как отношение 50% цитотоксической концентрации (СС50) к 50% ингибирующей концентрации (IC50).
Экспериментальная герпесвирусная инфекция у морских свинок. ГГ у самцов морских свинок моделировали по стандартной методике, также описанной нами ранее [23]. Животных заражали ви-руссодержащей жидкостью (ВПГ-2, штамм «ВН» в дозе 100 ТЦИД50), которую наносили при помощи пипетки (с последующим втиранием) на предварительно скарифицированную кожу пениса. Скарифи-цирование производили хирургическим ланцетом после анестезии лидокаином (1%); площадь скарификации составляла 4-7 мм2. Противовирусную активность препаратов изучали по терапевтической схеме начиная через 1 или 48 ч после инфицирования. Препараты наносили методом аппликации местно на кожу пениса ежедневно 5 раз в день в течение 5 сут.
В первом эксперименте 20 инфицированных особей методом случайной выборки рандомизировали на 4 группы (по 5 морских свинок в каждой). Инфицированные животные через 3 ч после заражения получали: в первой группе - КГОСА (гель); во второй группе - препарат сравнения АЦВ (крем); в третьей группе - плацебо (основу геля КГОСА). Четвертая группа (позитивный контроль) содержала животных, инфицированных ВПГ-2 в дозе, эквивалентной таковой в опытных группах, и не получавших лечения.
Во втором опыте 30 морских свинок инфицировали ВПГ-2, после чего у них взяли смывы с урогениталь-ной области на предмет выделения вируса, оценки уровня его репликации и подтверждения специфичности симптомов ГГ. Затем животных рандомизировали методом случайной выборки на 6 групп (по 5 особей в каждой). Инфицированные особи спустя 48 ч после заражения получали: в первой группе - КГОСА (гель), во второй группе - препарат сравнения АЦВ (крем), в третьей - пенцикловир (крем), в четвёртой -АИЛ (мазь); в пятой группе - плацебо (основу геля КГОСА). Шестая группа (позитивный контроль) содержала животных, инфицированных ВПГ-2 в той же дозе, что и в опытных группах, но не получавших лечения. В качестве контроля токсичности использовали интактных морских свинок (седьмая и восьмая группы), которых содержали в тех же условиях, что и животных в вышеупомянутых группах, и обрабатывали гелем КГОСА или его основой (плацебо) по аналогичной схеме. Наблюдение за животными осуществляли в течение 21 сут после заражения, ежедневно оценивая динамику развития и тяжесть ГГ с использованием шкалы баллов поражения в диапазоне от 0 до 4. При этом определяли выраженность специфических поражений (везикулы, пустулы, изъязвления, эрозии, корочки), наличие отёчности, гиперемии, признаков орхита, неврологической симптоматики (менингоэнцефалит, паралич), а также регистрировали изменения в общем состоянии и поведенческих реакциях животных, как описано нами ранее [23].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эффективность КГОСА и препаратов сравнения оценивали на момент наибольшей выраженности патологического процесса по стандартной методике [16], также описанной нами ранее [23]. Учитывали следующие параметры: интенсивность клинических проявлений (в баллах); индекс лечебного действия (ИЛД); среднюю продолжительность заболевания (СПЗ); показатели инфекционной активности вируса в биоматериалах. Величину ИЛД вычисляли по формуле:
ИЛД (в %) = х 100 (2),
А.
где А - сумма баллов в контрольной группе, В - сумма баллов в группе животных, леченных препаратом.
При изучении влияния препаратов на уровень накопления вируса у инфицированных животных на 2, 5, 7, 9 и 11 сут после заражения брали смывы с урогенитальной области с использованием 0,5 мл стерильного физиологического фосфатного буфера (ФБР; PBS) с антибиотиками (100 ЕД/мл пенициллина и 80 мкг/мл гентамицина). Далее образцы биоматериала центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин для осаждения клеточных элементов и слизи. Супернатант отбирали и до исследования хранили при -70 ± 10,0 °С. Затем из него готовили серийные 10-кратные разведения (от 10-1 до 10-7) на ФБР, которыми заражали клетки культуры Vero.
На каждое 1 разведение исследуемого материала использовали 4 лунки. Инфекционную активность патогена в биоматериале определяли по общепринятым стандартам на культуре Vero в соответствии с описанным ранее протоколом [19].
Статистическая обработка данных. Результаты опытов подвергали статистической обработке общепринятыми для биологических исследований методами [20, 24] с применением пакетов прикладных программ Microsoft Excel 5.0 и STATISTICA 7.0. Полученные данные выражали в виде среднего значения (M) и стандартной ошибки (SJ и подвергали тесту на нормальность распределения с использованием критерия Ша-пиро-Уилка. В случае нормального распределения для сравнения средних показателей применяли t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента обработку данных в дальнейшем осуществляли с использованием ^-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при величине ^-уровня значимости <0,05.
Результаты
Результаты изучения цитотоксического действия КГОСА на перевиваемой линии неинфицированных клеток Vero представлены в табл. 1. По данным световой микроскопии и теста с трипановым синим установлено, что вещество не оказывало цитотоксического действия на неинфицированные клетки. Жизнеспо-
Таблица 1. Цитотоксическое действие КГОСА на перевиваемую линию неинфицированных клеток Vero Table 1. Cytotoxic effect of OGCA on the continuous lineage of non-infected Vero cells
КГОСА OGCA По данным метода световой микроскопии According to the light microscopy method По данным метода исключения витального красителя According to the vital dye elimination method
Эквивалент
Концентрация Concentration концентрации образца по ацикловиру Equivalent of the sample concentration by aciclovir Цитотоксическое действие Cytotoxic effect on cells Цитотоксическое действие Cytotoxic effect Количество живых клеток1 Number of living cells1
мкг/мл мкг/мл % % млн mln (М ± SJ2 %
^g/ml ^g/ml
1000 160 <10,0 8,7 2,01 ± 0,36 91,34
500 80 0,0 0,6 2,03 ± 0,32 99,44
100 16 0,0 0,6 2,03 ± 0,30 99,44
50 8 0,0 0,5 2,01 ± 0,20 99,54
10 1,6 0,0 0,2 2,01 ± 0,25 99,84
5 0,8 0,0 0,2 2,05 ± 0,30 99,84
1 0,16 0,0 0,1 2,04 ± 0,25 99,94
0,5 0,08 0,0 0,1 2,01 ± 0,30 99,94
0,1 0,016 0,0 0,1 2,0 ± 0,27 99,94
среда Игла3 Eagle's medium3 0,0 0,0 0,0 2,05 ± 0,20 100,0
Примечание. 1 определено методом исключения витального красителя трипанового синего;
2 средние значения ± S по результатам 3 независимых опытов;
3 интактные клетки Vero служили в качестве контроля,
4 достоверность по отношению к контролю - клеткам Vero, инкубируемым в питательной среде ИГЛА, р > 0,05.
