CC BY
93
УДК 616-006.04-085.322:582.272:577.14
С.Я. Жанаева, Т.В. Алексеенко, Т.А. Короленко, Т.Н. Звягинцева
НИИ физиологии СО РАМН (630117 г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 4)
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУЛЬФАТИРОВАННОГО ПОЛИСАХАРИДА ФУКОИДАНА БУРОЙ ВОДОРОСЛИ ОХОТСКОГО МОРЯ FUCUS EVANESCENS
Ключевые слова: экспериментальная опухоль, фукоидан, циклофосфан, катепсины.
На модели экспериментальной перевиваемой аденокарциномы легких Льюиса у мышей линии C57BL/6J исследована противоопухолевая и антиметастатическая активность сульфатированного полисахарида фукоидана, выделенного из бурой водоросли Охотского моря Fucus Evanescens. Показано, что выраженность антиметастатического действия зависит от дозы препарата. При однократном или повторном введении в дозе 10 мг/кг фукоидан оказывал самостоятельное умеренное антиметастатическое действие, а также потенцировал антиметастатическую, но не противоопухолевую активность циклофосфана. В меньших и больших дозировках (5 и 25 мг/кг) фукоидан заметного влияния на рост и метастазирование аденокарциномы не оказывал. В дозе 25 мг/кг фукоидан при совместном применении с цикло-фосфаном усиливал токсическое действие цитостатика.
Фукоиданы представляют собой класс полианион-ных разветвленных гомо- и гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из остатков сульфатиро-ванной a-L-фукозы [11—13]. Основным источником фукоиданов являются все виды бурых водорослей, однако в наибольших концентрациях они присутствуют в двух видах — Fucales и Laminares [6]. В красных, зеленых и золотистых водорослях фукоиданы не обнаружены [6, 14]. Кроме бурых водорослей фукоиданы встречаются также в тканях некоторых морских беспозвоночных [6, 13, 14].
Впервые сульфатированный полисахарид «фукоидан» из морских бурых водорослей был выделен еще в 1913 г. [6], и длительное время он рассматривался главным образом в качестве источника L-фукозы. В настоящее время интерес к этому классу полисахаридов значительно возрос в связи с полученными в последние десятилетия сведениями о их биологической активности: антикоагулянтной, антитром-бической, противовоспалительной, антивирусной, иммуностимулирующей и противоопухолевой, что связывают со способностью этих полисахаридов взаимодействовать с рядом белков и влиять на свойства клеточной поверхности [1—4, 6, 12—14].
Противоопухолевая и антиметастатическая активность фукоиданов из различных источников была продемонстрирована на моделях мышиных опухолей in vivo и в экспериментах in vitro [4, 12]. Было показано, что фукоиданы участвуют в таких клеточных процессах, как миграция, адгезия, рост и апоптоз клеток, играющих важную роль в механизмах неотрансформации [1, 4, 12]. Противоопухолевая ак-
Жанаева Светлана Яковлевна — канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник НИИ физиологии СО РАМН; тел.: 8 (383) 334-89-56; e-mail: djsja@mail.ru.
тивность фукоиданов может быть опосредована их иммуностимулирующими свойствами. Кроме того, в экспериментах in vitro выявлена прямая цитотокси-ческая активность некоторых фукоиданов в отношении ряда опухолевых клеток [4].
Использованный нами полисахарид фукоидан из бурых водорослей Охотского моря в настоящее время структурно охарактеризован и стандартизован [1]. Показано, что он обладает низкой токсичностью, хорошей растворимостью и возможностью для парентерального и перорального введения [1, 3]. Исследованы иммуностимулирующие и антикоагулянтные свойства фукоидана [1, 3]. В экспериментах in vivo и in vitro установлена его способность стимулировать фагоцитоз и кислородзависимые механизмы бак-терицидности нейтрофилов, усиливать продукцию провоспалительных цитокинов, взаимодействовать с поверхностными рецепторами макрофагов и влиять на их активность. Получены данные о противовирусной активности препарата [1]. Показана способность фукоидана индуцировать апоптоз в клетках злокачественных лимфом и повышать их чувствительность к индукции апоптоза стандартными индукторами in vitro [1, 12].
