CC BY
30
Оригинальные статьи
ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ ЭНАНТИОМЕРОВ CPDA IN VITRO НА МОДЕЛИ ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА
A.B. Савинкова1, Л.Р. Тилова1, О.И. Борисова1, Е.М. Жидкова1, 2, К.А. Кузин1, К.И. Кирсанов1, Г.А. Белицкий1, И.В. Будунова3, М.Г. Якубовская1, Е.А. Лесовая1, 4
1ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24, стр. 15; 2Московский технологический университет; Россия, 119454 Москва, пр-т Вернадского, 78; 3 Северо-Западный университет; США, 60611 Чикаго, авеню Ист-Чикаго, 303; 4Рязанский государственный медицинский университет им. И.П. Павлова; Россия, 390026 Рязань, ул. Высоковольтная, 9
Введение. Глюкокортикоиды являются важным компонентом химиотерапии гемобластозов. Терапевтическое действие глюкокортикоидовреализуется посредством активации глюкокортикоидногорецептора (GR) по механизму транс-репрессии, развитие побочных эффектов связано с транс-активацией. Ранее было показано, что соединение класса селективных аго-нистов GR, CpdA, селективно запускает транс-репрессию в клетках лейкоза. CpdA представляет собой смесь 2 энантиоме-ров, которые могут по-разному взаимодействовать с рецептором. Цель исследования — синтез энантиомеров CpdA и оценка их биологических свойств.
Материалы и методы. Синтез энантиомеров был осуществлен на основании дигидроксилирования алкенов по Шарплессу; противоопухолевую активность in vitro определяли по антипролиферативному и проапоптотическому эффекту. Лигандные свойства оценивали путем ПЦР-анализа экспрессии глюкокортикоид- и NF-kB-зависимых генов.
Результаты и выводы. Продемонстрировано, что энантиомеры CpdA обладают противоопухолевым действием in vitro, а также не вызывают запуска транс-активации. Более того, S-энантиомер CpdA является более перспективным кандидатом для дальнейших исследований in vivo.
Ключевые слова: глюкокортикоидный рецептор, энантиомеры, гемобластозы, транс-активация, транс-репрессия, противоопухолевая активность
A. V. Savinkova1, L.R. Tilova1, O.I. Borisova1, E.M. Zhidkova1,2, K.A. Kuzin1, K.I. Kirsanov1, G.A. Belitsky', I. V. Budunova3,
M.G. Yakubovskaya1, E.A. Lesovaya14
1 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; bld. 15, 24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia;
2Moscow Technological University; 78 Vernadsky av., Moscow 119454, Russia;
3Northwestern University; 303 East Chicago av., Chicago 60611, USA;
4Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov; 9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026, Russia
Introduction. Glucocorticoids are the important component of combined chemotherapy of blood cancer. Therapeutic effects of glucocorticoids is realized via activation of glucocorticoid receptor transrepression, the development of side effects is associated with transactiva-tion. We demonstrated earlier that compound belonging the class of selective glucocorticoid receptor agonists, CpdA, selectively induced transrepression in blood cancer cells. CpdA represents a mixture of two enantiomers, which can differ in interaction with the receptor. Aim. The main aim of present study was to synthesize CpdA enantiomers and to evaluate their biological properties. Materials and methods. Synthesis was carried out based on Sharpless dihydroxylation; anti-tumor activity in vitro was evaluated by antiproliferative andpro-apoptotic effects. Ligandproperties were estimated by PCR-analysis of glucocorticoid- and NF-kB-dependent genes expression.
Results and conclusions. We demonstrated that CpdA enantiomers revealed anti-tumor activity in vitro and did not induce transacti-vation. Moreover, S-enantiomer of CpdA in the most tests demonstrated more pronounced activity and is more perspective molecule for future studies in vivo.
