CC BY
187
УДК 577.151:616.006.04
Противоопухолевое и антиметастатическое действие РНКазы А и ДНКазы I
О.А. Патутина1, Н.Л. Миронова1, Е.И. Рябчикова1, Н.А. Попова2, В.П. Николин2, В.И. Каледин2, В.В. Власов1, М.А. Зенкова1*
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 8
2 Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 11 *E-mail: marzen@niboch.nsc.ru
РЕФЕРАТ В данной работе на двух моделях метастазирующих опухолей мышей, карциноме легких Льюис и ге-патоме А1 исследовано противоопухолевое и антиметастатическое действие РНКазы А и ДНКазы I. Обнаружено, что РНКаза А при внутримышечном введении в дозах 0.1-50 мкг/кг замедляет рост первичной опухоли на 20-40 %, а при повышении дозы до 0.5 мг/кг и выше эффект исчезает. Противоопухолевой активности ДНКазы I обнаружено не было. Внутримышечное введение РНКазы А (0.35-7 мкг/кг) или ДНКазы I (0.02-2.3 мг/кг) приводит к значительному снижению числа метастазов в легких у животных с карциномой легких Льюис и снижению печеночного индекса у животных с гепатомой А1. Гистологическое исследование органов показало, что введение РНКазы А или ДНКазы I приводит к патоморфозу метастазов, что выражается в разрушении опухолевых клеток, увеличении числа некрозов и апоптозов в очагах метастазирования, а также их инфильтрации лимфоцитами. Полученные данные показывают, что РНКаза А и ДНКаза I могут быть использованы в качестве терапии сопровождения при лечении метастазирующих форм опухолей.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА антиметастатическая активность, ДНКаза I, РНКаза А, карцинома легких Льюис, гепатома 1А. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ карцинома легких Льюис (LLC), гепатома 1А (HA-1).
ВВЕДЕНИЕ
Недавно полученные данные об участии малых некодиру-ющих РНК в канцерогенезе [1-3] и опухолеспецифических ДНК в метастазировании («геном-генометастатическая гипотеза») [4] позволили по-новому взглянуть на ферменты, способные расщеплять нуклеиновые кислоты, как на возможные противоопухолевые и антиметастатические препараты.
В мире широким фронтом ведутся исследования противоопухолевого потенциала экзогенных рибонуклеаз. На сегодняшний день продемонстрирован высокий противоопухолевый потенциал BS-РНКазы [5-8] и онконазы [9-11], относящихся к семейству РНКазы А. Однако первые исследования противоопухолевой активности рибонуклеаз этого семейства были проведены именно с РНКазой А [1214]. Полученные в этих экспериментах данные оказались противоречивыми. В ряде работ была продемонстрирована ее высокая противоопухолевая активность [12, 13], тогда как в других - полное отсутствие [14, 15]. Исследователи связывали отсутствие противоопухолевого действия РНКа-зы А с ее инактивацией под действием рибонуклеазного ингибитора [16, 17], взаимодействия с которым способны избегать онконаза и BS-РНКаза и за счет этого оказывать цитотоксическое действие на опухолевые клетки [18-20]. Антиметастатический потенциал ДНКазы I был продемон-
стрирован in vivo на модели опухоли L5178Y-ML, метаста-зирующей в печень [21, 22]. Однако использование ДНКазы I в качестве агента адьювантной терапии при лечении рака не получило распространения.
В данной работе на двух моделях опухолей мышей -карциноме легких Льюис (LLC), метастазирующей в легкие, и гепатоме 1А (НА-1), метастазирующей в печень, мы исследовали противоопухолевое и антиметастатическое действие ферментов РНКазы А и ДНКазы I. Оказалось, что внутримышечное введение РНКазы А в диапазоне доз 0.1-50 мкг/кг приводит к замедлению роста опухоли на 20-40 %. Введение РНКазы А или ДНКазы I приводит к двух-трехкратному снижению количества метастазов в легких (в случае LLc) и снижению печеночного индекса (в случае НА-1). Проведенный гистологический анализ показал, что введение ферментов приводит к разрушению опухолевых клеток, увеличению числа некрозов и апоп-тозов в очагах метастазирования и их инфильтрации лимфоцитами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали РНКазу А (13700 г/М) и ДНКазу I (2.155 KU/мг) производства Sigma (USA); [у-32Р]аденозин-5'трифосфат ([у-32Р]АТР) (3000 Ки/ммоль) производства компании «Биосан» (Россия), Т4 полинуклеотидкиназу
фирмы Fermentas (Литва). Плазмида pHIV-2 была любезно предоставлена профессором Г.Дж. Гроссом (University of Wuerzburg, Wuerzburg, Germany).