В настоящей работе на модели экспериментальной опухоли мышей — аденокарциномы легких Льюиса — мы продолжили исследования противоопухолевой и антиметастатической активности фукоидана, выделенного из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens.
Материал и методы. Эксперименты проведены на 2—3-месячных самцах и самках мышей линии C57BL/6J, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Животных содержали по 8—10 особей в клетке при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (гранулированный комбикорм ПК 120-1 для лабораторных крыс и мышей, сбалансированный по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам; ООО «Лабораторснаб», Москва). Все экспериментальные процедуры выполняли в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Council Directive 86/609/EEC). Опыты проводили в осенне-зимний период.
Опухоль индуцировали трансплантацией клеток аденокарциномы в мышцы бедра (2—5х106 клеток на мышь). Опухоль развивалась в виде солидного узла в мышцах бедра и метастазировала преимущественно
Таблица 1
Влияние фукоидана на массу печени и селезенки у мышей с аденокарциномой легких Льюиса
Кратность введения Относительный вес, %
Группа печени селезенки
Контроль 1 5,60±0,22 1,80±0,17
Фукоидан (25 мг/кг) 1 5,80±0,24 1,70±0,08
Фукоидан (25 мг/кг) + ЦФ (100 мг/кг) 1 6,90±0,361 2,20±0,041
Контроль 3 5,10±0,11 0,80±0,03
Фукоидан (5 мг/кг) 3 5,50±0,05 1,20±0,041
Фукоидан (10 мг/кг) 3 5,30±0,28 1,00±0,101
Фукоидан (10 мг/кг) + ЦФ (100 мг/кг) 1 4,70±0,29 1,10±0,25
Фукоидан (10 мг/кг) + ЦФ (100 мг/кг) 3 6,20±0,151 2,00±0,101
ЦФ (100 мг/ кг) 3 5,10±0,33 1,50±0,111
1 Разница с соответствующим контролем статистически значима.
в легкие. Использованный в работе суль-фатированный полисахарид фукоидан с молекулярной массой 20—40 кДа был выделен из бурой водоросли Fucus evanescens методом горячей экстракции [3].
Проведено 2 серии экспериментов.
В первой через 9 суток после перевивки опухоли животным однократно вводили фукоидан в дозе 25 мг/кг или фукоидан совместно с циклофосфаном (ЦФ) — 100 мг/кг.
Во второй серии фукоидан применяли одно- или трехкратно в дозе 5 или 10 мг/кг через 5, 8 и 12 суток после трансплантации опухоли, а ЦФ (100 мг/кг) — однократно на 12-е сутки после перевивки опухоли. Препараты растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела.
За животными наблюдали в течение 20 суток, после чего их декапитировали, задние конечности отсекали и по разности их веса определяли массу опухоли. Легкие фиксировали в 10% формалине и под бинокулярной лупой подсчитывали в них количество метастазов. Противоопухолевый и анти-метастатический эффекты препаратов оценивали по снижению массы опухоли по сравнению с контролем и среднему количеству метастазов в легких.
В гомогенатах опухоли определяли активность катепсинов В и L по методу Barrett и Kirschke [5]. В качестве субстратов использовали соответственно Z-L-Phe-L-Arg-MCA и Z-L-Arg-L-Arg-MCA (Sigma, USA). Для определения активности катепсина L применяли селективный ингибитор катепсина В СА-074 (Sigma, USA). Флуоресценцию растворов определяли при помощи спектрофотометра Perkin Elmer 650-10S, результаты выражали количеством освобожденного в результате ферментативной реакции метилкумари-ламида в минуту в расчете на белок. Активность ка-тепсина D определяли спектрофотометрическим методом [15], используя в качестве субстрата азоказеин (Sigma, USA) и выражали в условных единицах.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0, достоверность различий оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Наиболее эффективным оказалось повторное применение фукоидана в расчете 10 мг/кг. В этой дозировке препарат удовлетворительно переносился животными, не влиял на продолжительность жизни мышей с опухолью и на относительный вес печени, что является косвенным свидетельством низкой токсичности препарата и его незначительного влияния на метаболические процессы в гепатоцитах. Тем не менее следует отметить, что при внутрибрюшинном введении фукоидан вызывал кратковременное (в течение суток) снижение веса мышей с аденокарцино-
мой на 3—5%. Относительный вес селезенки при трехкратном применении фукоидана в дозах 5 и 10 мг/кг увеличивался в 1,3—1,5 раза. Влияние однократного введения полисахарида совместно с ЦФ на печеночный и селезеночный индексы было сравнимо с действием одного ЦФ, однако трехкратное применение фукоидана совместно с ЦФ приводило к существенному — в 1,2 и 2,5 раза соответственно — увеличению относительного веса печени и селезенки (табл. 1).