Note. 1 was determined by the vital dye trypan blue elimination method;
2 the average values ± Sr according to the results of three independent experiments;
3 intact Vero cells served as a control,
4 reliability in relation to the control - Vero cells incubated in the Eagle's riniral essential rediur, p > 0.05.
ORIGINAL RESEARCH
собность клеток Vero, выращенных на средах, содержащих КГОСА в диапазоне концентраций от 1000 до 0,1 мкг/мл, составила 91,3-99,9% и достоверно не отличалась от таковой для клеточных элементов, инкубируемых в питательной среде Игла без препарата (Р > 0,05).
Значение СС50 для КГОСА составило >1000 ± 110 мкг/мл по сравнению с >600 ± 95 мкг/мл для ре-ференс-препарата АЦВ.
В следующей серии экспериментов мы оценивали противовирусную активность КГОСА в отношении ГВИ в культуре Vero. Установлено, что препарат инги-
бирует репликацию как ВПГ-1, так и ВПГ-2. Параметры, характеризующие противовирусную активность исследуемого соединения и референс-препарата (СС50, 1С и 1С90, а также SI), представлены в табл. 2.
Эффективность противовирусного действия КГОСА на модели генитального герпеса у морских свинок. Анализ результатов свидетельствует о том, что КГОСА (3% гель) при использовании у морских свинок по лечебной схеме (местно пятикратно в течение 5 сут) обладает активностью в отношении ВПГ-2 штамма «ВН», выраженность которой зависит от сроков применения.
Таблица 2. Цитотоксическая и противовирусная активность КГОСА в отношении ВПГ-1 и ВПГ-2 в культуре клеток Vero Table 2. Cytotoxic and antiviral activity of OGCA against HSV-1 and HSV-2 in Vero cell culture
КГОСА OGCA Ацикловир Aciclovir
Вирус Virus СС i СС50 (M i S ), мкг/мл СС501 (M i Sm), цв/ml IC502 (M i Sm), мкг/мл IC502 (M i Sm), ^g/ml IC 3 90 (M i Sm), мкг/мл IC 3 90 (M i Sm), ^g/ml SI4 СО (M i S ), 50 v m'' мкг/мл СО (M i S ), 50m ^g/ml IO„ (M i S ), 50m мкг/мл IO„ (M i S ), 50m ^g/ml IC90 (M i S ), мкг/мл IC90 (M i S ), 90 ^g/ml SI
ВПГ-1, штамм «Кл» HSV-1, Kl strain ВПГ-2, штамм «ВН» HSV-2, VN strain >1000 i 1105 2,6 i 0,1 5,5 i 0,25 8,0 i 0,3 24,4 i 0,8 384,6 181,2 >600 i 95 1,2 i 0,1 1,7 i 0,2 3.2 i 0,2 6.3 i 0,7 500 352,9
Примечание. 'СС50 мкг/мл - 50% цитотоксическая концентрация препарата; 2IC50 - 50% ингибирующая концентрация препарата; 3IC90 - 90% ингибирующая концентрация препарата; 4SI - селективный индекс;
5значения М ± Sm по результатам 3 независимых опытов с использованием каждого типа вируса.
Note. 'СС50, 50% cytotoxic concentration of the drug; 2IC50, 50% inhibitory concentration of the drug; 3IC90, 90% inhibitory concentration of the drug; 4SI, selective index;
5values of M ± Sm according to the results of three independent experiments using each type of virus.
о V
ел
SS«
.о
л л
а
о. , р,
-0 ?
ш I
( i ^
lo
¡s в
к е ч
н и
IS
и н
ч
е р
и
o
X
e га "п
S .=
а. э
Iff « 4
15 15 3 >
щ 2 •С
h" 1
0
4 5 6 7 8 9 10 11 Время после инфицирования, сутки Time after infection, days
-■-АЦВ (ACV)
X Контроль инфицирования (Control of infection)
Рис. 2. Влияние КГОСА на течение герпесвирусной инфекции у самцов морских свинок при использовании
через 3 ч после инфицирования.
Примечание. Здесь и на рис. 3 по оси абсцисс - время после инфицирования, сутки; по оси ординат - средний индекс выраженности, баллы.
Fig. 2. The effect of OGCA on the course of herpesvirus infection in male guinea pigs when applied 3 hours after infection.
Note. Here and in Fig. 3 the X-axis shows the time after infection (days), Y-axis shows the average index of the severity of symptoms, points.
■КГОСА(OGCA) Плацебо (Placebo)
9
7
б
Наиболее выраженные результаты получены в группе инфицированных животных, получавших КГОСА (3% гель) в ранние сроки - через 3 ч после инфицирования (табл. 3, рис. 2). Применение препарата приводило у них к значимому (приблизительно в 2,3 раза) снижению суммарного индекса выраженности симптоматики (СИВС) по сравнению с особями, не получавшими лечения или получавшими плацебо, а также к достоверному укорочению СПЗ на 6,3 сут в сравнении с группой без лечения (р < 0,001) и на 4,5 сут -с группой плацебо (р < 0,05).
Несмотря на то что КГОСА обладал более быстрым началом действия относительно ацикловира (уменьшение СИВС наблюдалось уже через 1 сут после начала применения, рис. 2), на 5 сут после инфицирования выраженность симптоматики у животных, получавших исследуемые препараты, достоверно не различалась (20 против 19 баллов у АЦВ,р > 0,05).
Эффективность применения КГОСА была сопоставима с таковой для 5% крема АЦВ (ИЛД - 56,5 и 58,7% соответственно, р > 0,05).