Key words: glucocorticoid receptor, enantiomers, hemoblastosis, transactivation, transrepression, anti-tumor activity
Контакты: Екатерина Андреевна Лесовая lesovenok@yandex.ru
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-1-61-69
ANTI-TUMOR EFFECT OF CPDA ENANTIOMERS IN VITRO IN THE MODEL OF ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA
62 Оригинальные статьи
Введение Материалы и методы Глюкокортикоиды являются важнейшим ком- Синтез энантиомеров CpdA. Синтез чистых энантио-понентом терапии ряда заболеваний, в том числе меров CpdA осуществлен на химическом факультете полихимиотерапии лейкозов у детей [1—7]. Однако МГУ им. М.В. Ломоносова на основании ассиметрич-их применение сильно ограничено развитием ре- ного дигидроксилирования алкенов по Шарплессу [19] зистентности, а также ряда серьезных метаболиче- (рис. 3) по следующей схеме. ских осложнений, в частности остеопороза, стеро- Стирол, защищенный ацетатной группой (3), идного диабета, нарушений водно-солевого обрабатывали коммерчески доступной реакционной обмена и др. [4, 5, 8—10]. Терапевтическое действие смесью AD-mix-p (тетраоксид осмия OsO4 в качестве глюкокортикоидов в основном реализуется через окислителя, гексацианоферрат (III) калия K3[Fe(CN)6] ДНК-независимую транс-репрессию — белок-бел- в качестве кооксиданта, карбонат калия KjCO3 в каковое взаимодействие GR с факторами транскрип- честве буфера для поддержания щелочной среды ции, что ингибирует активность данных факторов и аддукт фталазина с дигидрохинидином, позволяю-и приводит к снижению жизнеспособности опухо- щий получить чистый (R) — энантиомер CpdA; Sig-левых клеток [11 — 13]. Развитие побочных эффек- ma-Aldrich, США). Диол (4) обрабатывали в пириди-тов связано с запуском трансактивационного ме- не тозилхлоридом и N-Boc-N-метиламидом лития ханизма, при котором рецептор образует димер, и получали спирт (5). При обработке продукта (5) транслоцируется в ядро и связывается с палиндром- тионилхлоридом c последующим удалением Вос-за-ными последовательностями глюкокортикоид-ре- щитной группы при добавлении безводного хлоро-спонсивных элементов в промоторах антиапопто- водорода получали (R) — энантиомер CpdA. Получение тических, пролиферативных и провоспалительных (S) — энантиомера CpdA проводили по аналогичной генов, что приводит к усилению их транскрипции схеме с помощью реакционной смеси AD-mix-a (рис. 1а) [14—16]. (Sigma-Aldrich, США), где в качестве стереоселек- Использование селективных агонистов GR тивного катализатора использовали аддукт фталази-(SEGRA), которые, в отличие от глюкокортикои- на с дигидрохинином. Оценку чистоты полученных дов, не приводят к образованию димерного ком- энантиомеров проводили с использованием высоко-плекса рецептора и, соответственно, запускают эффективной жидкостной хроматографии с хираль-лишь транс-репрессорные механизмы, снижая ной неподвижной фазой. Данные, полученные после тем самым вероятность развития побочных эффек- хроматографии на хиральной неподвижной фазе, тов (рис. 1б), является перспективным направле- подтверждали образование R- и S-изомеров c энан-нием в гормональной терапии и химиотерапии тиомерным избытком 98 %. Спектр ЯМР 'H (400 гемобластозов. К классу SEGRA относится соеди- MHz, d6-DMSO): 2.23 м. д. (s., 3H); 2.51—2.52 (m. 3H); нение растительного происхождения 2-(4-ацеток- 3.19—3.27 (m., 2H), 4.88—4.91 (m., 1H); 6.83—6.85 (d., 2H); сифенил)-2-хлор^-метилэтиламмоний хлорид, 7.16—7.19 (d., 2H). или CpdA (рис. 2б). GR-зависимый противоопухо- Клеточные линии и обработка клеток. В работе левый эффект CpdA на моделях гемобластозов использовали клетки острого лимфобластного лей-in vitro и in vivo был продемонстрирован ранее коза линии СЕМ. Культура клеток СЕМ была получе-в отделе химического канцерогенеза НИИ канце- на в фазе обострения от пациентки с острым лимфо-рогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [17, 18]. бластным лейкозом [20—23]. Клетки культивировали Однако CpdA представляет собой рацемическую в стандартной среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), смесь из 2 энантиомеров (R и S) (рис. 2в), которые содержащей 5 % эмбриональную сыворотку телят могут обладать одинаковыми физико-химически- (РАА, Австрия) и гентамицин («ПанЭко», Россия) ми свойствами, но по-разному взаимодействовать (50 ед/мл) при 37 °С и в 5 % СО2. Клетки обрабаты-с GR и, следовательно, проявлять различную био- вали 1 мкМ дексаметазона (Dex, Sigma-Aldrich, США), логическую активность, что ранее не было изучено. 