При трехкратном применении в дозах 5 и 10 мг/кг фукоидан проявлял выраженную самостоятельную антиметастатическую активность и способность потенцировать антиметастатический эффект ЦФ. При этом наиболее значительное торможение метастази-рования было показано в группе мышей, получавших фукоидан в дозе 10 мг/кг совместно с ЦФ в дозе 100 мг/кг (табл. 2). Введение одного ЦФ приводило к 4-кратному снижению количества метастазов в легких мышей, а у животных, получавших одновременно с ЦФ одно- и трехкратно фукоидан, количество метастазов было соответственно в 11 и 8 раз меньше (табл. 2). При повторном введении одного фукоидана в дозе 10 и 5 мг/кг количество метастазов в легких было соответственно в 1,4 и 1,2 раза меньше по сравнению с контролем (табл. 2).
Заметного противоопухолевого эффекта фукоидана выявлено не было. Следует отметить, что в отдельных наблюдениях был получен выраженный самостоятельный противоопухолевый эффект этого полисахарида при трехкратном введении в дозе 10 мг/кг. При этом торможение роста опухоли в терминальном периоде жизни мышей (на 20-е сутки после перевивки опухоли) составило 33%. Однако в дальнейших исследованиях подобного эффекта получить не удалось. Также не было обнаружено потенцирующего влияния фукоидана на эффект ЦФ: торможение роста первичных опухолей при однократном введении фукоидана составило 51%, при трехкратном — около 40%, а при действии одного ЦФ — 56% (табл. 2).
Таблица 2
Влияние фукоидана и циклофосфана на рост внутримышечных трансплантатов опухоли Льюиса и количество метастазов в
легкие у мышей
Группа Доза фукои- Масса опухоли Кол-во метастазов
дана, мг/кг абс., г %2 абс. %2
Контроль - 4,20±0,41 100,0 0 0
Фукоидан на 9-е сутки1 25 5,20±0,50 123,8 0 0
Фукоидан + ЦФ (100 мг/кг) на 9-е сутки1 25 4,20±0,40 100,0 0 0
Контроль - 4,30±0,44 100,0 34,6+3,12 100,0
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки1 по 10 2,90±0,203 67,4 24,6±3,333 71,1
Фукоидан + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1 10 2,10±0,293 48,8 3,2±1,543 9,2
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1 по 10 2,60±0,253 60,5 4,1±0,923 11,6
ЦФ (100 мг/ кг) на 12-е сутки1 - 1,90±0,403 44,2 8,8±2,453 25,4
Контроль - 4,20±0,43 100,0 9,3+2,43 100,0
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки1 по 5 5,10±0,313 121,0 7,6+1,39 81,7
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1 по 5 3,40±0,26 80,9 0,1±0,083 1,1
ЦФ (100 мг/кг) на 12 сутки1 - 2,80±0,35 66,7 0,3±0,213 3,2
1 После перевивки опухоли.
2 Процент от контроля.
3 Разница по сравнению с соответствующим контролем статистически значима.
протеазы, активаторы и ингибиторы плазминогена, матриксные металлопротеазы) играют важную роль в регуляции опухолевого роста, а также участвуют в реализации апоптотический или некротической гибели опухолевых клеток [3, 7—10]. Трехкратное применение фукоидана в дозе 10 мг/кг самостоятельно или в сочетании с ЦФ приводило к достоверному снижению активности катепсина L в ткани опухоли, но не влияло на активность катепсина В. Исключение составил катепсин D — его активность была повышена у мышей, леченых ЦФ в сочетании с трехкратным введением фукоидана (рис.). В последнем случае имело место выраженное потенцирующее воздействие фукоидана на эффект ЦФ.