У животных, получавших КГОСА или АЦВ, зарегистрированы уменьшение частоты и сокращение числа дней выделения вируса, а также снижение уровня его инфекционной активности в сравнении с группами контроля и плацебо. Так, на 5 сут наблюдения на фоне лечения обоими препаратами возбудитель был выделен только у 40% (2/5) животных, в то время как в группах контроля - у 100% (5/5). КГОСА, так же как и АЦВ, эффективно ингибировал репликацию ВПГ-2 у инфицированных особей, о чём свидетельствовало снижение титров вируса в урогенитальных смывах на 1,75-2,0 ^ ТЦИД50 (р < 0,001) по сравнению с таковыми в группах без лечения и на 1,25-1,5 ^ ТЦИД50 (р < 0,05) - среди получавших плацебо. На 7 сут после заражения происходило дальнейшее снижение титров
Таблица 3. Противовирусная активность КГОСА (гель 3%) в отношении ВПГ-2 (штамм «ВН») на модели генитального герпеса у морских свинок
Tabl. 3. Antiviral activity of OGCA (gel 3%) against HSV-2 (VN strain) on the model of genital herpes in guinea pigs
Группа животных, Средняя Суммарный индекс Средний индекс Индекс Титры вируса,
n = 51 продолжительность выраженности выраженности лечебного (М ± S )4,
Group of animals, заболевания (СПЗ), симптоматики, симптоматики, баллы, действия (ИЛД), lg ТЦИД50/0,1 мл
n = 51 сут, (М ± SJ2 баллы (М ± Sm) % Virus titers
Average duration of the The total index of the The average index of the Index of ther- (М ± SJ,
disease (ADD), severity of symptoms, severity of symptoms, apeutic effect lg TCro50/0,1 ml
days (М ± SJ points points (ITE)
Лечебная схема: через 3 ч после заражения ежедневно в течение 5 дней пятикратно
Treatment regimen: 3 hours after infection, five times daily for 5 days
КГОСА 7,8 ± 1,5* 20,03 4,0 ± 0,5 56,52* 3,25 ± 0,15*
OGCA
Ацикловир 9,2 ± 1,75* 19,03 3,8± 1,0 58,69* 3,0 ± 0,2*
Aciclovir
Плацебо (основа геля) 12,3 ± 1,4 37,5 7,5 ± 0,25 18,47 4,5 ± 0,16
Placebo (gel base)
Контроль инфицирования 14,1 ± 1,5 46,0 9,2 ± 0,75 5,0 ± 0,11
Infection control
Лечебная схема: через 48 ч после заражения ежедневно в течение 5 дней пятикратно
Treatment regimen: 48 hours after infection, five times daily for 5 days
КГОСА 9,8 ± 1,5* 24,03 4,8 ± 0,563 47,8* 3,5 ± 0,1*
OGCA
Ацикловир 10,5 ± 2,0* 28,133 5,6 ± 0,683 38,86* 3,4 ± 0,3*
Aciclovir
Пенцикловир 9,5 ± 1,52* 27,53 5,5 ± 1,03 40,21* 3,0 ± 0,25*
Penciclovir
АИЛ 10,3 ± 1,35* 30,03 6,0 ± 1,03 34,78* 3,75 ± 0,2*
AIL
Плацебо (основа геля) 14,0 ± 1,5 39,5 7,9 ± 0,25 14,1 4,9 ± 0,3
Placebo (gel base)
Контроль инфицирования 15,3 ± 1,25 46,0 9,2 ± 0,75 5,25 ± 0,16
Infection control
Примечание. 1n - число животных в каждой группе = 5; 2М - среднее арифметическое, S - стандартное отклонение;
*отличие относительно животных группы контроля статистически значимо (р < 0,05, U-критерий Манна-Уитни); 3отличие относительно животных группы контроля статистически значимо (р < 0,05, /-критерий Стьюдента); 4 уровень накопления вируса в смывах с урогенитальной области, взятых на 5 сут после заражения; ТЦИД50 - тканевая цитопатическая инфекционная доза.
Note. 1n, the number of animals in each group is 5;
2M, the arithmetic mean; S, - the standard deviation;
. m '
* - the difference compared to the animals in the control group is statistically significant (p < 0.05, U- the the Mann-Whitney criterion); 3the difference compared to the animals in the control group is statistically significant (p < 0.05, / - the Student's criterion); 4the level of virus accumulation in flushes from the urogenital region taken on the 5th day after infection; TCID.„, tissue culture infectious dose.
ORIGINAL RESEARCH
s
15
0
M
Л Ю
a
m I
у ь
Ш e
ii '1 I
1 u
<u a и
Ш >
Ш (Л (Л
<u .Е
-с О
~ а.
ч- ,
О |л
х Е
■S о
с S.
® I
£ *
1- ч-
Ш О >
ТО ш
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
10 11 12 13 14 15 16
Время после инфицирования, сутки Time after infection, days
КГОСА(OGCA) Пенцикловир (Penciclovir) Плацебо (Placebo)
•АЦВ (ACV) ■АИЛ (AIL)
Контроль инфицирования (Control of infection)
Рис. 3. Влияние КГОСА на течение герпесвирусной инфекции у самцов морских свинок при использовании
через 48 ч после инфицирования. Fig. 3. The effect of OGCA on the course of herpesvirus infection in male guinea pigs when applied 48 hours after infection.
0
вируса во всех группах, в т.ч. у 80% (4/5) контрольных животных и у 60% (3/5) - в группе плацебо до 3,0 ± 0,2 ^ ТЦИД/0,1 мл и у 20% (1/5) особей, получавших КГОСА или АЦВ, - до 1,5 ± 0,1 ^ ТЦИД50/0,1 мл (р < 0,05 в сравнении с контролем). Позже 7 сут от момента инфицирования вирус не был выделен ни у одного животного, получавшего КГОСА или АЦВ.
Несмотря на то, что применение основы геля КГОСА 5 раз в день на протяжении 5 сут приводило к снижению СПЗ на 1,8 сут и определённому терапевтическому эффекту (ИЛД 18,47 баллов) по сравнению с аналогичными показателями у инфицированных животных, не получавших лечения, его выраженность не достигала статистической значимости (р > 0,05). Также не установлено достоверного влияния плацебо на уровень репликации вируса в урогенитальной области (р Данный факт свидетельствует о том, что основа геля КГОСА не обладает противовирусной активностью. В то же время её использование приводило к уменьшению выраженности воспалительных изменений у инфицированных животных, что, по-видимому, обусловлено входящими в её рецептуру компонентами.
Лечение с использованием КГОСА, начатое спустя 48 ч после заражения, у животных с выраженными симптомами ГГ (наличие везикул, гиперемии, отёка) воспроизводит клиническую ситуацию, при которой пациент с теми или иными признаками заболевания обращается за медицинской помощью. В условиях данного эксперимента у 30 инфицированных особей перед рандомизацией был проведён анализ смывов с очагов поражения, подтвердивший специфичность симптомов ГГ и позволивший разделить подопытных на равнозначные группы. Результаты отсроченного применения КГОСА
и референс-препаратов у инфицированных животных представлены в табл. 3 и на рис. 3.
