CC BY
48
Эндоскопическое обследование пациентов после лечения показало, что в 1 группе у всех пациентов отмечалось заживление эрозивно-язвенных повреждений верхних отделов ЖКТ, а во 2 группе - у 13 из 15 человек. При включении в базисную терапию ЭХА отмечено уменьшение количества пациентов с исходно высокой степенью воспаления слизистой оболочки желудка и ДПК и увеличение числа больных с лёгкой степенью воспаления. Эти результаты подтверждают репаративные свойства ЭХА, которые обусловлены активацией факторов местной антиоксидантной защиты, оптимизацией соотношения процессов гене-рации/детоксикации свободных радикалов, защищающих клетки организма от токсического воздействия продуктов липопероксидации [1, 3-5].
Нежелательные явления при применении «Сиропа на фруктозе «Тимарин (экстракт морского ежа)» у пациентов с заболеваниями ЖКТ не выявлены.
Таким образом, полученные результаты указывают на эффективное влияние «Сиропа на фруктозе «Тимарин (экстракт морского ежа)» при совместном использовании с базисным лечением у пациентов с эрозивно-язвенными повреждениями ЖКТ. Мы полагаем, что для корректной оценки действия данного препарата на состояние и функциональную активность слизистой оболочки желудка при заболеваниях ЖКТ в сравнении с базисным лечением, необходимо провести дополнительные исследования с увеличением числа пациентов, верификацией их состояния, изучением сохранения эффекта действия препарата во времени, оценкой отдаленных последствий.
Выводы
Установлено, что включение ЭХА-содержащего «Сиропа на фруктозе «Тимарин (экстракт морского ежа)» в комплекс с базисной терапией у пациентов с заболеваниями верхних отделов ЖКТ способствует ускорению купирования болевого и диспеп-
тического синдромов, сокращению сроков заживления эрозий, улучшению процессов пищеварения, стиханию воспалительных процессов слизистой желудка, снижению уровней альфа-амилазы и липазы в сыворотке крови пациентов с дисфункцией поджелудочной железы.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа поддержана научным проектом (0545-2014-0011) ФАНО.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артюков А.А., Попов А.М., Цыбульский А.В., Кривошапко О.Н., Полякова Н.В. Фармакологическая активность эхинохрома А отдельно и в составе БАД «Тимарин» // Биомедицинская химия. 2012; 58(3): 281-90. https://doi.org/10.18097/ pbmc20125803281.
2. Ковалев Н.Н., Крыжановский С.П., Кузнецова Т.А., Костецкий Э.Я., Беседнова Н.Н. Морские ежи: биомедицинские аспекты практического применения. - Владивосток: Дальнаука, 2016. - 126 с.
3. Ануфриева А.В., Лебедько О.А., Козлов В.К. Применение биоантиоксиданта из морских гидро-бионтов в коррекции эндогенной интоксикации при эрозивном гастродуодените // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 12-13.
4. Ануфриева А.В., Лебедько О.А., Березина Г.П., Козлов В.К. Коррекция свободнорадикальных нарушений при эрозивном гастродуодените // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 57(3): 13-15.
5. Козлов В.К., Козлов М.В., Гусева О.Е., Лебедько О.А., Морозова Н.В. Антиоксидантная активность эхинохрома А при хронических воспалительных заболеваниях легких у детей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009; 3: 116-17.
Сведения об авторах
Добряков Евгений Юрьевич, к.м.н., врач-гастроэнтеролог, зав. отделением эндоскопии, Медицинское объединение ДВО РАН, тел.: 8(423)231-33-25; е-тай: drzlukin@mail.ru;
Персиянова Елена Викторовна, к.б.н., зав. ЛИМБИиТ, МО ДВО РАН, с.н.с. лаборатории иммунологии, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», 24424-46; е-тай: helen-pers@yandex.ru;
Запорожец Татьяна Станиславовна, д.м.н., начальник научно-исследовательского отдела, МО ДВО РАН, зам. директора по науке «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», тел.: 8(423) 244-24-46; е-тай: niiem_vl@mail.ru;
Витковская Диана Витальевна, медсестра первой категории отделения эндоскопии, МО ДВО РАН.