Опухолевые штаммы LLC и HA-1 были получены из вивария Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия.
Введение радиоактивной метки по 5'-концу фрагмента РНК HIV-1, полученного с помощью транскрипции in vitro, проводили с помощью y-32P АТФ и Т4 полинуклеотидкина-зы [23].
Определение ферментативной активности РНКазы А. Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую 50 000 cpm 5'-[32Р]-меченной РНК, 10-10-10-7 M РНКазы А, 50 мМ Tris - HCl, pH 7.0, 200 мМ KCl, 1 мМ EDTA и 100 мкг/мл РНК-носителя, инкубировали при 37 °C в течение 1-15 мин. После окончания инкубации реакционные смеси экстрагировали фенолом, и РНК из водной фазы осаждали 96 %-ным этанолом. Продукты расщепления РНК анализировали с помощью электрофореза в 12 %-ном денатурирующем полиакриламидном геле.
Определение ферментативной активности ДНКазы I.
Реакционную смесь объемом 10 мкл, содержащую 0.2 мкг плазмидной ДНК pHIV-2, 0.01-1 ед. акт. ДНКазы I, 10 мМ Tris - HCl, pH 7.5, 2.5 мМ MgCl2 и 0.1 мМ CaCl2, инкубировали при 37 °C в течение 1-15 мин. Реакцию останавливали нагреванием реакционной смеси при 60 °C в течение 10 мин. Продукты расщепления ДНК анализировали электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле.
Опухолевые модели. Самок мышей C57B1/6 (возрастом 1011 недель) и самок мышей A/Sn (возрастом 12-14 недель) содержали группами по 8-10 особей в пластиковых клетках в условиях нормального освещения. Животные имели свободный доступ к воде и пище. Все процедуры с животными проводили в соответствии с одобренными методиками и рекомендациями для обращения с лабораторными животными [European Communities Council Directive 86/609/CEE].
Для развития опухолей LLC или HA-1 в солидной форме опухолевые клетки LLC или HA-1 (106 кл./животное) внутримышечно прививали мышам С57Bl/6J или A/Sn, соответственно, в бедренную мышцу.
Исследование влияния внутримышечного введения РНКазы А и ДНКазы I на первичную опухоль и метастазы. На 4-й или 8-й день после имплантации клеток опухоли LLC мышам C57Bl/6J животных делили на группы и проводили ежедневные внутримышечные инъекции: группе 1 (контроль) - физиологического раствора, группам 2-9 -РНКазы А в физиологическом растворе (0.1 мл) в дозах 0.1, 0.5, 1, 10, 50 мкг/кг и 0.5, 1 и 10 мг/кг, соответственно; группам 10-13 - ДНКазы I в физиологическом растворе (0.1 мл) в дозах 0.02, 0.23, 1.15 и 2.3 мг/кг, соответственно.
В случае НА-1 на 8-й день после имплантации клеток опухоли HA-1 мышам линии A/Sn животных делили на группы и проводили внутримышечные инъекции: группе 1 (контроль) - физиологического раствора, группам 2-4 - РНКазы А в физиологическом растворе (0.1 мл) в дозах 0.35, 0.7 и 7 мкг/кг, соответственно; группам 5-9 - ДНКазы I в физиологическом растворе (0.1 мл) в дозах 0.02, 0.23, 1.15 и 2.3 мг/кг, соответственно.
В течение эксперимента животные получали 8-10 инъекций растворов ферментов или физиологического раство-
ра. Размер опухолей измеряли с помощью штангенциркуля каждые три дня, и объем опухолей рассчитывали по формуле: V = (п/6 х длина х ширина х высота) [24].
На 20-й день после имплантации опухолей животных подвергали эвтаназии путем дислокации шейных позвонков. Печень мышей A/Sn с HA-1 взвешивали и определяли печеночный индекс (HI) по формуле HI = (вес печени / вес мыши) х 100 %. Средний прирост веса печени (ALI) за время развития опухоли считали как разницу между средним значением HI в экспериментальной группе и HI здоровых животных, который равен 4.5 % для мышей A/Sn. Эффективность лечения (TE) считали по формуле TE (%) = 100 -ALI / ALI х 100 %.