На фоне терапии КГОСА у животных с выраженными проявлениями ГГ отмечено замедление прогрессирования симптомов заболевания уже через 1 сут от начала медикаментозного вмешательства (рис. 3) по сравнению как с получавшими референс-препараты/плацебо, так и с особями без лечения. На 5 сут после заражения КГОСА превосходил по влиянию на выраженность симптоматики и значению ИЛД все используемые в опыте референс-препараты. Несмотря на то что величина ИЛД в случае КГОСА превышала таковую для препарата АЦВ на 8,94%, а для пенцикловира -на 7,59%, данные различия не были достоверными (р > 0,05), в то время как различия по этому параметру с комбинированным препаратом АИЛ на 13,02% оказались статистически значимыми (р < 0,05). Следует отметить, что КГОСА по влиянию на СПЗ у инфицированных особей был сопоставим с референс-препаратами. Так, 3% крем АЦВ и мазь АИЛ достоверно снижали СПЗ с 15,3 ± 1,25 сут (без лечения) в среднем до 10,4 сут, а 1% крем Пен-цикловир - до 9,5 ± 1,5 сут. Значимых различий между показателями эффективности КГОСА в виде геля для наружного применения и референс-препа-ратов (АЦВ, пенцикловир) по влиянию на динамику инфекционного процесса и СПЗ не было выявлено. Несмотря на то что применение основы геля КГОСА приводило к определённому терапевтическому воздействию (ИЛД 14,1%) и снижению СПЗ до 14,0 ± 1,5 сут, по выраженности лечебного эффекта оно уступало как КГОСА, так и референс-препаратам.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для оценки влияния отсроченной терапии КГОСА на частоту и продолжительность выделения ВПГ-2, а также уровень его репликации у инфицированных животных проведено изучение образцов смывов, взятых с очагов поражения, с использованием стандартной методики на культуре клеток Vero. Результаты представлены в табл. 4 и на рис. 4.
Установлено, что через 5 сут после заражения у животных в группах контроля и плацебо частота выделения вируса не изменилась по сравнению со 2-ми сут после заражения и составила 100% (рис. 4). В то же время среди подопытных, получавших КГОСА или содержащие АЦВ препараты, этот показатель снизился со 100 до 60%, а у получавших пенцикловир -до 40%. Через 7 сут после инфицирования во всех группах наблюдали дальнейшее снижение частоты выделения вируса, наиболее выраженное у особей, получавших КГОСА или референс-препараты (20% против 80 и 60% у животных в группах контроля или плацебо соответственно, p < 0,05).
Способность препарата сокращать период вирусовы-деления служит одним из важных факторов контроля за распространением инфекционного агента. Исследование показало, что терапия как КГОСА, так и рефе-ренс-препаратами приводила к достоверному сокращению (на 2 сут) времени выделения вируса у инфицированных животных по сравнению с не получавшими лечения/получавшими плацебо, у которых вирус обнаруживался в очагах поражения на протяжении 9 сут.
При отсроченном применении КГОСА эффективно ингибировал репликацию ВПГ-2 у инфицированных особей, о чём свидетельствуют данные, представленные в табл. 4.
Поскольку ГГ является самолимитирующейся инфекцией, то через 5 сут после заражения частота выделения вируса и его инфекционная активность снизились во всех группах. У животных, получавших КГОСА, значение последнего параметра уменьшилось по сравнению со 2-ми сут после заражения в среднем в 5 раз (с 4,25 до 3,5 lg ТЦИД50/0,1 мл) и было сопоставимо с таковым у референс-препаратов АЦВ и АИЛ. Наиболее существенное снижение инфекционной активности вируса - на 1,25 lg ТЦИД50 - выявлено среди особей, получавших Пенцикловир.
Через 7 сут после заражения инфекционная активность вируса у морских свинок на фоне лечения КГОСА снизилась более чем в 10 раз по сравнению с предыдущим периодом исследования и была сопоставима с определяемой в образцах смывов у инфицированных животных, получавших референс-препа-раты. Спустя 9 сут возбудитель был выделен из смывов с урогенитальной области только у 40% (2/5) животных в группе контроля и у 20% (1/5) - в группе плацебо с инфекционной активностью, равной в среднем 1,83 ± 0,18 lg ТЦИД50/0,1 мл (табл. 4, рис. 4). Изучение образцов смывов с очагов поражений, взятых у инфицированных особей позже указанного срока, как и в первом эксперименте, не выявило наличия вируса ни у одного животного во всех группах.
Таким образом, в опытах по изоляции и титрованию вируса из образцов биоматериала у инфицированных животных с ГГ в культуре клеток Vero нами получены данные о наличии у 3% геля КГОСА противовирусной активности в отношении ВПГ-2. Эти результаты сопоставимы с интенсивностью проявлений ГГ у инфицированных моделей.
Таблица 4. Влияние КГОСА на инфекционную активность ВПГ-2, выделенного из очагов поражения у инфицированных морских свинок* (по данным вирусологического метода)
Table 4. The effect of OGCA on the infectious activity of HSV-2 isolated from lesions in infected guinea pigs* (using the virological method)
Группа животных Group of animals
Дни после инфицирования Days after infection
2
3
7
9
И
Титры вируса у животных с выделением вируса (М ± Sm), lg ТЦИД50/0,1 мл _Virus titers in animals with virus shedding (М ± Sm), lg TCID50/0,1 ml_
КГОСА гель OGCA gel Ацикловир крем Aciclovir cream Пенцикловир крем Penciclovir cream АИЛ мазь AIL ointment
Плацебо (основа геля КГОСА) Placebo (OGCA gel base) Контроль инфицирования Infection control
3 3,3 i О,23 2,23 i О,233 О О
3 3,4 i ОДР 2,О i О,43 О О
3 3,О i О,43 Р73 i ОДР О О
4,23 i О,'
3 (n = 3О) 3,73 i ОД33 2,3 i О,22 О О
3 4,9 i О,2 3,3 i О,3 ',63 i О,' О
3 3,23 i О,23 3,73 i О,3 2,О i О,23 О
Примечание. 1титры вируса у 30 инфицированных животных перед началом лечения (через 48 часов после заражения); 2различие относительно животных группы контроля статистически значимо (р < 0,05, U-критерий Манна-Уитни); 3различие относительно животных группы контроля статистически значимо (р < 0,05, /-критерий Стьюдента); * - животные с выделением вируса.
Note. 1virus titers in 30 infected animals before starting treatment (48 hours after infection);
2the difference compared to the animals in the control group is statistically significant (p < 0.05, U - the Mann-Whitney criterion);
3the difference compared to the animals in the control group is statistically significant (p < 0.05, / - the Student's criterion); *, animals with virus shedding.
ORIGINAL RESEARCH
100
90
s?
0s «
I
И
S £
® s
M
я
U
2 f
>4 >
S J2
% £
и 'S
H 3
80
70
60
50
40
30
20
10
pq Контроль инфицирования
(Control of infection) ЦП КГОСА (OGCA)
Пенцикловир (Penciclovir)
®Ремя после заражен» 9
I I Плацебо (Placebo)
¡Ц Ацикловир (Aciclovir) IS АИЛ (AIL)
11
Рис. 4. Влияние КГОСА (3% гель) на частоту выделения вируса из очагов поражения у самцов морских свинок, инфицированных
ВПГ-2 (по данным вирусологического метода).
Примечание. По оси абсцисс - время после заражения, сутки; по оси ординат - доля животных с выделением вируса, %. Fig. 4. The effect of OGCA (3% gel) on the frequency of virus isolation from lesions in male guinea pigs infected with HSV-2
(according to the virological method). Note. X-axis shows the time after infection (days), Y-axis shows the proportion of animals with virus shedding, percentage.