Таким образом, на модели перевиваемой аденокарциномы легких Льюиса у мышей впервые показано, что фукоидан обладает в определенной мере самостоятельной антиметастатической активностью, а также способностью к потенцированию антимета-статической, но не противоопухолевой активности цитостатического препарата (циклофосфан). Более эффективным является повторное применение полисахарида в умеренных дозах. В высокой дозировке (25 мг/кг) фукоидан оказывает токсическое действие и приводит к гибели части животных. Механизм действия фукоидана на опухоль неизвестен: возможно, он связан со способностью этого полисахарида усиливать выработку макрофагами фактора некроза опухолей и стимулировать фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов [6, 10, 13, 14]. Для выяснения этих вопросов требуются дальнейшие исследования.
Литература
1. Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения биополимеров из гидробионтов Тихого океана//Бюлл. СО РАМН. 2008. № 4. С. 16—21.
Однократное применение фукоидана в дозе 25 мг/кг в комбинации с 100 мг/кг ЦФ оказалось токсичным — к 20-му дню после перевивки опухоли из 10 мышей погибло 7. Из 10 мышей, получавших только фукоидан в дозе 25 мг/кг, погибли 3, тогда как в контрольной группе животных (без лечения), а также в группе животных, получавших только ЦФ, гибели не наблюдалось. Кроме того, однократное введение фукоидана в дозе 25 мг/кг тормозящего влияния на рост опухоли не оказывало (табл. 2).
Для изучения одного из возможных механизмов действия фукоидана в тканях аденокарциномы у мышей исследовали активность цистеиновых протеаз лизосом — катепсинов В и L, а также аспартильной протеазы катепсина D. Известно, что протеазы лизо-сом наряду с другими протеазами клеток (сериновые
0,18-
| 0,14-
>5
0,10 —
0,06-
0,02-
Катепсин Ь Катепсин Б
| [контроль | |Фукоидан, 10 мг/кг ЦФ ЦФ+фукоидан
Рис. Изменение удельной активности катепсинов L и D в ткани опухоли у мышей при лечении фукоиданом и ЦФ («звездочка» — разница с контролем статистически значима).
2. Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Богомаз Т.А. и др. Механизмы воздействия фукоидана на комплемент человека // Биомедицинская химия. 2001. Т. 49, № 6. С. 24—27.
3. Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н., Мамаев А.Н. и др. Анти-коагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2003. Т.136, № 1. С. 532-534.
4. Куэрос К., Ассис К., Медейрос В. и др. Цитотоксический эффект полисахридов, выделенных из водорослей, на HL 60 клетки // Биохимия. 2006. Т. 71, № 12. С. 1613-1617.
5. Barrett A. Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin L //Methods Enzymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.
6. Berteau O., Mulloy B. Sulfatedfucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfatedfucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiol. 2003. Vol. 13, No. 6. P. 29R-40R.
7. Fehrenbacher N., Jaattela M. Lysosomes as targets for cancer therapy // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 2993-2995.
8. Lah T.T., Calaf G., Kalman E. et al. Cathepsins D, B, and L in transformed humen breast epithelial cell // Breast Cancer Res. Treatment. 1996. Vol. 39. P. 221-233.
9. Laurent-Matha V., Maruani-Herrmann S., Prebois C. et al. Catalytically inactive human cathepsin D triggers fibroblast invasive growth // J. Cell Biol. 2005. Vol. 168, No. 3. P. 489-499.
10. Patankar M.S., Oehninger S., Barnett T. et al. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities// J. Boil. Chem. 1993. Vol. 268, No. 29. P. 21771-21776.
11. Pereira M.S., Mulloy B., Mourao A.S. Structure and anticoagulant activity of sulfated fucans // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, No. 12. P. 7656-7667.
12. Philchenkov A., Zavelevich M., Imbs T. et al. Sensitization of human malignant lymphoid cells to etoposide by fucoidan, a brown seaweed polysaccharide // Exp. Oncol. 2007. Vol. 29, No. 3. P. 181-185.