эксп ' контроль
Легкие животных с LLC и печень животных с НА-1 фиксировали в 4 %-ном параформальдегиде для дальнейшего гистологического анализа. Количество метастазов в легких животных с LLC подсчитывали под бинокуля-ром.
Гистологический анализ. Фиксированные легкие и печень обрабатывали обычным способом и заливали в парафиновые блоки. Гистологические срезы (толщиной 5 мкм) получали с помощью микротома и окрашивали гематоксилином и эозином. Патоморфологическое исследование препаратов проводили с помощью визуализации под микроскопом Axioimager Z (ZEISS).
Статистический анализ. В случае когда данные отвечали условиям нормальности, статистическую обработку выполняли, используя критерий Стьюдента. В иных случаях статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического анализа, используя критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p < 0.05.
результаты и обсуждение
Выбор диапазона доз РНКазы А и ДНКазы I для экспериментов in vivo.
Поскольку предполагалось, что ферментативная активность РНКазы А и ДНКазы I важны для проявления ими противоопухолевого действия, в экспериментах in vitro были определены концентрации ферментов, при которых достигается 50 %-ное расщепление субстрата за относительно короткое время.
Для этого [5'-32Р]-РНК (10-5 М) инкубировали в присутствии 10-10-10-7 M РНКазы А при 37 °C в течение 1-15 мин. Анализ кинетики расщепления РНК показал, что 50 %-ное расщепление субстрата достигается при концентрации РНКазы А 10-9 М за 10 мин. Аналогично было найдено, что 50 %-ное расщепление ДНК-субстрата достигается при концентрации ДНКазы I 10 ед акт./мл за 1 мин. Эти концентрации РНКазы А и ДНКазы I были взяты в качестве исходных для выбора диапазона доз ферментов в экспериментах in vivo.
влияние рнказы а и днказы I на рост первичной опухоли
Внутримышечное введение РНКазы А мышам C57Bl/6J
с LLC. Способность РНКазы А влиять на рост первичной опухоли была исследована в экспериментах на мышах C57Bl/6J с LLC. На 4-й день после трансплантации опухоли животные получали ежедневные внутримышечные инъекции физиологического раствора (контроль) или рас-
твора РНКазы А в диапазоне доз от 0.1 мкг до 10 мг на кг веса животного (эксперимент).
На рис. 1А представлено изменение размеров опухолей в течение эксперимента в зависимости от дозы РНКазы А. Как видно из представленных данных, в группах животных с LLC, получавших лечение РНКазой А в дозах 0.5-50 мкг/ кг, наблюдается замедление роста опухолей. На 8-й день после трансплантации LLC объем опухоли в этих группах мышей был на 20-40 % меньше, чем в контроле. К 11-му дню объем опухолей в тех же группах был меньше на 2333 %, а к 13-му дню - на 16 % меньше, чем размер опухолей в контроле. В группах животных, получавших лечение РНКазой А в дозах свыше 0.5 мг/кг, ингибирования роста опухоли не наблюдалось (рис. 1А).
Внутримышечное введение РНКазы А мышам A/Sn с HA-1.
Для того чтобы проверить, что противоопухолевая активность РНКазы А не является специфичной для конкретного типа опухоли, была исследована противоопухолевая активность этого фермента и на другой модели опухоли, гепатоме А1, на мышах A/Sn. Поскольку на модели LLC заметная активность РНКазы А наблюдалась в диапазоне доз 0.5-50 мкг/кг, в эксперименте с НА-1 также был использован этот диапазон доз. В этих экспериментах мыши C57B1/6J с LLC были использованы в качестве положительного контроля. Начиная с 8-го дня после имплантации опухолей, когда опухоли уже начинали пальпироваться, мыши с HA-1 или с LLC получали внутримышечные инъекции физиологического раствора или раствора РНКазы А в дозах 0.35, 0.7 и 7 мкг/кг.