Контроль токсичности. Ежедневный осмотр не-инфицированных животных, которым наносили на кожу пениса исследуемый гель КГОСА или его основу 5 раз в день в течение 5 сут, показал, что исследуемый препарат и его гелевая основа не обладали раздражающим действием и не оказывали каких-либо видимых побочных эффектов на протяжении всего периода наблюдения. Изменений в поведении и общем состоянии не выявлено ни у одного животного; ни в одном случае не зарегистрировано также наличия покраснения, отёка, зуда, явлений дерматита.
Обсуждение
В настоящее время основное направление в лечении ГВИ, в том числе и ГГ, подразумевает приме-
нение этиотропных препаратов из группы ациклических нуклеозидов [2, 5, 6]. Одним из наиболее используемых является АЦВ, применяемый в зависимости от клинической формы инфекции и степени её тяжести перорально, парентерально либо местно [2, 5-8]. Хотя АЦВ - эффективное средство терапии ГВИ, его эмпирическое назначение не всегда оказывается успешным [2, 5, 6], так как не исключает рецидивирования заболевания, бессимптомного ви-русовыделения, не позволяет провести эрадикацию возбудителя, устранить иммунные нарушения [2] или предотвратить формирование штаммов ВПГ с изменёнными свойствами, устойчивыми к действию препарата [2, 6-8]. Среди значимых причин недостаточной эффективности терапии АЦВ следует отметить
его низкую всасываемость в желудочно-кишечном тракте в результате гидрофильности и невысокой пе-роральной биодоступности, малую растворимость в воде, сниженную трансдермальную диффузию при использовании топических форм и т.д. [2, 5, 7].
Одним из перспективных подходов к повышению биофармацевтических характеристик АЦВ является синтез его производных по принципу «me-too drug», которые легче проникают в клетку и превращаются в ней в целевое вещество, подавляющее размножение ВПГ, а также имеют повышенную биодоступность. Примером таких химически модифицированных пролекарств АЦВ являются валаци-кловир и фамцикловир [2, 6, 11]. В данной работе нами представлены результаты изучения активности КГОСА (синтезированного в соответствии с указанным принципом) - нового комплексного германий-органического соединения АЦВ.
Из данных литературы известно, что возбудителем ГГ может быть не только ВПГ-2, но и в 30% случаев - ВПГ-1 [3,4], поэтому в настоящем исследовании мы оценивали противовирусную активность КГОСА с использованием нескольких типов ВПГ. Установлено, что вещество in vitro эффективно ингибирует вирусную репликацию ВПГ-1 и ВПГ-2, обладая сравнимой с референс-пре-паратом АЦВ активностью и не проявляя явной цито-токсичности в концентрации >1000 мкг/мл. Результаты, полученные in vitro в отношении ВПГ, в дальнейшем были подтверждены in vivo у самцов морских свинок на модели ГГ, вызванного ВПГ-2. Такая модель в настоящее время считается клинически релевантной ситуации у человека, поскольку имитирует различные периоды развития заболевания [16]. Нами показано, что КГОСА (гель 3%) при местном использовании по лечебной схеме обладает достоверной противовирусной активностью в отношении ВПГ-2, выраженность которой зависит от времени его применения. Наиболее значимые результаты получены при его использовании в ранние сроки - через 3 ч после заражения. У инфицированных животных препарат приводил к значимому замедлению прогрессирования симптомов ГГ и снижению СИВС, сокращению продолжительности заболевания по сравнению как с инфицированными особями без лечения, так и с получавшими плацебо (основу геля КГОСА). Установлено также, что КГОСА эффективно снижал репликацию ВПГ, уменьшал частоту и сокращал продолжительность выделения вируса из урогенитальных путей, что согласуется с исходами заболевания у морских свинок, а также может иметь значение для контроля за распространением возбудителя. По эффективности КГОСА оказался сопоставимым с препаратом сравнения АЦВ (крем 5%). Следует отметить, что полученные нами результаты согласуются с данными E. Kern и соавт. [25], показавших, что у мышей, интравагинально инфицированных ВПГ-2, лечение 1% и 5% АЦВ в виде мази или геля, начатое в ранние сроки (через 3, 6 или 24 ч) после заражения, снижало репликацию вируса, уменьшало тяжесть первичного заболевания и смертность. Описаны положительные эффекты местной терапии ГГ комбинированным препаратом АЦВ в сочетании с IFN
(АИЛ) также при использовании в ранние сроки после инфицирования [2]. Кроме того, у пациентов с этой локализацией герпетического поражения эффективность терапии намного выше, если она начата в первые 24-48 ч от появления начальных признаков заболевания [2].
Лечение с использованием КГОСА, начатое через 48 ч после заражения, у животных с выраженными симптомами ГГ воспроизводило клиническую ситуацию, когда пациент с теми или иными проявлениями заболевания обращается за медицинской помощью. При отсроченном применении (через 48 ч после заражения) препарат подавлял симптомы ГГ и ингибировал репликацию ВПГ-2 у морских свинок так же эффективно, как и препараты сравнения, содержащие АЦВ (АЦВ крем, АИЛ мазь), или пролекарство пенцикловира (Пенцикловир крем). На фоне терапии КГОСА выявлены снижение уровня инфекционной активности вируса, уменьшение частоты и сокращение продолжительности его выделения, что, в свою очередь, подтверждает наличие у препарата противовирусной активности в отношении ВПГ-2.
Что же касается эффективности отсроченного лечения АЦВ, то, по данным E. Kern и соавт. [25] у мышей, интравагинально инфицированных ВПГ-2, применение 5% АЦВ в виде мази или геля спустя 48-72 ч после заражения приводило к значительному снижению вирусной нагрузки, уменьшению тяжести заболевания, но не влияло на исход ГГ в плане показателей смертности. В то же время в другой работе [26] показана выраженная активность 5% ациклови-ра монофосфата, 5% крема АЦВ и в меньшей степени 1% крема пенцикловира в отношении ВПГ-1 при орофациальной инфекции у мышей и АЦВ-чувстви-тельного/АЦВ-резистентного ВПГ-2 у инфицированных морских свинок, когда лечение было начато через 24, 48 или 72 ч после заражения.
Как известно, у инфицированных ВПГ людей возможно спонтанное выделение вируса независимо от наличия активной симптоматики; таким образом, вероятность передачи возбудителя является важной проблемой для пациентов с ГГ и их партнёров, в особенности в дискордантных парах [2]. Хотя АЦВ уменьшает репликацию вируса в половых путях, он не способен полностью прекратить его выделение даже на фоне проведения супрессивной терапии [2]. Ранее В.Л. Андроновой и соавт. [27] на модели ВПГ-1-генитальной инфекции у морских свинок показано, что титры вируса в урогенитальных смывах не изменялись после лечения мазью АЦВ или мазью фосфит ациклогуанозина [27]. В настоящем исследовании мы установили, что КГОСА значимо уменьшал инфекционную активность ВПГ-2 и частоту его выделения.