1мкМ CpdA или энантиомерами CpdA (R, S в кон-Данные особенности могут выступать причиной центрациях 1 мкМ). различия их фармакодинамических и фармакоки- Трансдукция клеток лентивирусными векторами. нетических свойств. Вирусные стоки высокого титра получали путем Таким образом, данное исследование было на- котрансфекции клеток линии 293Т лентивирусными правлено на изучение биологических эффектов векторами (плазмида pGreenPuro-shGR, несущая энантиомеров нестероидного лиганда GR, CpdA, короткую шпилечную РНК к гену GR, и контрольна модели острого лимфобластного лейкоза in vitro ная плазмида pGIPZ) (System Biosciences, США) с целью определения перспективности использова- совместно с упаковочной плазмидой psPAX2 (плаз-ния соединений данного класса в химиотерапии ге- мида № 12260) и плазмидами pCMV—VSV-G (плазмида мобластозов. № 8454) и pMD2.G (плазмида № 12259), кодирующими
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 1'2017 том 16 |voL. 16
Оригинальные статьи 63
Рис. 1. Механизмы действия глюкокортикоидов (а) и SEGRA (б) на примере CpdA
а
Ç1 Н
Рис. 2. Структурные формулы глюкокортикоида дексаметазона (а), CpdA (б) и энантиомеров CpdA (в). *Хиральный атом углерода в молекуле CpdA
jy:
1. OsO4 cat AD-mix-ß
AcO
ЗН 2. TsCl2 py
Oh 3. BocCH3NLi
ACO'
ОН Зое 4. SOCl2
^v-u 5 HCl (ЭД-энантиомер CH:î----CpdA
Рис. 3. Синтез чистых энантиомеров CpdA на основании ассиметричного дигидроксилирования алкенов по Шарплессу
б
в
оболочечные гликопротеины (Addgene, США). Транс-фекцию проводили с помощью реагента TransIT®—293 (Mirus-Bio, США) по протоколу производителя. Су-пернатант, содержащий вирусные частицы, собирали через 24—48 ч после трансфекции, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин и использовали для инфекции клеток СЕМ. В результате инфекции была получена стабильная линия клеток СЕМ-shGR, экспрессирующая короткую шпилечную РНК к гену GR, и контрольная линия CEM-pGIPZ. Далее полученные трансформированные клетки культивировали на селективной среде, содержащей антибиотик пуромицин, в течение 14—21 сут. Об эффективности трансдукции лентивирусных конструкций судили по интенсивности пролиферации клеток в среде с пуромицином, по интенсивности флуоресценции GFP (клетки исследовали на флуоресцентном микроскопе Zeiss, с использованием фильтра для GFP-флуоресценции при 400-кратном увеличении), а также по результатам иммуноблоттинга.
Иммуноблоттинг. Для проведения иммуноблот-тинга тотальные клеточные лизаты выделяли по методу, описанному ранее [7]. Концентрацию белка определяли с помощью реагента Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, США). Белки разделяли с помощью
электрофореза в полиакриламидном геле с SDS и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (LI—COR, США). Для иммуноблоттинга использовали антитела к GR-a (Santa Cruz Biotechnology, США). Для предотвращения неспецифической сорбции мембраны в течение 1 ч инкубировали с 5 % раствором блокирующего агента Blotto (Bio-Rad, США) в TBS-буфере (20 мМ Трис-HCl, pH 7.6, 150 мМ NaCl), затем инкубировали с первичными антителами в течение 6 ч при комнатной температуре. Для контроля загрузки и переноса мембраны инкубировали с антителами к GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, США). Мембраны отмывали и инкубировали в течение 1 ч с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, образовавшиеся комплексы проявляли хемилюми-несцентным реагентом (все реактивы Amersham, Великобритания). Количественный анализ проводился путем денситометрического сканирования с использованием компьютерной программы Image Quant for Windows.
Определение антипролиферативного эффекта.
Антипролиферативный эффект определяли путем прямого подсчета клеток. Клетки культивировали в 24-луночном планшете в присутствии исследуемых соединений или растворителя (0,1 % этанола или
Условия проведения ПЦР и последовательность используемых праймеров
Праймер Последовательность Размер продукта
прямой праймер обратный праймер
FKBP51 5'-gaatggtgaggaaacgccgat-3' 5'-tgccaagactaaagacaaatggt-3' 250
GILZ 5'-cagcccgagccatgaacacc-3' 5'-cgcagaaccaccaggggcct-3' 144
CCND1 5'-gctggagcccgtgaaaaaga-3' 5'-ctccgcctctggcattttg-3' 135
CCND2 5'-ctaccttccgcagtgctccta-3' 5'-cccagccaagaaacggtcc-3' 161
RPL27 5'-accgctacccccgcaaagtg-3' 5'-cccgtcgggcct tgcgttta-3' 125
Оригинальные статьи
65
ДМСО); подсчет клеток проводили через 24 ч после обработки. Каждая экспериментальная или контрольная группа состояла из 3 лунок.