Сравнение размера опухоли в контрольной группе и группах животных с LLC или НА-1, получавших лечение РНКазой А, показало, что в начальный период лечения (на 10-й день после трансплантации опухоли) размеры опухолей между группами различаются незначительно (рис. 1Б, 1В). К 15-му дню в группах животных с НА-1, получавших лечение РНКазой А в дозах 0.35 и 0.7 мкг/кг, размер опухоли был на 23 % меньше, чем в контроле (рис. 1В), а группах животных с LLC - на 43 % меньше, чем в контроле (рис. 1Б). Следует отметить, что противоопухолевый эффект РНКа-зы А на модели LLC не зависел от того, на какой день (4-й или 8-й) после имплантации опухоли начиналось лечение. Внутримышечное введение ДНКазы I мышам C57B1/6J с LLC и мышам A/Sn с HA-1. Противоопухолевый потенциал ДНКазы I был исследован на двух моделях опухолей LLC и HA-1. Начиная с 8-го дня после трансплантации опухолей мышам C57B1/6J с LLC и мышам A/Sn с HA-1 внутримышечно вводили ДНКазу I в диапазоне доз 0.02-2.3 мг/кг. Измерение размера опухолей показало, что введение ДНКазы I не вызывает снижения скорости роста первичной опухоли.
ВЛИЯНИЕ РНКАЗЫ А И ДНКАЗЫ I НА РАЗВИТИЕ МЕТАСТАЗОВ
Антиметастатическую активность РНКазы А и ДНКазы I (способность снижать число метастазов в органах-мишенях) оценивали, (1) определяя количество метастазов в легких животных с LLC с помощью бинокуляра; (2) оценивая изменение веса печени (печеночный индекс) у животных с НА-1; (3) с помощью гистологического анализа органов-мишеней (легких в случае LLC и печени в случае НА-1).
A
о
X ^
с
о
2 ID fi \о О
0.9 -0.80.70.60.50.40.3 -0.2 -0.1 -0.0
"Г
день 13
.....*.....I'
день 11
* £
Е-
V"
день 8
Чк-
10-4 10-3 10-2 10-' 1 10 Log10 (доза РНКазы А, мг/кг)
7 мкг/кг ¿Е О X
7 мкг/кг i^1.0 0.35 мкг/кг О
м
10 11 12 13 14 15 16 дни после имплантации опухоли
10 11 12 13 14 15 дни после имплантации опухоли
Рис. 1. Противоопухолевая активность РНКазы А. A. Влияние РНКазы А на рост первичной опухоли LLC у мышей C57BI/6J (концентрационная зависимость). B. Влияние РНКазы А в дозах 0.35, 0.7 и 7 мкг/ кг на скорость роста первичной опухоли LLC у мышей C57BI/6J. C. Влияние РНКазы А в дозах 0.35, 0.7 и 7 мкг/кг на скорость роста первичной опухоли HA-1 у мышей A/Sn
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТАСТАЗОВ В ЛЕГКИХ ЖИВОТНЫХ С LLC И ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ С НА-1
Образование метастазов в легочной ткани является отличительной чертой LLC. В легких контрольных мышей были обнаружены отчетливые метастазы и множественные группы опухолевых клеток (рис. 2А1, 2А2). Метастазы локализовались преимущественно в субплевральной области и имели разный размер и неправильную форму. В больших метастазах, охватывавших несколько бронхов и крупных сосудов, наблюдались признаки мононуклеарной инфильтрации (рис. 2А1). Поверхностные метастазы состояли из двух-трех слоев опухолевых клеток, расположенных вдоль плевры.
Развитие массивных метастазов в печени является отличительной чертой прогрессии НА-1. На гистологических срезах печеночной ткани выявлено множество метастазов различного размера (рис. 2А3). Было отмечено несколько морфологических типов метастазов: (1) метастазы с отчетливой внешней границей, имеющие псевдогранулярную структуру, состоящую в центре из светлых, плотно расположенных клеток, а по периферии - из базофильных клеток; (2) свободные скопления базофильных опухолевых клеток под печеночной капсулой; (3) небольшие клеточные объединения, состоящие из темных базофильных опухолевых клеток. В печеночной ткани мышей с НА-1 наблюдались многочисленные митозы в метастазах, одиночные
Б
B
контроль
A
Рис. 2. A. Метастазы в легких животных с LLC (A1 и A2) и печени животных с НА-1 (A3). B. Метастазы в легких животных с LLC после лечения ДНКазой I (0.12 мг/кг) (B1) и РНКазой А (0.7 мкг/кг) (B2 и B3). C. Метастазы в печени животных с HA-1 после лечения ДНКазой I (0.02 мг/кг) (C1), ДНКазой I (1.2 мг/кг) (C2) и РНКазой А (0.35 мкг/кг) (C3)
A
» '
ж
Рис. 3.Гистотопо-грамма долей легких мышей C57BI/6 с LLC. A. Животные, получавшие инъекции физиологического раствора (контроль). B. Животные, получавшие инъекции ДНКазы I в дозе 0.02 мг/кг. C. Животные, получавшие инъекции РНКазы а в дозе 0.7 мкг/кг. Окраска гематоксилином и эозином
5 мм
3
1
2
Б
Б
B
B
рассеянные опухолевые клетки, лимфоцитарная инфильтрация печеночной паренхимы, дистрофические изменения и некрозы гепатоцитов (рис. 2А3).