© Коллектив авторов, 2017 г doi: 10.5281/zenodo.817833
УДК 615.375:578.832.1;577.114:582.272
А.Б. Расин, А.С. Сильченко, М.И. Кусайкин, А.И. Калиновский, О.С. Маляренко, А.О. Зуев, Т.Н. Звягинцева, С.П. Ермакова
противоопухолевая активность IN VITRO фукоидана и сульфатированных фукоолигосахаридов из бурой водоросли SARGASSUM HORNERI
HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 87
• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова, ДВОРАН, Владивосток
Были исследованы структура и противоопухолевая активность фукоидана из Sargassum horneri (ShF) и продуктов его ферментативной трансформации. Фукоидан, полученный из S. horneri, представляет собой почти чистый фукан. С помощью ЯМР-спектроскопии были установлены структуры пяти выделенных сульфатированных олигосахаридов со степенью полимеризации 4-10. Показано, что основная цепь фукоидана состоит преимущественно из повторяющегося фрагмента ^3-a-L-Fuc£>(2SO3-)-1^4-a-L-Fucp(2,3SO3-)-1^ с вставкой фрагмента ^-3-a-L-Fucp(2,4SO3 )-1^. Несульфатированные боковые цепи со структурой a-L-Fucp-1^-2-a-L-Fucp-1^- присоединены при С4 моносахаридного остатка основной цепи. Установлено, что фукоидан ShF и высокомолекулярный продукт его ферментативной деградации продемонстрировали противоопухолевую активность in vitro.
Ключевые слова: бурые водоросли, фукоидан, фукоиданаза, полисахарид, олигосахарид, противораковая активность.
A.B. Rasin, A.S. Silchenko, M.I. Kusaykin, A.I. Kalinovsky, O.S. Malyarenko, A O. Zueva, T.N. Zvyagintseva, S.P. Ermakova
anticancer activity of fucoidan and sulphated fucooligosaccharides from sargassum horneri
G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok, Russia
Structure and anticancer activity of fucoidan from Sargassum horneri (ShF) and from products of its enzymatic transformation were investigated. The fucoidan extracted from S. horneri is almost pure fucan. Structure of 5 sulphated oligosaccharides with polymerization degree 4-10 was established by NMR-spectroscopy. The main chain of the fucoidanis is shown to consist mostly of the repeating ^3-a-L-Fuc£>(2SO3-)-1^4-a-L-Fuc£>(2,3SO3-)-1^ fragment, with insertions of ^3-a-L-Fucp(2,4SO3-)-1^ fragment. Unsulphated side chains with the a-L-Fucp-1^2-a-L-Fucp-1^ structure connect to the main one at the C4 of monosaccharide residue. The native fucoidan ScF and the high molecular weight products of its enzymatic degradation are established to demonstrate anticancer activity in vitro.
Keywords: brown algae, fucoidan, fucoidanase, polysaccharide, oligosaccharide, anticancer activity.
Фукоиданы представляют собой богатые фукозой сульфатированные полисахариды, содержащие различное количество галактозы, ксилозы и глюкуро-новой кислоты. Фукоиданы, полученные из бурых водорослей рода Sargassum, чрезвычайно гетероген-ны, что затрудняет определение их тонкой структуры. В большинстве работ, посвященных исследованию структуры фукоиданов, полученных из водорослей Sargassum, для определения элементов структуры полисахарида использовали метод масс-спектрометрии. Однако у данного метода есть ряд ограничений, ввиду предрасположенности сульфатированных полисахаридов к потере сульфатов в процессе анализа. Отсутствие точной информации по структуре затрудняет исследование взаимосвязи между структурой фукои-данов и их биологической активностью. Применение мягких ферментативных методов для деполимеризации фукоидана может значительно способствовать определению элементов его тонкой структуры.