определение уровня апоптоза. Уровень апоптоза определяли с помощью метода проточной цитофлуо-риметрии после окраски йодистым пропидием (PI), для чего клетки центрифугировали, осадок суспендировали в 1 мл раствора, содержавшего 5 мкг/мл PI, 0,1 % цитрата натрия и 0,3 % NP-40. Полученные образцы анализировали на проточном цитофлуори-метре FACSCalibur. Число апоптотических клеток определяли как пре^1-пик на ДНК-гистограмме.
количественная амплификация с помощью поли-меразной цепной реакции (ПЦр), сопряженная с обратной транскрипцией. Для обратной транскрипции использовали набор MMLV Reverse Transcriptase, случайные праймеры, смесь для ПЦР (Invitrogen, США) и тотальную РНК, выделенную с помощью набора для выделения РНК RNAeasy kit (Qiagen, США). Количественный ПЦР-анализ в режиме реального времени проводили с использованием ПЦР-анали-затора Bio-Rad iQ5. Программа амплификации была следующей: 95 °C — 10 мин, 40 циклов (95 °C — 15 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 30 с). Относительное изменение экспрессии исследуемой мРНК вычисляли методом ДДО, где ДДО определяли путем вычитания среднего ДО; контроля из ДО экспериментальных образцов [24]. В качестве контроля использовали ген рибосом-ного белка L27 (Rpl27). Праймеры для амплификации были сконструированы с помощью базы данных Primer-Bank (http: //pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) и пакета программ Oligo 6. Последовательности прай-меров приведены в таблице.
Статистическая обработка данных. Все эксперименты повторены трижды. Средние значения и среднеквадратичное отклонение рассчитывали с помощью пакета программ Microsoft Excel и сравнивали с парным двухвыборочным t-тестом Стьюдента для средних. Во всех случаях статистические критерии считали достоверными прир < 0,05.
Результаты и обсуждение
GR-зависимый противоопухолевый эффект энантиомеров CpdA in vitro на модели острого лимфобластного лейкоза
Согласно терминологии, используемой в современной литературе, противоопухолевое действие препарата in vitro (т. е. клеточные культуры) включает способность препарата подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в клетках линии интересующей нозологической формы злокачественного новообразования. Линия острого лимфобластного лейкоза СЕМ использовалась в исследованиях нашей лаборатории ранее. Было показано, что GR в данной клеточной линии экспрессируется на достаточно
высоком уровне, его ген не несет в себе мутаций, функциональная активность рецептора также была подтверждена ранее [10, 11, 23, 25].
Для доказательства того, что антипролифератив-ное действие энантиомеров CpdA реализуется через GR, нами была получена сублиния клеток СЕМ-shGR со сниженной экспрессией рецептора при помощи коротких шпилечных РНК к гену GR, как было описано ранее [23]. В качестве контрольной сублинии клеток использовали клетки СЕМ-pGIPZ, полученные с помощью лентивирусной трансдукции плазмиды pGIPZ в геном клеток СЕМ. На рис. 4а, б представлены результаты иммуноблоттинга тотальных клеточных лизатов данных сублиний и денсито-метрический анализ полученных данных. Можно увидеть, что экспрессия GR в клетках СЕМ-shGR снизилась на ~ 90 %.
Определение антипролиферативного эффекта проводили в течение 24-часовой инкубации с растворителем, Dex, CpdA или энантиомерами CpdA (R, S) с помощью прямого подсчета клеток. Рабочие концентрации CpdA и Dex эквимолярны (1 мкМ), поскольку данные соединения обладают сходной аффинностью к GR [26] и определены нами ранее [11, 25]. Рабочие концентрации энантиомеров CpdA были эквимолярны концентрации рацемата, так как по химической структуре, а следовательно, по молекулярной массе данные соединения абсолютно идентичны. Количество жизнеспособных клеток линии CEM-pGIPZ после обработки Dex в течение 24 ч составило 69,1 ± 8,3 %, после обработки CpdA — 54,7 ± 4,2 %. Количество жизнеспособных клеток линии CEM-pGIPZ после обработки энантиомерами CpdA составило 57,2 ± 8,2 % после обработки S-энантиомером CpdA в течение 24 ч, а после аналогичной обработки R-энантиомером CpdA — 43,8 ± 7,4 % (рис. 4в). В то же время антипролиферативный эффект всех исследуемых соединений на клетки с подавленной экспрессией GR был гораздо менее выражен. Количество жизнеспособных клеток линии CEM-shGR после обработки Dex в течение 24 ч составило 87,3 ± 7,6 %, после обработки рацематом CpdA — 86,0 ± 4,6 %. Количество жизнеспособных клеток линии CEM-shGR после обработки энантиомерами CpdA составило 80,0 ± 11,8 % после обработки S-энантиомером CpdA в течение 24 ч, а после аналогичной обработки R-CpdA — 83,3 ± 9,4 % (рис. 4в).