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТАСТАЗОВ В ЛЕГКИХ ЖИВОТНЫХ С LLC И ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ С HA-1, ПОЛУЧАВШИХ ЛЕЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАМИ
Введение РНКазы А и ДНКазы I животным с LLC индуцировало появление дистрофических изменений в метастазах легких (рис. 2Б). Морфологические параметры этих изменений были идентичны для всех групп независимо от дозы: увеличение количества некрозов и апоптозов, дистрофические изменения онкоцитов, значительная мононуклеарная инфильтрация опухолевых экстравазатов и метастазов (рис. 2Б1-3).
Гистологическое исследование метастазов в печеночной ткани у мышей c HA-1 после лечения РНКазой А и ДНКа-зой I в различных дозах выявило отчетливые морфологические изменения, которые имели идентичные признаки. В метастатических очагах наблюдалось формирование центральных и перифокальных некрозов, отеки ткани,
множественные кровоизлияния и отчетливая монону-клеарная инфильтрация (рис. 2В1-3). Следует отметить, что у мышей с НА-1, получавших лечение ферментами, метастазы не были выявлены в миокарде и почках, тогда как у контрольных животных в этих органах были выявлены опухолевые инфильтраты.
Обращает на себя внимание состояние органов иммунной системы у животных с НА-1. В частности, в вилочко-вой железе прослеживались признаки акцидентальной инволюции, проявляющейся или повышением количества лимфоцитов в мозговом слое, или даже инверсией слоев тимуса. Аналогичные изменения, свидетельствующие о выраженной антигенной стимуляции, были обнаружены в ткани селезенки. Степень выраженности признаков антигенной стимуляции коррелировала с дозой фермента.
Таким образом, при сравнении групп контрольных животных с LLc или НА-1 и групп животных с опухолями, получавших лечение РНКазой А и ДНКазой I, выявлены признаки индуцированного патоморфоза метастазов, проявляющиеся в выраженных дистрофических изменениях опухолевых клеток и усилении мононуклеарной инфильтрации.
Таблица 1. Печеночный индекс (HI), средний прирост веса печени (ALI) и терапевтическая эффективность (TE) в группах мышей A/Sn с HA-1
Контроль Здоровые РНКаза А, мкг/кг ДНКаза I, мг/кг
мыши 0.35 0.7 7 0.02 0.23 0.12 2.3
1HI, % 6.7 ± 0.3 4.5 5.9 ± 0.2 6.0 ± 0.2 5. 9± 0.2 5.5 ± 0.3 5.8 ± 0.2 5.6 ± 0.3 5.7 ± 0.2
2ALI, % 2.2 - 1.3 1.5 1.4 1.0 1.3 1.1 1.2
3TE, % 0 - 42 30 38 53 40 52 46
HI = (вес печени / вес мыши) * 100 %;
1 HI =
2 ALI (%) = HI 3TE (%) = 100' - ALI
- HI
эксперимент здоровых животных
/ ALI * 100.
эксперимент ' контроль
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА МЕТАСТАЗОВ В ЛЕГКИХ ЖИВОТНЫХ С LLC ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАМИ
Микроскопическое исследование метастазов на поверхности легких животных с LLC показало, что лечение животных с LLC ферментами приводит к значительному снижению числа метастазов. В группах животных с LLC, получавших лечение РНКазой А в дозах 0.5, 0.7 и 10 мг/кг, среднее число метастазов составило 14 ± 3, 15 ± 4 и 18 ± 4 соответственно. В группах животных с LLC, получавших лечение ДНКазой I в дозах 0.02, 0.12 и 2.3 мг/кг, среднее число метастазов составило 10 ± 4, 16 ± 7 и 18 ± 4, тогда как в группе животных, не получавших лечения, среднее число метастазов было 30 ± 5. Таким образом, наблюдаемое количество метастазов в группах животных с LLC, получавших лечение ферментами, было в 2-3 раза меньше по сравнению с контролем.
