CC BY
81
Биомедицина • № 4, 2013, C. 84-89
8 релевантное и альтернативное БИОМОДЕЛИРОВАНИЕ
Противоопухолевая активность наносомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислот в отношении экспериментальной аденокарциномы молочной железы у мышей линии C57BL6
В.Ю. Балабаньян1, В. Боят1 , Г.Д. Капанадзе2, Я.М. Хамди3, В.И. Швец3
1 - Общество с ограниченной ответственностью «Технология лекарств», Московская область
2 — ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область
3— Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова, Москва
Контактная информация: Балабаньян Вадим Юрьевич [email protected]
В экспериментах in vivo выявлена способность наносомальной формы паклитаксела оказывать выраженный цитостатический эффект в отношении аденокарциномы молочной железы Са755 у мышей линии C57BL6, экспрессирующей Р-гликопротеин.
Ключевые слова: наночастицы, паклитаксел, аденокарцинома молочной железы, Р-гликопротеин.
Паклитаксел - химиотерапевтическое средство из группы таксанов, ингибитор образования микротрубочек с антиангиогенным и апоптотическим действием [12, 13]. Паклитаксел оказывает выраженный цитостатический эффект в исследованиях in vitro, при этом его клиническое применение лимитировано следующими показаниями: немелкоклеточный рак легкого, рак яичников, рак молочной железы и саркома Капоши у больных СПИД-ом [б]. Снижение ак-
тивности паклитаксела in vivo в определенной степени обусловлено множественной лекарственной устойчивостью опухолевых клеток [8,9]. Паклитаксел является субстратом Р-гликопротеина, что существенно снижает его эффективность при лечении высокорезистентных опухолей, продуцирующих Р-гликопротеин [10].
Одним из способов преодоления лекарственной резистентности опухолевых клеток является создание нанораз-
мерных форм цитостатиков на основе полимерных наночастиц [11]. Учитывая вышеизложенное, нами была разработана технология получения наносомальной формы паклитаксела на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) с поверхностью частиц, модифицированной полоксамером 188 (Плюроник Ф 68). Предложенная технология позволяет получать стабильную наносуспензию с размером частиц 250±50 нм при степени включения паклитаксела 90-95 % [2]. Проведенные нами исследования in vitro выявили способность разработанной наносо-мальной формы паклитаксела оказывать выраженный цитостатический эффект in vitro в отношении высокорезистентных клеток Т-лимфобластного лейкоза (Jurkat WT), экспрессирующих Р-глико-протеин [1,3,7].
Целью данного исследования явилось изучение противоопухолевой активности наносомальной формы пакли-таксела на модели in vivo - резистентной аденокарциноме молочной железы Ca 755 у мышей линии C57BL6.
Материалы и методы
Исследование выполнено на перевиваемой модели опухолевого роста мышей - солидной опухоли - аденокарциноме молочной железы, штамм Ca755, экспрессирующий Р-глико-протеин. Штамм Ca755 получен из коллекции опухолей Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН.
Аденокарцинома Са755 впервые получена в 1936 г. от спонтанной опухоли молочной железы у самки мыши C57BL6. Штамм был создан в Национальном институте рака США 5 сентя-
бря 1973 г. Средняя продолжительность жизни животных с опухолью - 23-27 дней. Поддерживается на мышах линии C57BL6. В опытах использовали 2-ой пассаж перевиваемой модели. Опухоли перевивали по стандартной методике половозрелым мышам-самкам линии C57BL6 массой 18-22 г (в каждой группе по 16 животных). Инокуляция опухолевых клеток проводилась подкожно в правую подмышечную область каждой мыши по 50 мг опухолевой взвеси в среде 199 в разведении 1:10 (5 х 106 клеток). Введение наносомальной и стандартной форм паклитаксела проводилось один раз в сутки в хвостовую вену в течение 7 дней; первое введение препаратов осуществляли через 48 часов после прививки опухолевых клеток. Наблюдение за мышами проводилось в течение 50 дней после введения опухолевых клеток животным. Исследуемые лекарственные формы тестировали в 3-х дозах: 19 мг/ кг, 9,5 мг/кг и 6,4 мг/кг (в рассчете на паклитаксел).
Оценку эффективности лечения проводили по показателям увеличения продолжительности жизни и торможения роста опухоли [4].
Увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) леченных животных по сравнению с контролем вычисляли по формуле 1:
УПЖ % = (СПЖо - СПЖк)/СПЖк х100 (1),
где СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни (сутки) в опытных и контрольных группах животных. Показатели эффективности изучаемых препаратов определяли в сравнении с контрольными группами.
Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле 2:
ТРО %= (Ук -Уо)/Ук х 100 (2),
где Ук и Уо - средний объем опухолей (мм3) в контрольной и опытной группах, который для каждой солидной опухоли определялся как произведение размеров трех перпендикулярных диаметров опухолевого узла. Измерение объема опухолей проводили на 1, 6, 8 и 14-е сутки после прекращения лечения.
Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Статистика 6.0 (StatSoft, ША). Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. Межгрупповые различия анализировали параметрическими методами, так как тип распределения был нормальным. В качестве параметрического критерия использовали ^критерий Стьюдента для независимых переменных. Различия были определены при 0.05 уровне значимости. Результаты исследования выражали как среднее ± ошибка среднего.
Результаты и их обсуждение
Результаты определения продолжительности жизни на модели аденокарциномы молочной железы Са755 у мышей линии С57BL6 представлены в таблице
1. При вычислении средней продолжительности жизни мышей в каждой группе не учитывали животных, павших в период лечения. Это позволило отделить противоопухолевое действие тестируемых лекарственных форм от токсического эффекта.
Увеличение продолжительности жизни на 25% и более считается показателем терапевтической эффективности тестируемого вещества [4]. На основании этого можно заключить, что нано-сомальная форма паклитаксела оказала выраженный цитостатический эффект в отношении аденокарциномы молочной железы во всех трех тестируемых дозах, тогда как стандартная форма подобным эффектом не обладала. При введении тестируемых форм мышам в
Таблица 1
Влияние наносомальной и стандартной форм паклитаксела на продолжительность
жизни мышей линии С57BL6
Препарат Доза активного вещества, мг/кг Средняя продолжительность жизни (дни, M±m) Увеличение продолжительности жизни(%)
Контроль (физиологический раствор) 0 23,9±0,98 -
Паклитаксел (стандартная форма) 19 25,3±0,53 5,8
9,5 27,5±0,77* 15,0
6,4 26,7±0,68* 11,7
Паклитаксел (наносомальная форма) 19 30,9±0,71* 29,2
9,5 35,2±0,91* 47,2
6,4 31,5±0,78* 31,2
Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля по ^критерию Стьюдента, при р<0,05.
более высокой дозе (19 мг/кг) показатель УПЖ снижался, что объясняется токсичностью паклитаксела, в результате которой происходила частичная гибель животных на ранних сроках исследования. При этом наносомальная форма существенно снижала токсичность паклитаксела.
Результаты влияния тестируемых форм паклитаксела на рост опухоли представлены в табл. 2.
Активными в противоопухолевом отношении считаются дозы препаратов, вызывающие торможение роста опухоли > 70% продолжительностью не менее 7 дней после окончания лечения [4]. Анализируя терапевтическое действие тестируемых форм паклитаксела, мож-
но отметить, что по показателю ТРО наносомальная форма проявила эффективность во всех трех экспериментальных дозах. При этом эффект сохранялся на протяжении всего периода наблюдения, что обусловлено постепенной биодеградацией наночастиц и выходом из них паклитаксела. Стандартная форма паклитаксела статистически достоверно тормозила рост опухоли, однако показатель ТРО находился в диапазоне от 46 до 19 %, тогда как для наносомальной формы этот показатель составил от 81 до 70 %.
Обобщая полученные данные, можно заключить, что наносомальная форма паклитаксела оказывает выраженный цитостатический эффект в
Таблица 2
Влияние наносомальной и стандартной форм паклитаксела на рост аденокарциномы молочной железы у мышей линии С57BL6
Препарат Доза активного вещества, мг/кг Объем опухоли (мм3 M±m), (ТРО) '
Дни после окончания лечения
1 6 8 14
Контроль (физиологический раствор) 0 2896±356 6228±708 9490±899 28218±3140
Паклитаксел (стандартная форма) 19 1613±84* (44%) 3949±263* (37%) 6458±310* (32%) 21249±834* (25%)
9,5 1724±133* (40%) 3718±309* (40%) 5124±615* (46%) 20522±1019* (27%)
6,4 1942±141* (33%) 4284±434* (31%) 6910±645* (27%) 22880±1376* (19%)
Паклитаксел (наносомальная форма) 19 547±97* (81%) 1743±279* (72%) 2457±583* (74%) 7108±831* (75%)
9,5 733±130* (75%) 1872±383* (70%) 2681±565* (72%) 8186±864* (71%)
6,4 810±121* (72%) 1784±471* (71%) 2596±588* (73%) 7925±1225* (72%)
Примечание: * - статистически значимое отличие от контроля по t-критерию Стьюдента, при р<0,05.