Таким образом, был продемонстрирован GR-зависимый антипролиферативный эффект энантио-меров CpdA, сопоставимый с антипролиферативным действием глюкокортикоидов, а также ранее исследованным антипролиферативным эффектом рацемической смеси CpdA [11, 25].
При исследовании проапоптотического эффекта энантиомеров CpdA с помощью проточной цитофлуо-
GR
GAPDH
2 с;
120 -100 -80 -60 -40 -20 -0
m
CEM-pGIPZ CEM-shGR
о
vo ^
о
Œ
О
с; о
400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 -0
□ CEM-pGIPZ ■ CEM-shGR
# #
S § ï ! ! °
о
ü с
400 -
350 -
300 -
250 -
200 -
150 -
100 -
50 -
Ctrl Dex ' CpdA R-CpdA S-CpdA
Ctrl
Dex CpdA R-CpdA S-CpdA
рис. 4. GR-зависимый противоопухолевый эффект энантиомеров CpdA in vitro: а - оценка экспрессии GR в клетках СЕМ после трансдукции лентивирусных конструкций pGF-shGR и pGIPZ методом иммуноблоттинга. Для оценки эффективности нанесения экстрактов на нитроцеллюлозную мембрану использовали иммуноблоттинг с антителами к GAPDH; б — денситометрический анализ данных иммуноблоттинга. На графике представлена интенсивность полос в долях единицы, нормализованная относительно GAPDH; в — антипролиферативный эффект энантиомеров CpdA на клетки CEM. Количество жизнеспособных клеток определяли с помощью прямого подсчета. Представлено количество живых клеток после обработки 1 мкМ Dex, 1 мкМ CpdA или энантиомеров CpdA (R, S в концентрациях 1мкМ) в процентах от контроля, обработанного растворителем; * — статистически достоверное отличие от контроля (p < 0,05), # - статистически достоверное отличие количества жизнеспособных клеток СЕМ-shGR от CEM-pGIPZ; г — проапоптотический эффект энантиомеров CpdA в клетках СЕМ. Анализ проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Об индукции апоптоза судили по количеству клеток в пре^1-фазе; * — статистически достоверное отличие от контроля (p < 0,05)
б
а
в
г
0
риметрии показано, что в клетках СЕМ инкубация с Dex, CpdA и с обоими энантиомерами CpdA вызывала запуск апоптоза в клетках острого лимфобласт-ного лейкоза СЕМ.
Количество клеток, находящихся в пре-Gj фазе, после обработки Dex в течение 24 ч составило 210,5 ± 4,5 % относительно контроля, после обработки рацемической смесью CpdA — 178,9 ± 2,6 %. В то же время после обработки R- и S-энантиомерами количество клеток, находящихся в пре-Gj фазе, составило 310,5 ± 2,6 % и 352,6 ± 5,3 % соответственно. Необходимо отметить, что степень индукции апоп-тоза обоими энантиомерами была значительно выше данного показателя, полученного при обработке клеток рацематом CpdA или дексаметазоном.
Проапоптотический эффект энантиомеров CpdA на клетки острого лимфобластного лейкоза СЕМ
коррелировал со степенью подавления роста и жизнеспособности данных клеток при инкубации с этими соединениями. Таким образом, можно сделать следующий вывод: антипролиферативный эффект энантиомеров CpdA связан с запуском апоптоза, причем R- и S-энантиомеры обладают более выраженным проапоптотическим эффектом, чем их рацемическая смесь или Dex.
транс-репрессорный и транс-активационный потенциал энантиомеров CpdA
ДНК-независимая транс-репрессия, запускаемая GR, обусловлена белок-белковым взаимодействием GR с другими транскрипционными факторами, такими как NF-kB, AP-1, Ets-1, Elk-1, SRF, CRE/ ATF и NFATc [26]. Мы исследовали транс-репрес-сорный потенциал энантиомеров CpdA в сравнении
Оригинальные статьи 67
с рацемической смесью CpdA и дексаметазоном с помощью количественной ПЦР генов, регулируемых как NF-kB, так и АР-1 — регуляторов клеточного цикла циклинов D1 и D2, содержащих в промо-торной области сайты связывания NF-^B.
При обработке Dex клеток линии CEM экспрессия гена CCND1 снизилась в 3,1 раза, в то время как при обработке CpdA этот показатель снизился в 1,7 раза. При обработке S- и R-энантиомерами экспрессия того же гена в клетках была подавлена в 1,3 и 2,2 раза соответственно (рис. 5а).
Экспрессия гена CCND2 после обработки Dex и CpdA возросла на 20 %, однако это увеличение было статистически недостоверным. При обработке S- и R-энантиомерами экспрессия указанного гена незначительно снизилась по сравнению с рацемической смесью в 1,2 и 1,3 раза соответственно (рис. 5б).