13. Pomin V.H., Pereira M.S., Valente A-P. et al. Selective cleavage and anticoagulant activity of a sulfated fucans: stereospe-
cific removal of a 2-sulfate ester from the polysaccharide by mild acid hydrolysis, preparation of oligosaccharides, and heparin cofactor Il-dependent anticoagulant activity // Glycobiol. 2005. Vol. 15, No. 4. P. 369-381.
14. Pomin V.H., Mourao P.A.S. Structure, biology, evolution, and medical importance of sulfatede fucans and galactans // Glycobiol. 2008. Vol. 18, No. 12. P. 1016-1027.
15. Wiederanders B., Oelke B. Accumulation of inactive cathepsin D in old rats // Mech. Ageing Dev. 1984. Vol. 24, No. 3. P. 265-271.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
ANTICANCER AND ANTIMETASTATIC ACTIVITY OF SULPHATED POLYSACCHARIDE FUCOIDAN DERIVED FROM THE OKHOTSK SEA BROWN ALGAE FUCUS EVANESCENS
S.Ya. Zhanaeva, T.V. Alekseenko, T.A. Korolenko,
T.N. Zvyagintseva
Research Institute of Physiology of the RAMS, Siberian Branch (4 Academian Timakov St. Novosibirsk 630117Russia)
Summary — In vitro model of transplantable Lewis’s pulmonary adenocarcinoma in C57BL/6 mice allowed to study anticancer and antimetastatic effect of the sulphated polysaccharide fucoidan derived from the Okhotsk Sea brown algae Fucus evanescens. As shown, the intensity of antimetastatic effects depended on the dose of the drug. Single or repeated introduction of the drug in the dose of 10 mg/kg induced spontaneous moderate antimetastatic effect and potentiated antimetastatic but not anticancer activity of cyclophosphan. The smaller and larger doses (5 and 25 mg/kg) did not result in any noticeable effects on the growth and dissemination of adenocarcinoma. Combined with cyclo-phosphan, the fucoidan applied in the dose of 25 mg/kg intensified toxic action of the cytostatic drug.
Key words: experimental tumor, fucoidan, cyclophosphan, cathepsins.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 90—93.
УДК 616.24-001.18/19-085.23
А.Л. Шутикова1, С.С. Целуйко2, Т.С. Запорожец1, Л.М. Эпштейн3, Н.Н. Беседнова1
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Амурская государственная медицинская академия (675000 г. Благовещенск, ул. Горького, 95), 3 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (690950 г. Владивосток, пер. Шевченко, 4)
ВЛИЯНИЕ МОЛЛЮСКАМА НА МУКОЦИЛИАРНУЮ СИСТЕМУ ВОЗДУХОНОСНОГО ОТДЕЛА ЛЕГКИХ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Ключевые слова: слизистая оболочка трахеи, биологически активные вещества, моллюскам, гипотермия.
В эксперименте изучено влияние моллюскама — комплекса аминокислот и дипептидов — на мукоцилиарную систему воздухоносного отдела легких и свободнорадикальные процессы при гипотермии. Работа выполнена на 60 крысах-самцах, 40 из которых охлаждали в климатокамере (в т.ч. 20 животных, получавших моллюскам). Проведены элек-тронно-микрокопическое и биохимическое исследования. Показано, что введение биологически активной добавки оказывало защитное действие, предупреждая как изменения слизистой оболочки трахеи, так и усиление процессов липопероксидации.
Проблема экологической детерминированности функционального состояния дыхательной системы и формирования патологии органов дыхания является осо-
Шутикова Анна Леонидовна — мл. науч. сотрудник лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46; e-mail: shutikova79@mail.ru.
бенно актуальной в условиях Дальнего Востока. В этом регионе в структуре заболеваемости населения ведущее место занимают неспецифические болезни легких. Показатель заболеваемости населения Дальнего Востока данной патологией превышает показатели по России на 40% [2]. Главными неблагоприятными климатическими факторами региона являются холод и влажность. Адаптация к холодовому воздействию может продолжаться до 5—7 лет и сопровождается целым рядом функциональных нарушений и морфологических изменений, в большей степени затрагивающих органы дыхания и кожу [4]. Морфологические изменения при холодовой адаптации обусловлены нарушением целостности клеточных мембран, активированием перекисного окисления липидов, нарушением ан-тиоксидантной защиты, напряжением кислородного