Цель исследования: оценка противоопухолевой активности фукоидана и сульфатированных фукооли-госахаридов из бурой водоросли Sargassum horneri.
Материалы и методы
Суммарная фракция фукоиданов из S. horneri была получена, как описано в [1]. Затем фукоидан был очищен при помощи ионобменной хроматографии [2]. Анализ генома F. algae KMM 3553T (GeneBank:
PRJNA299442) выявил присутствие последовательностей, схожих с известными фукоиданазами. Ген фуко-иданазы был обнаружен при помощи поиска в базах данных белков F. algae через сервер RAST. Ген фукои-даназы ffa1 (GenBank:WP_057784217.1) был выявлен в геноме морской бактерии F. algae KMM 3553T.
Ген ffa1 был клонирован при помощи безристрик-ционной стратегии клонирования с использованием полимеразы HF Phusion (New England Biolabs, USA). Экспрессия клонированных генов фукоиданаз была осуществлена в штамме Escherichia coli BL21star (DE3) pLysS.
Выделение фукоиданазы FFA1. Бактериальные клетки были собраны путём центрифугирования в течение 30 мин 4500 g. К 5 г бактериальной биомассы в соотношении 5:1 (объём/масса) добавляли буфер Tris-HCl 0,04 M, pH 7,5 (с добавлением NaCl 0,5 M и имидазола 0,01 M). Далее клетки разрушали ультразвуком при 20 кГц. Суспензию центрифугировали при 12000 g, 40 мин. Надосадочную жидкость наносили на колонку HisTrap, уравновешенную NaCl 0,5 М и имидазолом 0,01 M в буфере Tris-HCl 0,04 М, pH 7,5. Следующая ступень очистки включала анионоб-менную хроматографию на колонке MonoQ (4.6/100 PE, GEHealthcare, USA). Фракции, обладавшие фу-коиданазной активностью, концентрировали путём ультрафильтрации через мембрану с пределом 10кДа
и наносили на колонку Sephacryl S-200 (1^200 см), уравновешенную буфером Tris-HCl 0,02 М, pH 7,0.
Получение продуктов ферментативного гидролиза было осуществлено, как описано в [2].
ЯМР-Спектроскопия. Спектры ЯМР были сняты при помощи спектрометра AvanceDPX-700 (Bruker Biospin AG, Switzerland). Спектры1Н, 13Си 2D (COSY, TOCSY, HSQC, HMBC) были сняты для олигосахаридов, растворённых в D2O, при 35°C и откалиброваны по ацетону. Концентрация образцов составляла 12-17 мг/мл.
Культивирование клеток, определение цитоток-сичности и способности исследуемых препаратов ингибировать самопроизвольное формирование и рост колоний клеток карциномы толстого кишечника человека DLD-1 проводили, как описано в [3].
Результаты и обсуждение
Был секвенирован и собран геном фукоидан-дегдади-рующей бактерии F. algae (GeneBank: PRJNA299442). Поиски в геноме бактерии генов, кодирующих фукои-даназу, проводили вручную, с использованием аминокислотных последовательностей семейства GH107 из CAZy. Были обнаружены гены, кодирующие белки с последовательностями, соответствующими известной фукоиданазе FcnA. В результате был опознан (и назван ffaï) ген, кодирующий фукоиданазу.
Теоретически полученная молекулярная масса продукта генаffa1 составила 111 кДа (1008 а.о.). С использованием множественного выравнивания последовательности FFA1 (с помощью сервера Clustal Omega EMBL-EBI) была показана высокая степень гомологии с известной фукоиданазой FcnA из морской бактерии Marineflexile fucanivorans (GenBank CAI47003.1). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей FFA1 и других фукоиданаз показал общие консервативные регионы, что позволило классифицировать FFA1 как член 107 семейства CAZy.