Так, было показано, что энантиомеры CpdA обладают более высоким транс-репрессорным потенциалом, чем рацемическая смесь.
Запуск транс-активационного механизма GR в клетке происходит при связывании гомодимера рецептора с палиндромными последовательностями нукле-отидов в ДНК — глюкокортикоид-респонсивных элементов. Это приводит к ацетилированию гисто-нов, уменьшению плотности хроматина, что увеличивает доступ к ДНК фермента РНК-полимеразы II, катализирующего синтез мРНК [27]. Таким образом, в клетке активируются процессы транскрипции генов и образования белков, обладающих про-пролифера-тивным и антиапоптотическим действием. В данной работе мы исследовали транс-активационный потенциал энантиомеров СрёА путем оценки изменения экспрессии GR-зависимых генов, несущих в своих
1,4 -
1,2 -
1 -
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
CCND1
Ctrl
Dex
CpdA S-CpdA R-CpdA
б
<u и о v
1,4 -
1,2 -
1 -
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
CCND2
Ctrl
Dex CpdA S-CpdA R-CpdA
w CP
7 -
6 -
5 -
4 -
3 -
2 -
1 -
GILZ
* #
Ctrl
Dex
CpdA S-CpdA R-CpdA
w CP
7 -
6 -
5 -
4 -
3 -
2 -
1 -
FKBP51
* # #
Ctrl
Dex CpdA S-CpdA R-CpdA
Рис. 5. Влияние энантиомеров CpdA на запуск транс-репрессии (а, б) и транс-активации (в, г) в клетках СЕМ. Клетки культивировали в течение 1 ч (CCND1), 4 ч (CCND2) и 24 ч (GILZ и FKBP51) в присутствии растворителя, 1 мкМDex, 1мкМ CpdA или энантиомеров CpdA (R, S в концентрациях 1 мкМ). Уровень экспрессии генов определяли методом количественной ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. Количество ПЦР-продуктов оценивали и нормализовали по количеству ПЦР-продуктарибосомного белка L27(Rpl27); * — статистически достоверное отличие от контроля (р < 0,05), # — статистически достоверное отличие экспрессии генов GILZи FKBP51 от экспрессии данных генов в клетках, обработанных Dex
а
0
0
в
г
0
0
промоторах респонсивные элементы глюкокортико-идов с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией. На основании данных литературы о профилях экспрессии генов после обработки глюко-кортикоидами [28] в качестве таких характеристических генов мы выбрали гены белка 51, связывающего FK506 (FK506 Binding Protein 51, FKBP51), и белка Glucocor-ticoid-Induced Leucine Zipper (GILZ).
Исследовали изменение экспрессии генов FKPB51 и GILZ при обработке Dex, CpdA и энантиомерами CpdA клеток CEM. Для каждого из этих генов в литературе подробно описаны последовательности глюкокортикоид-респонсивных элементов и отмечено возрастание экспрессии после обработки глюкокор-тикоидами [28—32]. Количество мРНК вышеперечисленных генов сильно возрастало после обработки Dex в 6,1 и 5,5 раза для FKPB51 и GILZ соответственно, в то время как при инкубации клеток CEM с CpdA экспрессия этих генов не изменялась (рис. 5в, г). Экспрессия гена FKPB51 при обработке клеток CEM S-энантиомером CpdA снижалась в 2 раза, экспрессия гена GILZ — в 3 раза (рис. 5в, г). Однако в присутствии R-энантиомера экспрессия гена GILZ незначительно повышалась (на 10 и 20 % соответственно), но эти показатели были статистически неотличимы от контроля (рис. 5в, г). Необходимо отметить, что ген FKPB51 является не только маркером транс-активации, он играет важную роль в развитии резистентности к глюкокортикоидам. Для гена GILZ описано его антиапоптотическое действие в Т-лимфоцитах [11, 25]. Таким образом, поскольку S-энантиомер CpdA не увеличивает экспрессию данных генов или подавляет ее, то можно рассматривать S-CpdA как более безопасный агонист GR, не вызывающий развитие резистентности.
Таким образом, энантиомеры CpdA по своему эффекту на экспрессию GR-зависимых генов FKBP51 и GILZ отличаются от рацемической смеси CpdA. В частности, S-энантиомер проявил большую
способность к подавлению транс-активации и запуску транс-репрессии по сравнению с рацемической смесью. Различия в биологических свойствах энантиомеров CpdA обусловлены, как нам представляется, различиями в конформации образовавшегося комплекса «лиганд-рецептор», и следовательно, различной аффинностью к транскрипционными факторам, с которыми взаимодействует активированный GR.