Несмотря на то что в последние годы ведётся активный поиск новых лекарственных средств для лечения ГВИ, интерес к совершенствованию методик и схем применения АЦВ (в частности, топической формы), а также создание его новых модификаций и фармакологических форм не теряют своей актуальности. Мишенью для АЦВ (при местном применении) служит ба-зальный эпидермис. Тем не менее традиционная топиче-
ORIGINAL RESEARCH
ская терапия препаратом имеет низкую эффективность, обусловленную отсутствием проникновения достаточного его количества в целевой участок кожи. Известно, что количество АЦВ, попадающее после применения 5% крема в базальный слой эпидермиса, составляет всего 30-50% от концентрации, достижимой приёмом внутрь [2]. Одной из причин снижения трансдермаль-ной диффузии АЦВ является охарактеризованная ранее его низкая растворимость в воде. В настоящее время наряду с получением различных модификаций АЦВ проводятся исследования по созданию его новых топических форм (микро-, нанонизированных и т.д.), способных повысить биодоступность вещества, обеспечить его адекватную концентрацию в целевом участке кожи для эффективного подавления репликации ВПГ [29]. На основе указанной технологии разработаны комбинированные препараты, в частности содержащие АЦВ и противовоспалительные соединения - гидрокортизон (крем) [9], кетоконазол (крем, гель, бальзам для губ) [10] либо АЦВ и IFN (мазь) [2], которые применяются в основном для лечения herpes labialis. Ведутся работы по созданию трансмукозальных лекарственных форм АЦВ (гель, крем, бальзам для губ), способных обеспечить проникновение достаточного количества препарата в целевой участок кожи [10]. Рядом исследователей продемонстрировано преимущество использования ге-левой основы для разработки топической формы АЦВ в связи с её наибольшей (по сравнению с кремом или бальзамом) проницаемостью через слизистую оболочку [10, 27].
В исследовании K. Rajpoot [28] предлагается новый подход к повышению пенетрации АЦВ путём синтеза наноэмульсионной органогелевой системы (органоге-ля на основе сложных эфиров сорбита, нагруженного молекулами АЦВ), которая в эксперименте показала высокую гелеобразующую способность и эффективность по отношению к ВПГ. В креме Пенцикловир улучшение пенетрации активного вещества достигнуто введением в рецептуру пропиленгликоля и це-томакрогола 1000, которые облегчают проникновение пенцикловира через кожу, стабилизируют компоненты препарата и пролонгируют их действие в инфицированной клетке на протяжении >12 ч [2, 11]. Поэтому при местном нанесении лекарственное средство быстро диффундирует через верхние слои кожи. Пен-цикловир быстро переходит в пенцикловира трифос-фат, обладающий фармакологической активностью и блокирующий репликацию ВПГ [2, 11]. Данные, полученные в нашей работе относительно активности крема Пенцикловир в отношении ВПГ-2 при использовании через 48 ч после заражения у морских свинок, объясняются именно этим феноменом.
В геле КГОСА проблема повышения биодоступности и проникновения активного вещества решена несколько иначе, чем в приведённых выше случаях. Гель представляет собой пространственно-структурированную водную систему, содержащую 3% комплексного гер-манийорганического соединения АЦВ. Введение в молекулу германийорганического комплекса позволило снизить концентрацию исходного вещества (АЦВ) и из-
менить биофармацевтические характеристики препарата. B частности, достигнуто увеличение растворимости KroCA в воде (>25% против 0,13% у AUB) во всём физиологическом диапазоне рН (в отличие от низкой растворимости AUB при рН 4,4-4,5 и 6,8), а также в биорелевантных средах. Bспoмoгaтельные вещества, входящие в рецептуру геля (пропиленгликоль, ксилитол, гидроксиэтилцеллюлоза, натрия альгинат, полисорбат, этилендиаминтетраацетат Qfl,TA) и др.), обеспечивают ускорение пенетрации KTOCA через верхние слои кожи, стабильность специфической активности и надлежащую микробиологическую чистоту препарата. Bключе-ние в состав геля пропиленгликоля позволило ускорить проникновение молекул активного вещества вглубь кожи. Пропиленгликоль представляет собой двухатомный спирт; он нетоксичен, используется как гигроскопическое вещество (увлажнитель), растворитель, стабилизатор и консервант, обладает бактерицидными свойствами, что позволяет минимизировать количественный состав ингредиентов основы. Гелевая основа (не обладающая способностью ингибировать репликацию BПГ) способствует ускорению пенетрации KTOCA в средние слои эпидермиса, потенцирует лечебное действие вещества, а также снижает выраженность экссудативно-вос-палительных проявлений ГГ. Благодаря составляющим гелевой основы KTOCA при нанесении на кожу образует защитную прозрачную микроплёнку, создающую воздухопроницаемую микросреду для ускоренной регенерации повреждённых тканей, а также способствует уменьшению жжения, зуда, выраженности отёчности и других симптомов.
Заключение
Результаты исследования показывают, что комплексное германийорганическое соединение AЦB ингиби-рует репликацию BПГ-1 и BПГ-2 в клетках культуры Vero и обладает aнти-BПГ-2-aктивнoстью на модели ГГ у морских свинок, приводящей к снижению выраженности симптоматики, тяжести и продолжительности заболевания, снижению инфекционной активности вируса и продолжительности его выделения. Полученные данные позволяют рассматривать KTOCA в качестве основы для разработки средств для лечения ГОИ, обладающих противовирусной активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Roizman В., Knipe D.M., Whitley R.J. Herpes Simplex Viruses. In: Knipe D.M., Howley P.M., Cohen J.I., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., еds. Fields Virology. Philadelphia, PA: Wolters Kluw-er/Lippincott Williams & Wilkins; 2013: 1823-97.
2. Исаков B.A., ред. Герпесвирусные инфекции человека: руководство для врачей. Cüö.: CпецЛит; 2013.
3. Looker K.J., Magaret A.S., May M.T., Turner K.M.E., Vickerman P., Gottlieb S.L., et al. Global and regional estimates of prevalent and incident Herpes Simplex Virus type 1 infections in 2012. PLoS One. 2015; 10(10): e0140765. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0140765
4. James C, Harfouche M., Welton N.J., Turner K.M.E., Abu-Radd-ad L.J., Gottlieb S.L., et al. Herpes Simplex Virus: global infection prevalence and incidence estimates, 2016. Bull. World Health Organ. 2020; 98(5): 315-29. https://doi.org/10.2471/BLT.19.237149
5. Whitley R., Baines J. Clinical management of herpes simplex virus infections: past, present and future. F1000Res. 2018; 7: 1726. https://doi.org/10.12688/f1000researh.16157.!