Для получения фукоолигосахаридов использовали высокоочищенный фукоидан из бурой водоросли Sargassum horneri (ShF). Был определен моносахарид-ный состав фукоидана: фукоза (90%), галактоза (9%) сульфаты (23%). Несмотря на высокую степень очистки фукоидана ShF, интерпретировать ЯМР спектры полисахарида не представлялось возможным. Поэтому, для деполимеризации фукоидана ShF была использована фукоиданаза FFA1. Получена смесь сульфатиро-ванных фукоолигосахаридов (LMP) и высокомолекулярная фракция (HMP). Выход LMP составил 40%, а HMP - 52%. Фракция LMP была разделена с помощью ионообменной хроматографии на Q-sepharose на 7 фракций (F1, F4, F5, F6, F7, F10, F11), , структура фракций F1, F4, F5, F10, F11 была установлена.
Спектры ЯМР показали, что полученные фракции представляют собой сульфатированные олигосаха-риды, состоящие преимущественно из повторяющегося фрагмента ^3-a-L-Fucp(2SO3-)-1^4-a-L-Fucp(2,3SO3)-1^. Фракция F5 содержит фрагмент
^3-a-L-Fucp(2,4SO3)-1^, фракция F1 - несуль-фатированную боковую цепь a-L-Fucp-l^-2-a-L-Fucp-1^-, примыкающую к основной в положении C4 моносахаридного остатка.
Представляло интерес исследование биологического действия нативного фукоидана и продуктов его ферментативной трансформации: были определены in vitro цитотоксичность полученных препаратов и их способность ингибировать самопроизвольное формирование и рост колоний клеток карциномы толстого кишечника человека.
Клетки карциномы толстого кишечника человека DLD-1 обрабатывали фукоиданом ShF, HMP и олигосахаридами F1, F4, F10 и F11 в концентрации 200 мкг/мл и инкубировали 24 ч как описано ранее (Меньшова, 2014). Исследуемые поли- и олигосаха-риды были нетоксичны для исследуемой линии клеток в концентрациях до 200 мкг/мл. Фукоидан ShF, HMP и олигосахариды F1, F4, F10 и F11 исследовали на способность ингибировать образование и рост колоний опухолевых клеток как описано в [3]. Результаты показали, что все полисахариды: исходный фукоидан ShF (100 мкг/мл) и HMP проявляли активность против образования и роста колоний клеток карциномы толстого кишечника человека DLD-1.
Исходный фукоидан ScF (100 мкг/мл) и высокомолекулярный продукт HMP в одинаковой степени подавляли образование и рост колоний клеток DLD-1 (примерно на 50%) по сравнению с контрольным образцом (не содержащим препараты). Олигосахариды не оказывали влияние на образование и рост колоний исследуемых клеток. Отличие противоопухолевой активности фукоиданов и олигосахаридов можно объяснить их структурными особенностями. В различных исследованиях показано, что для проявления биологического действия олигосахаридов важна степень полимеризации [4], нами установлено, что суль-фатированные олигосахариды (n=4-10) не обладали противоопухолевой активностью in vitro. Показано, что HMP проявлял активность сравнимую с активностью исходного фукоидана, что делает его перспективным для дальнейших исследований in vivo.
Вывод
Установлено, что олигосахариды (со степенью полимеризации 4-10) не оказывали влияние на образование и рост колоний клеток карциномы толстого кишечника человека. Получен высокомолекулярный продукт ферментативной трансформации фукоида-на из Sargassum horneri, показано, что его противоопухолевое действие in vitro сопоставимо с действием природного фукоидана.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №16-14-1-131.
HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 89
Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»
ЛИТЕРАТУРА
1. Usoltseva R.V., Zhao P., Kusaikin M.I., Jia A., Yuan W., Zhang M., Liu C., Ermakova S.P. Fucoidans from a brown alga Sargassum muticum: structural characteristics and anti-tumor activity. Chem. Nat. Comp. 2017, 53, 188-191.