Заключение
Данная работа показывает, что в клетках острого лимфобластного лейкоза СЕМ энантиомеры CpdA проявляют GR-зависимый антипролиферативный эффект в большей степени, чем рацемат CpdA и дек-саметазон, использовавшиеся в качестве положительного контроля. Антипролиферативный эффект энантиомеров CpdA обусловлен, с одной стороны, развитием апоптоза, а с другой — селективным запуском транс-репрессии, в результате которой снижалась пролиферативная активность злокачественных клеток кроветворной системы.
Таким образом, энантиомеры CpdA проявляют GR-зависимый противоопухолевый эффект in vitro на модели острого лимфобластного лейкоза. Энан-тиомеры CpdA способны селективно запускать транс-репрессию GR, не индуцируя механизм трансактивации, что снижает риск развития побочных эффектов, а также резистентности к данным соединениям. Биологические эффекты S-энантиомера CpdA на клетки острого лимфобластного лейкоза СЕМ более выражены по сравнению с глюкокортикоидом дексаметазоном, рацемической смесью и R-CpdA. Следовательно, S-CpdA является более перспективным кандидатом для дальнейших исследований in vivo.
Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ 15- 04- 04006, 16- 04- 01410 и гранта фонда «Династия».
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Басов П.В. Влияние глюкокортико-идных гормонов на Т-лимфоциты
у больных туберкулезом легких. Проблемы туберкулеза 1990;1:30-3.
2. Витовская О.П. Медикаментозно индуцированная глаукома. Офтальмологические ведомости 2014;7(3):58-62.
3. Иванова А.А. Механизмы антилейке-мического действия и возможные пути развития резистентности
при использовании глюкокортикои-дов в терапии острых лейкозов (обзор
литературы). Гематология и транс-фузиология 2000;45(2):12-5.
4. Спичак И.И., Богачева М.В., Билялутдинова Д.И. и др. Частота стероидного диабета на программной полихиомиотерапии у детей с лим-фобластным лейкозом. Педиатрический вестник Южного Урала 2014; 1-2:30-3.
5. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Глю-кокортикоидные препараты. Методическое пособие. Смоленск, 1997.
6. Cutolo M. Glucocorticoids and chronotherapy in rheumatoid arthritis. RMD open 2016;2(1):1-10.
DOI: 10.1136/rmdopen-2015-000203. PMID: 27042335.
7. Klaustermeyer W.B.,
Choi S.H. A perspective on systemic corticosteroid therapy in severe bronchial asthma in adulds. Allergy Asthma Proc 2016;37(3):192-8. DOI: 10.2500/aap.2016.37.3941. PMID: 27178888.
Оригинальные статьи 69
8. Топорова И.Ю., Паровичникова Е.Н., Клясова Г.А. и др. Частота развития и структура инфекционных осложнений, возникающих у больных
с гемобластозами на различных этапах программной химиотерапии. Гематология и трансфузиология (приложение) 2012;54.
9. Lekva T., Bollerslev T.J., Kristo C. et al. The glucocorticoid-induced leucine zipper gene (GILZ) expression decreases after successful treatment of patients with endogenous Cushing's syndrome and may play a role in glucocorticoid-induced osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab 2010;V(1):246-55.
DOI: 10.1210/jc.2009-0595. PMID: 19875485.
10. Thompson E.B., Harmon J.M. Glucocorticoid receptors and glucocorticoid resistance in human leukemia in vivo and in vitro. Adv Exp Med Biol 1986;196:111-27.
DOI: 10.1007/978-1-4684-5101-6_8. PMID: 3521219.
11. Лесовая Е.А., Емельянов А.Ю., Кирсанов К.И. и др. Противоопухолевое действие нестероидного лиган-да глюкокортикоидного рецептора, CpdA, на клетки линий Т-клеточного лейкоза. Биохимия (Москва) 2011;76(11):1242-52.
12. Polman J.A., de Kloet E.R., Datson N.A. Two populations
of glucocorticoid receptor-binding sites in the male rat hippocampal genome. Endocrinology 2013;154(5):1832-44. DOI: 10.1210/en. 2012-2187. PMID: 23525215.
13. Ray A., Prefontaine K.E. Physical association and functional antagonism between the p65 subunit of transcription factor NF-kappa B and
the glucocorticoid receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91(2):752-6. PMID: 8290595.
14. Хаитов Р.М., Ильина Н.И. Аллергология и иммунология. Национальное руководство. М.: ГОЭТАР-Медиа, 2012. 633 с.
15. Hudson W.H., Youn C., Ortlund E.A. The structural basis of direct glucocorticoid-mediated transrepression. Nat Struct Mol Biol 2013;20(1):53-8.