Анализ метастазов в легких животных с LLC показал, что после лечения ферментами наряду с морфологическими изменениями в метастазах и значительным уменьшением их количества наблюдается также существенное уменьшение площади метастазов и их локализация в органе. На рис. 3 приведены легкие животных с LLC, не получавших лечения (рис. 3А), и легкие животных с LLC, получавших лечение ферментами (рис. 3Б и 3В). Отчетливо видно уменьшение количества метастатических очагов и площади метастазов.
ОЦЕНКА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАМИ ЖИВОТНЫХ С HA-1
Диффузная граница метастатических очагов в печеночной паренхиме не позволяла использовать микроскопию для подсчета количества метастазов в печени животных с НА-1. Поскольку в процессе развития опухолей, метаста-зирующих в печень, происходит увеличение веса печени, для оценки антиметастатической активности ферментов был использован печеночный индекс (HI), HI = (вес печени / вес мыши) х 100 %, который отражает тяжесть заболевания: уменьшение HI животных после лечения ферментами относительно HI животных контрольной группы является критерием терапевтической эффективности лечения (ТЕ). Данные по среднему приросту веса печени (ALI) животных в группах с НА-1 относительно здоровых животных были использованы для оценки ТЕ (табл. 1). Из представленных данных видно, что у животных с НА-1, получавших лечение ферментами, наблюдается заметное
снижение HI по сравнению с контролем. Терапевтическая эффективность (ТЕ) у животных с НА-1, получавших лечение РНКазой А, варьировала от 30 до 42 % и у животных с НА-1, получавших лечение ДНКазой I, - от 40 до 53 %.
Как упоминалось во введении для главного представителя семейства, панкреатической рибонуклеазы А, при высоких дозах фермента (свыше 10 мг/кг) была ранее показана лишь слабая противоопухолевая активность [14, 15], а для ДНКазы I была показана способность подавлять рост метастазов [21, 22].
ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе мы исследовали противоопухолевую и антиметастатическую активность РНКазы А in vivo, используя дозы от 0.1 мкг/кг до 10 мг/кг. Мы показали, что внутримышечное введение РНКазы А в дозах 0.550 мкг/кг приводит к замедлению роста первичной опухоли на 20-40 %, при этом противоопухолевый эффект более выражен на ранних стадиях развития опухоли (8-й день). РНКаза А в дозах свыше 0.5 мг/кг не влияла на рост опухоли, что согласуется с полученными ранее данными других исследователей [17, 25]. Введение ДНКазы I в дозах 0.02-2.3 мг/кг не приводило к замедлению роста первичной опухоли. Было обнаружено, что внутримышечное введение и РНКазы А и ДНКазы I приводит к значительному (в 2-3 раза) уменьшению числа и размеров метастазов в легких животных с LLC. В случае гепатомы НА-1 внутримышечное введение ферментов приводило к снижению веса печени животных по сравнению с контролем, а терапевтическая эффективность лечения составила 30-42 % для РНКазы А, и 40-53 % для ДНКазы I. Гистологический анализ легких и печени позволил выявить, что оба фермента оказывают сходное действие на очаги метастазирования и вызывают деструкцию опухолевых клеток и увеличение числа некрозов и апоптозов в очагах метастазирования. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оба фермента проявляют высокую антиметастатическую активность.
На сегодняшний день отсутствует общепринятый механизм противоопухолевого действия рибонуклеаз. Наблюдаемый нами противоопухолевый эффект РНКазы А может реализовываться благодаря (1) деградации кодирующих внутриклеточных РНК и, как следствие, (а) нарушению синтеза белков [26, 27] и (б) изменению профиля экспрессии генов под действием продуктов расщепления РНК [28]; (2) деградации некодирующих РНК (pre-miРНК, miРНК
и siРНК) [2, 29]; (3) дестабилизации структуры РНК [30]; (4) блокированию функций РНК [31]; (5) воздействию на пути сигналинга [32-34] и (6) выключению неконтролируемого потока калия через кальций-зависимые калиевые каналы в опухолевые клетки [35]. Также нельзя исключить какие-либо другие пока неизвестные механизмы.