2. Silchenko A.S., Kusaykin M.I., Kurilenko V.V., Zakharenko A.M., Isakov V.V., Zaporozhets T.S., Gazha A.K., Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae. Mar. Drugs. 2013; 11: 2413-2430.
3. Menshova R.V., Ermakova S.P., Anastyuk S.D., Isakov V.V., Dubrovskaya Yu.V., Kusaykin M.I., Um B.H., Zvyagintseva T.N. Structure, enzymatic transformation and anticancer activity of branched high molecular weight laminaran from brown alga Eisenia bicyclis. Carbohydr. Polym. 2014; 99(2): 101-109.
4. Clément M.J., Tissot B., Chevolot L., Adjadj E., Du Y., Curmi P.A., Daniel R. NMR characterization and molecular modeling of fucoidan showing the importance of oligosaccharide branching in its anticomplementary activity. Glycobiology. 2010; 20: 7883-7894.
Сведения об авторах
Расин А.Б. - ТИБОХ ДВО РАН, ведущий инженер, e-mail: abrus_54@mail.ru; Сильченко А.С. - ТИБОХ ДВО РАН, к.х.н., н.с., e-mail: artem.silchencko@yandex.ru; Кусайкин М.И. - ТИБОХ ДВО РАН, к.б.н., зам. директора, e-mail: mik@piboc.dvo.ru; Калиновский А.И. - ТИБОХ ДВО РАН, д.х.н., с.н.с., e-mail: kalinovsky@piboc.dvo.ru; Маляренко О.С. - ТИБОХ ДВО РАН, к.х.н., н.с., e-mail: swetlana_e@mail.ru; Зуева АО - ТИБОХ ДВО РАН, студентка ДВФУ, e-mail: zstoisya95@gmail.ru; Звягинцева Т.Н. - ТИБОХ ДВО РАН, д.х.н., г.н.с., e-mail: zvyag@piboc.dvo.ru; Ермакова С.П. - ТИБОХ ДВО РАН, д.х.н., зав.лаб., e-mail: swetlana_e@mail.ru.
© Коллектив авторов, 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817847
Удк 616.379-008.64; 593.95; 615-035
И.Г. Трифонова, Н.В. Сергеева, Л.Н. Богданович
реабилитация пациентов с сахарным диабетом 2 типа с помощью биологически активных веществ из икры морских ежей
ФГБУЗ «Медицинское объединение Дальневосточного отделения РАН», Владивосток
Проведена оценка эффективности применения биологически активных веществ из икры морских ежей Тихого океана у пациентов с сахарным диабетом 2 типа при реабилитации. Показано, что у пациентов, принимающих дополнительно к сахароснижающей терапии биологически активные вещества из икры морских ежей, отмечается снижение интенсивности процессов перекисного окисления липидов и усиление системы антиоксидантной защиты, а так же более выраженная нормализация распределения холестерина между фракциями липопротеидов, жирнокислотного состава и гликемического профиля.
Ключевые слова: сахарный диабет 2 типа, биопрепараты из икры морских ежей, липиды, липопероксида-ция, антиоксидантная защита, медицинская реабилитация.
I.G. Trifonova, N.V. Sergeeva, L.N. Bogdanovich
rehabilitation of patients
with diabetes mellitus type 2 using
biologically active substances of sea urchin eggs
Medical Association FEB RAS, Vladivostok, Russia
The effectiveness of the application of biologically active substances from caviar of sea urchins of the Pacific Ocean has been evaluated in patients with type 2 diabetes in rehabilitation. It is shown that in patients taking supplementary to hypoglycemic therapy, biologically active substances from sea urchin caviar, there is a decrease in the intensity of lipid peroxidation processes and the strengthening of the antioxidant defense system, as well as a more pronounced normalization of cholesterol distribution between lipoprotein fractions, fatty acid composition and glycemic profile.
Keywords: diabetes mellitus type II, biological products from sea urchin eggs, lipids, lipoperoxidation, antioxidant protection, rehabilitation, prevention.