6. James S.H., Prichard M.N. Current and future therapies for herpes simplex virus infections: mechanism of action and drug resistance. Curr. Opin. Virol. 2014; 8: 54-61. https://doi.org/10.1016/jxovi-ro.2014.06.003
7. Piret J., Boivin G. Antiviral resistance in herpes simplex virus and varicella-zoster virus infections: diagnosis and management. Curr. Opin. Infect. Dis. 2016; 29(6): 654-62. https://doi.org/10.1097/ QC0.0000000000000288
8. Burrel S., Aime C., Hermet L., Ait-Arkoub Z., Agut H., Boutol-leau D. Surveillance of herpes simplex virus resistance to antivirals: a 4-year survey. Antiviral Res. 2013; 100(2): 365-72. https://doi. org/10.1016/j.antiviral.2013.09.012
9. Vere Hodge R.A., Field H.J. Antiviral agents for herpes simplex virus. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 1-38. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00001-9
10. Viljoen J.M., Botes D., Steenekamp J.H. Formulation and evaluation of selected transmucosal dosage forms containing a double fixed-dose of acyclovir and ketoconazole. Eur. J. Pharm. Sci. 2018; 111: 503-13. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2017.10.033
11. Birkmann A., Zimmermann H. HSV antivirals - current and future treatment options. Curr. Opin. Virol. 2016; 18: 9-13. https://doi. org/10.1016/j.coviro.2016.01.013
12. Исаев А.Д., Манашеров Т.О., Амбросов И.В., Матело С.К. Комплексные соединения германия с производными азотистых оснований пуринового ряда, способы их получения и содержащие их лекарственные средства. Патент РФ RU2487878C1; 2013.
13. Комаров Б.А., Зеленков В.Н., Погорельская Л.В., Албулов А.И. Элемент германий и биологическая активность его соединений. В кн.: Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. М.; 2016: 169-78.
14. Sekhon B.S. Metalloid compounds as drugs. Res. Pharm. Sci. 2013; 8(3): 145-58.
15. Cho J.M., Chae J., Jeong S.R., Moon M.J., Shin D.Y., Lee J.H. Immune activation of Bio-Germanium in a randomized, doubleblind, placebo-controlled clinical trial with 130 human subjects: Therapeutic opportunities from new insights. PLoS One. 2020; 19; 15(10): e0240358. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240358
16. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлёва М.В., Лепахин В.К., и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. М.: Гриф и К; 2012.
17. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50% endpoints. Amer. J. Hygiene. 1938; 27: 493-7.
18. Osano E., Kishi J., Takahashi Y. Phagocytosis of titanium particles and necrosis in TNF-alpha-resistant mouse sarcoma L929 cells. Toxicol. In Vitro. 2003; 17(1): 41-7. https://doi.org/10.1016/s0887-2333(02)00127-3
19. Алимбарова Л.М., Керимов Т.З., Борзенок С.А. Изучение противовирусной активности жидких сред для хранения роговицы в отношении вируса простого герпеса in vitro. Вопросы вирусологии. 2020; 65(4): 228-36. https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-4-228-236
20. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.: ВМедА; 2002.
21. Cotarelo M., Catalán P., Sánchez-Carrillo C., Menasalvas A., Cercenado E., Tenorio A., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. J. Antimicrob. Chemother. 1999; 44(5): 705-8. http:// doi.org/10.1093/jac/44.5.705
22. Kruppenbacher J.P., Klass R., Eggers H.J. A rapid and reliable assay for testing acyclovir sensitivity of clinical herpes simplex virus isolates independent of virus dose and reading time. Antiviral Res. 1994; 23(1): 11-22. https://doi.org/10.1016/0166-3542(94)90029-9
23. Novoselova E.A., Alimbarova L.M., Monakhova N.S., Lep-ioshkin A.Yu., Ekins S., Makarov V.A. In vivo activity of py-rimidine-dispirotripiperazinium in in the male guinea pig model of genital herpes. J. Virol. Antivir. Res. 2020; 9(1). https://doi. org/10.37532/jva.2020.9(1).193
24. Пшеничников В.А., Семёнов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. М.: Медицина; 1974.
25. Kern E.R., Richards J.T., Overall J.C., Glasgow L.A. Acyclo-vir treatment of experimental genital herpes simplex virus infections. I. Topical therapy of type 2 and type 1 infections of mice. Antiviral Res. 1983; 3(4): 253-67. https://doi.org/10.1016/0166-3542(83)90004-9.
26. Kern E.R., Palmer J., Szczech G., Painter G., Hostetler K.Y. Efficacy of topical acyclovir monophosphate, acyclovir, or penciclovir in orofacial HSV-1 infections of mice and genital HSV-2 infections of guinea pigs. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000; 19(1-2): 501-13. https://doi.org/10.1080/15257770008033024
27. Андронова В.Л., Ясько В.М., Куханова М.К., Галегов Г.А., Скоблов Ю.С., Кочетков С.Н. Антигерпесвирусная эффективность фосфита ациклогуанозина, преодолевающего барьер резистентности к ацикловиру. Acta Naturae. 2016; 8(1): 81-8.
28. Rajpoot K. Acyclovir-loaded sorbitan esters-based organogel: development and rheological characterization. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 2017; 45(3): 551-9. https://doi.org/10.3109/21691401. 2016.1161639
29. Rodrigues L.N.C., Zanluchi J.M., Grebogi I.H. Percutaneous absorption enhancers: Mechanisms and potential. Braz. Arch. Biol. Technol. 2007; 50(6): 949-61. https://doi.org/10.1590/S1516-89132007000700006
REFERENCES
1. Roizman B., Knipe D.M., Whitley R.J. Herpes Simplex Viruses. In: Knipe D.M., Howley P.M., Cohen J.I., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., еds. Fields Virology. Philadelphia, PA: Wolters Kluw-er/Lippincott Williams & Wilkins; 2013: 1823-97.
2. Isakov V.A., ed. Human Herpesvirus Infections: A Guide for Physicians [Gerpesvirusnye infektsii cheloveka: rukovodstvo dlya vrachey]. St. Petersburg: SpetsLit; 2013. (in Russian)
3. Looker K.J., Magaret A.S., May M.T., Turner K.M.E., Vickerman P., Gottlieb S.L., et al. Global and regional estimates of prevalent and incident Herpes Simplex Virus type 1 infections in 2012. PLoS One. 2015; 10(10): e0140765. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0140765
4. James C, Harfouche M., Welton N.J., Turner K.M.E., Abu-Raddad L.J., Gottlieb S.L., et al. Herpes Simplex Virus: global infection prevalence and incidence estimates, 2016. Bull. WorldHealthOrgan. 2020; 98(5): 315-29. https://doi.org/10.2471/BLT.19.237149
5. Whitley R., Вaines J. Clinical management of herpes simplex virus infections: past, present and future. F1000Res. 2018; 7: 1726. https://doi.org/10.12688/f1000researh.16157.!