Мы предполагаем, что антиметастатическое действие РНКазы А и ДНКазы I, так же как и противоопухолевое действие РНКазы А, связано с основной функцией этих ферментов, способностью расщеплять нуклеиновые кислоты. Однако нельзя утверждать, что противоопухолевый эффект РНКазы А реализуется за счет деградации внутриклеточной РНК опухолевых клеток, поскольку данные многих авторов однозначно подтверждают, что при проникновении РНКазы А в клетку происходит ее связывание с рибонуклеазным ингибитором [17].
Возможными мишенями для РНКазы А могут быть не-кодирующие циркулирующие в плазме крови РНК, включая рге-т1РНК и т1РНК, участвующие в регуляции онкогенеза и инвазии [3, 36, 37]. Известно, что в злокачественных опухолях различного происхождения экспрессия большинства miРНК, участвующих в регуляции опухолеспецифичных генов, нарушена [38, 39]. Так, показано, что повышение экспрессии т^-9 в случае рака молочной железы приводит к снижению уровня Е-кадхерина и усилению инвазии [40]. Было показано, что в плазме больных плоскоклеточным раком языка повышен уровень т1К-184, которые оказывают стимулирующее влияние на антиапоптотические и проли-феративные свойства опухолевых клеток [41]. Мишенью для ДНКазы I могут быть внеклеточные опухолеспецифиче-ские ДНК, которые, согласно геном-генометастатической теории, способны трансфецировать клетки удаленных от первичной опухоли органов, приводя к развитию метастазов [4].
Известно, что некоторые пептиды небольшого размера в чрезвычайно невысоких концентрациях способны оказывать противоопухолевый эффект [42] и иммуностимулирующее действие [43, 44], однако механизм их действия еще до конца не выяснен. Нельзя исключить, что обнаружен-
ное в нашей работе антиметастатическое действие РНКазы А и ДНКазы I, наблюдаемое в диапазоне низких доз, может быть связано с образованием биогенных пептидов в результате протеолиза ферментов в кровотоке.
Исчезновение противоопухолевой активности РНКазы А при повышении дозы свыше 0.5 мг/кг и при долговременном введении фермента (наблюдаемое нами снижение противоопухолевого эффекта на 13-й день развития опухоли) может быть связано с образованием специфических антител против РНКазы А. Подтверждением этому являются признаки антигенной стимуляции иммунной системы, наблюдаемые после введения РНКазы А: увеличение содержания лимфоцитов в мозговом слое тимуса и селезенке, инверсия слоев тимуса и инфильтрация метастатических очагов мононуклеарами.
выводы
В результате проведенных исследований мы показали, что внутримышечное введение РНКазы А и ДНКазы I оказывает системный эффект на злокачественные опухоли, который выражается в замедлении роста опухоли (РНКаза А), в снижении количества и площади метастазов и в деструктивных изменениях очагов метастазирования (оба фермента). При этом дозы ферментов, при которых наблюдается наибольшая антиметастатическая активность, не оказывают токсического действия на организм животных. Полученные данные позволяют предложить применение РНКазы А и ДНКазы I в качестве терапии сопровождения для лечения метастазирующих форм опухолей. •
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 09-04-01362), Программами Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине», Программой государственной поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ (гранты Президента РФ МК-309.2008.4 и НШ-3689.2008.4).
CnMCOK flMTEPATyPBI
1. Dalmay T., Edwards D.R. // Oncogene. 2006. V. 25. № 46. P. 6170-6175.
2. Ardelt B., Ardelt W., Darzynkiewicz Z. // Cell Cycle. 2003. V. 2. № 1. P. 22-24.
3. Iorio M.V., Ferracin M., Liu C.G. et al. // Cancer Res. 2005. V. 65. № 16. P. 7065-7070.
4. Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C., Ontanon J. et al. // Blood. 2000. V. 95. № 2. P. 724-735.