отношении резистентной аденокарциномы молочной железы у мышей линии С57BL6. В свою очередь, выявленный эффект является результатом проникновения паклитаксела в клетки аденокарциномы, экспрессирующие Р-гликопротеин. Существенную роль в этом процессе играет плюроник Ф 68, применяемый для модификации поверхности наночастиц. Известно, что плюроник Ф 68 индуцирует конфор-мационные изменения, приводящие к снижению сродства Р-гликопротеина для лекарственных веществ и АТФ, а также вызывает внутриклеточное снижение АТФ, необходимое для функционирования системы Р-гликопротеина [5,14]. Полученные нами результаты коррелируют с данными Vauthier C. и соавт. о способности полибутилциа-ноакрилатных наночастиц, покрытых полисорбатом 80, обеспечивать транспорт доксорубицина в резистентные опухолевые клетки [15].
Список литературы
1. Боят В., Балабаньян В.Ю., Аляут-дин Р.Н. Внутриклеточное накопление и противоопухолевая активность наносомальных форм паклитаксела // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011. Т.74, №3. С. 2225.
2. Боят.В., Хамди Я.М, Балабаньян В.Ю. и др. Получение наносомаль-ной лекарственной формы паклитак-села // Фармация. 2010. №4. С. 32-33.
3. Боят В., Хамди Я.М., Балабаньян
В.Ю. и др. Цитотоксический эффект паклитаксела, включенного в наночастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т.151. №3. С. 315-318.
4. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. М.: Гриф и К. 2012. 944 с.
5. Anand P., Nair H.B., Sung B., et. al., Design of curcumin-loaded PLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake, and increased bioactivity in vitro and superior bioavailability in vivo. Biochem Pharmacol 79(3) (2010) 330-338.
6. Bardelmeijer H.A., Beijnen J.H., Brouwer K.R., et. al., Increased oral bioavailability of paclitaxel by GF120918 in mice through selective modulation of P-glycoprotein, Clin. Cancer Res. 6 (2000) 4416-4421.
7. Bojat V., Balabanyan V.Yu., Alyautdin R.N. The entrapment of paclitaxel in PLGA nanoparticles increases its cytotoxicity against multiresistant cell line // British Journal of Medicine and Medical Research. -2011.- №1(4).- P. 306-319.
8. Cornaire G., Woodley J., Hermann P., et.al., Impact of excipients on the absorption of P-glycoprotein substrates in vitro and in vivo, Int J Pharm. 2004 Jun 18;278(1):119-31.
9. Gallo J.M., S. Li, P. Guo, K. Reed, et. al., The effect of P-glycoprotein on pa-clitaxel brain and brain tumor distribution in mice. Cancer Res 63(16) (2003) 5114-5117.
10. Ganta S., Amiji M., Coadministration of Paclitaxel and Curcumin in Nanoemulsion Formulations To Overcome Multidrug Resistance in Tumor Cells. Mol. Pharmaceutics 6 (3) (2009) 928-939.
11. Musyanovych A., Schmitz-Wienke J., Mailander V., et. al., Preparation of
biodegradable polymer nanoparticles by miniemulsion technique and their cell interactions. Macromol Biosci 8(2) (2008) 127-139.
12. Grogan BT, Gilmartin B, Carney DN,. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochim Biophys Acta 2008;1785:96-132.
13. http://www.vidal.ru/poisk_preparatov/ act 793.htm
14. Thomas H., Coley H.M., Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting P-glycoprotein. Cancer Control. 2003;10:159-165.
15. Vauthier C., Dubernet C., Chauvierre
C., et.al., Drug delivery to resistant tumors the potential of poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticles.// J. Control. Release. 2003. V.93. N 2. P. 151-160.
Antitumor activity of nanoparticulate paclitaxel formulation based on lactic and glycolic acids copolymer in an experimental mammary adenocarcinoma in C57BL6 mice
V.Yu. Balabanyan, V. Bojat, G.D. Kapanadze, Ya.M. Hamdy, V.I. Shvets
Potent cytotoxic effect of nanoparticulate paclitaxel was revealed in vivo against P-glycoprotein expressing mammary adenocarcinoma Ca755 in C57BL6 mice.
Key words: nanoparticles, paclitaxel, mammary adenocarcinoma, P-glycoprotein.