6. James S.H., Prichard M.N. Current and future therapies for herpes simplex virus infections: mechanism of action and drug resistance. Curr Opin. Virol. 2014; 8: 54-61. https://doi.org/10.1016/j. coviro.2014.06.003
7. Piret J., Boivin G. Antiviral resistance in herpes simplex virus and varicella-zoster virus infections: diagnosis and management. Curr. Opin. Infect. Dis. 2016; 29(6): 654-62. https://doi.org/10.1097/ QCO.0000000000000288
8. Burrel S., Aime C., Hermet L., Ait-Arkoub Z., Agut H., Boutol-leau D. Surveillance of herpes simplex virus resistance to antivirals: a 4-year survey. Antiviral Res. 2013; 100(2): 365-72. https://doi. org/10.1016/j.antiviral.2013.09.012
9. Vere Hodge R.A., Field H.J. Antiviral agents for herpes simplex virus. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 1-38. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00001-9
10. Viljoen J.M., Botes D., Steenekamp J.H. Formulation and evaluation of selected transmucosal dosage forms containing a double fixed-dose of acyclovir and ketoconazole. Eur. J. Pharm. Sci. 2018; 111: 503-13. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2017.10.033
11. Birkmann A., Zimmermann H. HSV antivirals - current and future treatment options. Curr. Opin. Virol. 2016; 18: 9-13. https://doi. org/10.1016/j.coviro.2016.01.013
12. Isaev A.D., Manasherov T.O., Ambrosov I.V., Matelo S.K. Complex compounds of germanium with derivatives of nitrogenous bases of the purine series, methods of their preparation and medicines containing them. Patent RF RU2487878C1; 2013. (in Russian)
13. Komarov B.A., Zelenkov V.N., Pogorel'skaya L.V., Albulov A.I. The element germanium and the biological activity of its compounds. In: Unconventional Natural Resources, Innovative Technologies and Products [Element germaniy i biologicheskaya aktivnost' ego soedi-neniy. V kn.: Netraditsionnye prirodnye resursy, innovatsionnye tekh-nologii iprodukty]. Moscow; 2016: 169-78. (in Russian)
14. Sekhon B.S. Metalloid compounds as drugs. Res. Pharm. Sci. 2013; 8(3): 145-58.
15. Cho J.M., Chae J., Jeong S.R., Moon M.J., Shin D.Y., Lee J.H. Immune activation of Bio-Germanium in a randomized, double-blind,
ORIGINAL RESEARCH
placebo-controlled clinical trial with 130 human subjects: Therapeutic opportunities from new insights. PLoS One. 2020; 19; 15(10): e0240358. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0240358
16. Mironov A.N., Bunatyan N.D., Vasil'ev A.N., Verstakova O.L., Zhuravleva M.V., Lepakhin V.K., et al. Guidelines for Conducting Preclinical Research of Medicines. Part 1 [Rukovodstvo po prove-deniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv. Chast' 1]. Moscow: Grif i K; 2012. (in Russian)
17. Reed L., Muench H. A simple method of estimating 50% endpoints. Amer. J. Hygiene. 1938; 27: 493-7.
18. Osano E., Kishi J., Takahashi Y. Phagocytosis of titanium particles and necrosis in TNF-alpha-resistant mouse sarcoma L929 cells. Toxicol. In Vitro. 2003; 17(1): 41-7. https://doi.org/10.1016/s0887-2333(02)00127-3
19. Alimbarova L.M., Kerimov T.Z., Borzenok S.A. Study of the antiviral activity of the liquid corneal storage medium in relation to the herpes simplex virus in vitro [Izuchenie protivovirusnoy aktivnosti zhidkikh sred dlya khraneniya rogovitsy v otnoshenii virusa prostogo gerpesa in vitro]. Voprosy virusologii. 2020; 65(4): 228-36. https:// doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-4-228-236 (in Russian)
20. Yunkerov V.I., Grigor'ev S.G. Mathematical and Statistical Processing of Medical Research Data [Matematiko-statisticheskaya obrabotka dannykh meditsinskikh issledovaniy]. St. Petersburg: VMedA; 2002. (in Russian)
21. Cotarelo M., Catalán P., Sánchez-Carrillo C., Menasalvas A., Cercenado E., Tenorio A., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. J. Antimicrob. Chemother. 1999; 44(5): 705-8. http:// doi.org/10.1093/jac/44.5.705
22. Kruppenbacher J.P., Klass R., Eggers H.J. A rapid and reliable assay for testing acyclovir sensitivity of clinical herpes simplex virus isolates independent of virus dose and reading time. An-
tiviral Res. 1994; 23(1): 11-22. https://doi.org/10.1016/0166-3542(94)90029-9
23. Novoselova E.A., Alimbarova L.M., Monakhova N.S., Lep-ioshkin A.Yu., Ekins S., Makarov V.A. In vivo activity of py-rimidine-dispirotripiperazinium in in the male guinea pig model of genital herpes. J. Virol. Antivir. Res. 2020; 9(1). https://doi. org/10.37532/jva.2020.9(1).193
24. Pshenichnikov V.A., Semenov B.F., Zezerov E.G. Standardization of Methods of Virological Research [Standartizatsiya metodov viruso-logicheskikh issledovaniy]. Moscow: Meditsina; 1974. (in Russian)
25. Kern E.R., Richards J.T., Overall J.C., Glasgow L.A. Acyclovir treatment of experimental genital herpes simplex virus infections. I. Topical therapy of type 2 and type 1 infections of mice. Antiviral Res. 1983; 3(4): 253-67. https://doi.org/10.1016/0166-3542(83)90004-9
26. Kern E.R., Palmer J., Szczech G., Painter G., Hostetler K.Y. Efficacy of topical acyclovir monophosphate, acyclovir, or penciclovir in orofacial HSV-1 infections of mice and genital HSV-2 infections of guinea pigs. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2000; 19(1-2): 501-13. https://doi.org/10.1080/15257770008033024
27. Andronova V.L., Jasko M.V., Kukhanova M.K., Galegov G.A., Skoblov Y.S., Kochetkov S.N. Study of Antiherpetic Efficiency of Phosphite of Acycloguanosine Ableto Over come the Barrier of Resistance to Acyclovir. Acta Naturae. 2016; 8(1): 74-81.
28. Rajpoot K. Acyclovir-loaded sorbitan esters-based organogel: development and rheological characterization. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol. 2017; 45(3): 551-9. https://doi.org/10.3109/21691401. 2016.1161639
29. Rodrigues L.N.C., Zanluchi J.M., Grebogi I.H. Percutaneous absorption enhancers: Mechanisms and potential. Braz. Arch. Biol. Technol. 2007; 50(6): 949-61. https://doi.org/10.1590/S1516-89132007000700006