5. Kotchetkov R., Cinatl J., Krivtchik A. A. et al. // Anticancer Res. 2001. V. 21. P. 1035-1042.
6. Soucek J., Pouckova P., Matousek J. et al. // Neoplasma. 1996. V. 43. № 5. P. 335-340.
7. Cinatl J. Jr., Cinatl J., Kotchetkov R. et al. // Int. J. Oncol. 1999. V. 15. № 5. P. 1001-1009.
8. Pouckova P., Zadinova M., Hlouskova D. et al. // J. Control Release. 2004. V. 95. № 1. P. 83-92.
9. Rybak S.M., Pearson J.W., Fogler W.E. et al. // J. Natl. Cancer Inst. 1996. V. 88. № 11. P. 747-753.
10. Lee I., Lee Y.H., Mikulski S.M. // J. Surg. Oncol. 2000. V. 73. № 3. P. 164-171.
11. Costanzi J., Sidranski D., Navon A. et al. // Cancer Invest. 2005. V. 23. № 7. P. 643-650.
12. Ledoux L. // Nature. 1955. V. 175. № 4449. P. 258-259.
13. Ledoux L. // Nature. 1955. V. 176. № 4470. P. 36-37.
14. De Lamirande G. // Nature. 1961. V. 192. P. 52-54.
15. Roth J.S. // Cancer Res. 1963. V. 23. P. 657-666.
16. Klink T.A., Raines R.T. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 17463-17467.
17. Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.M., Raines R.T. // Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10407-10412.
18. Rutkoski T.J., Raines R.T. // Curr. Pharm. Biotechnol. 2008. V. 9. № 3. P. 185-189.
19. Wu Y., Mikulski S.M., Ardelt W. et al. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. № 14. P. 10686-10693.
20. Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 18. P. 10525-10530.
21. Sugihara S., Yamamoto T., Tanaka H. et al. // Br. J. Cancer. 1993. V. 67. P. 66-70.
22. Tokita K., Sugihara S., Hiraoka T. et al. // Invasion Metastasis. 1995. V. 15. P. 46-59.
23. Silberklang M., Gillum A.M., RhajBhandary // Methods Enzymol. 1979. V. 59. P. 58-109.
24. Tomayko M.M., Reynolds C.P. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1989. V. 24. P. 148-154.
25. Klink T.A., Raines R.T. // Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 17463-17467.
26. Kim J.S., Soucek J., Matousek J. et al. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 31097-31102.
27. Matousek J. // Comp. Biochem. Physiol. C. 2001. V. 129. P. 175-191.
28. Haigis M.C., Raines R.T. // J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 313-324.
29. Zhao H., Ardelt B., Ardelt W. et al. // Cell Cycle. 2008. V. 7. P. 3258-3261.
30. Sorrentino S., Naddeo M., Russo A. et al. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 10182-10190.
31. Blaszczyk J., Gan J., Tropea J.E. et al. // Structure. 2004. V. 12. P. 457-466.
32. Kojima K. // Nagoya J. Med. Sci. 1993. V. 56. P. 1-18.
33. Ran S., Downes A., Thorpe P.E. // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 6132-6140.
34. Ilinskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A. et al. // Protein Sci. 2002. V. 11. P. 2522-2525.
35. Ilinskaya O.N., Koschinski A., Mitkevich V.A. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 314. P. 550-554.
36. Zhang B., Pan X., Cobb G.P. et al. // Dev. Biol. 2007. V. 302. P. 1-12.
37. Wong T.S., Liu X.B., Wong B.Y. et al. // Clin. Cancer Res. 2008. V. 14. P. 2588-2592.
38. Garzon R., Fabbri M., Cimmino A. et al. // Trends Mol. Med. 2006. V. 12. № 12. P. 580-587.
39. Zhang B., Pan X., Cobb G. P. et al. // Dev. Biol. 2007. V. 302. № 1. P. 1-12.
40. Iorio M.V., Ferracin M., Liu C.G. et al. // Cancer Res. 2005. V. 65. № 16. P. 7065-7070.
41. Wong T.S., Liu X.B., Wong B.Y. et al. // Clin. Cancer Res. 2008. V. 14. № 9. P. 2588-2592.
42. Fauve R.M. // In: Azuma I., Joll£s G. (ed) Immunostimulants: Now and Tomorrow. 1987. Springer-Verlag, Berlin. P.225-234.
43. Januaz M., Wieczorek Z., Spiegel K. et al. // Mol. Immunol. 1987. V. 249. № 10. P. 1029-1031.
44. Vanhoof G., Goosens F., De Meester I. et al. // The FASEB Journal. 1995. V. 9. P. 736-744.