DOI: 10.1038/nsmb. 2456. PMID: 23222642.
16. Surjit M., Ganti K.P., Mukherji A. et al. Widespread negative response elements mediate direct repression by agonist-leganded glucocorticoid receptor. Cell 2011;145(2):224-41.
DOI: 10.1016/j. cell. 2011.03.027. PMID: 21496643.
17. Bosscher de K., Haegeman G., Elewaut D. Targeting inflammation using selective glucocorticoid receptor modulators. Curr Opin Pharmacol 2010;10(4):497-504.
DOI: 10.1016/j. coph. 2010.04.007. PMID: 20493772.
18. Lesovaya E., Yemelyanov A., Swart A.C. et. al. Discovery of Compound A —
a selective activator of the glucocorticoid receptor with anti-inflammatory and anti-cancer activity. Oncotarget 2015;6(31):30730—44. DOI: 10.18632/oncotarget. 5078. PMID: 26436695.
19. Sharpless K.B., Amberg W., Bennani Y.L. et al. The osmium-catalyzed asymmetric dihydroxylation: a new ligand class and process improvement. JOC 1992;57(10):2768—71. DOI: 10.1021/jo00036a003.
20. Antakly T., Eisen H.J. Immunocytochemical localization
of the glucocorticoid receptor in steroid-sensitive and -resistant human leukemic cells. Cancer Res 1990;50(4):1337—45. PMID: 2404592.
21. Foley G.E., Lazarus H., Farber S. et al. Continuous culture of human lymphoblasts from peripheral blood
of a child with acute leukemia. Cancer 1965;18:522—9. PMID: 14278051.
22. Norman M.R. Thompson E.B. Characterization of a glucocorticoid-sensitive human lymphoid cell line. Cancer Res 1977;37(10):3785—91. PMID: 269011.
23. Thompson E.B., Medh R.D., Zhou F. et al. Glucocorticoids, oxysterols, and cAMP with glucocorticoids each cause apoptosis of CEM cells and suppress c-myc. J Steroid Biochem Mol Biol 1999;69(1—6):453—61. PMID: 10419025.
24. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M. et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine 2006;27:95—125. DOI: 10.1016/j. mam. 2005.12.007. PMID: 16460794.
25. Lesovaya E., Yemelyanov A., Kirsanov K. et al. Combination of a selective activator
of the glucocorticoid receptor Compound A with a proteasome inhibitor as a novel strategy for chemotherapy of hematologic malignancies. Cell Cycle 2013;12(1):133—44. DOI: 10.4161/cc. 23048. PMID: 23255118.
26. Yemelyanov A., Czwornog J., Gera L. et al. Novel steroid receptor phyto-modulator compound A inhibits growth and survival of prostate cancer cells. Cancer Res 2008;68(12):4763—73. DOI: 10.1158/0008—5472. CAN-07—6104. PMID: 18559523.
27. Adcock I.M. Molecular mechanisms of glucocorticosteroid actions. Pulm Pharmacol Ther 2000;13(3):115—26. DOI: 10.1006/pupt. 2000.0243. PMID: 10873549.
28. Chauhan D., Auclair D., Robinson E.K. et al. Identification of genes regulated by dexamethasone in multiple myeloma cells using oligonucleotide arrays. Oncogene 2002;21(9):1346—58.
DOI: 10.1038/sj.onc.1205205. PMID: 11857078.
29. Bruscoli S., Donato V., Velardy E. et al. Glucocorticoid-induced leucine zipper (GILZ) and long GILZ inhibit myogenic differentiation and mediate anti-myogenic effects of glucocorticoids.
J Biol Chem 2010;285(14):10385—96. DOI: 10.1074/jbc.M109.070136. PMID: 20124407. PMCID: PMC2856245.
30. Kochel I., Strzadala L. FK506-binding proteins in the regulation of transcription factors activity in T cells. Postepy Hig Med Dosw 2004;58:118—27.
PMID: 15077060.
31. Shipp L.E., Lee J.V., Yu C.Y. et al. Transcriptional regulation of human dual specificity protein phosphatase 1(DUSP1) gene by glucocorticoids. PLoS One 2010;5(10):13754.
DOI: 10.1371/journal.pone.0013754. PMID: 21060794.
32. Tchen C.R., Martins J.R., Paktiawal N. et al. Glucocorticoid regulation of mouse and human dual specificity phosphatase 1(DUSP1) genes: unusual cis-acting elements and unexpected evolutionary divergence. J Biol Chem 2010;285(4):2642—52.
DOI: 10.1074/jbc.M109.037309. PMID: 19940143.
