CC BY
64
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ... 59
УДК (516-006.3.04-092.9:615.277.3 Т.Л. Юркштович1, П.М. Бычковский1, Н.В. Голуб1, В.А. Алиновская1, Р.И. Костерова1, А.А. Кладиев2,
С.А. Красный3, Ю.П. Истомин3, Е.Н. Александрова3, М.Ю. Ревтович3, А.И. Шмак3 ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ ПРОСПИДИНА IN VIVO НА МОДЕЛЯХ САРКОМЫ М-1 И САРКОМЫ ЙЕНСЕНА
1Учреждение БГУ «Научно-исследовательский институт физико-химических проблем», Минск
2ООО «Биотехнологическая компания ТНК», Москва
3РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова, пос. Лесной, Минская область
Контактная информация
Наталья Васильевна Голуб, старший научный сотрудник лаборатории лекарственных средств на основе модифицированных полисахаридов
адрес: 220030, г. Минск, ул. Ленинградская, 14; тел/факс +7(10)-(375)-17-209-55-86 e-mail: natali.golub@tut.by
Статья поступила 21.09.2011, принята к печати 31.08.2012.
Резюме
Изучено влияние иммобилизованной формы проспидина на рост подкожно перевитых опухолей саркомы М-1 и Йенсена в сравнении с раствором субстанции проспидина, полимером-носителем. Показано, что иммобилизованная форма проспидина обеспечивает повышение эффекта противоопухолевой активности по сравнению с раствором проспидина с такой же дозой активного вещества, излечение животных наблюдали в 100 % случаев.
Ключевые слова: иммобилизованная форма, проспидин, фосфат декстрана, саркома М-1 крыс, саркома Йенсена крыс.
T.L. Yurkshtovich1, P.M. Bychkov sky1, N.V. Golub1, V.A. Alinovskaya1, R.I. Kosterova1, A.A. Kladiev2, S.A. Krasny3 , Yu. P. Istomin3, E.N. Alexandrova3, M.Yu. Revtovich3, A.I. Shmak IN VIVO ANTINEOPLASTIC EFFECT
OF POLYMER-IMMOBILIZED PROSPIDIN ON RAT M-1 SARCOMA AND RAT JENSEN SARCOMA USED AS A MODELS
1Belorussian State University, Research Institute for physical Chemical Problem, Minsk
2Biotechcompany TNK, Moscow
3N.N. Alexandrov National Cancer Center of Belarus, Minsk Abstract
The effect of prospidin in immobilized form on growth of subcutaneously implanted M-1 sarcoma and Jensen sarcoma was studied in comparison with prospidin solution and polymer carrier (dextran phosphate). It was shown that immobilized prospidin form provides an increase of antitumor activity effect in comparison with prospidin solution with the same dose of active substance and results in animal recovery in 100% of cases.
Key words: prospidin hydrogel, dextran phosphate, rat M-1 sarcoma, rat Jensen sarcoma.
Введение
Отечественный противоопухолевый препарат проспидин, [дихлорид К^-ди^-хлор-Р-оксипропил)-^, К2-диспиротрипиперазиния]
используется в медицинской практике при лечении рака гортани, кожных ретикулезов, рака мочевого пузыря и других видов злокачественных новообразований [1; 2]. Он характеризуется хорошей переносимостью больными, большим диапазоном доз, при которых проявляется терапевтическое действие препарата без побочных явлений. Однако, биологическая доступность проспидина при внутривенном введении ограничена быстрым исчезновением препарата или продуктов его трансформации из крови, что препятствует достижению максимального лечебного действия [2]. В связи с этим, возможность получения пролонгированной формы проспидина, способной поддерживать действующую концентрацию цитостатика в крови в течение длительного времени, является важной и актуальной задачей. Одним из эффективных решений этой проблемы является химическая модификация проспидина путем присоединения его к нетоксичным полимерам, способным к биодеструкции. Сведения о по-
лучении пролонгированных форм проспидина, которые могут найти применение для локальной терапии различных патологических процессов, в литературе отсутствуют.
Данная работа посвящена получению иммобилизованной формы проспидина и изучению ее противоопухолевой активности на моделях саркомы М-1 и саркомы Йенсена. В качестве полимера-носителя для иммобилизации проспидина был использован фосфат декстрана, который относится к классу малотоксичных веществ, обладает иммуномодулирующей активностью, способностью к биодеградации и может быть получен в виде микрогелей.
Материалы и методы
Объекты и реактивы
В качестве исходных материалов и реактивов в работе использовали: декстран с молекулярной массой 60000 Да (НД № РБ 0221 С-2008), ортофосфорную кислоту (ГОСТ 6552-80, р4 = 1,698 г/мл; с = 85,4 %), мочевину (х.ч.), гидроксид натрия, соляную кислоту, азотную кислоту, серную кислоту, перекись водорода, молибдат аммония, ванадат натрия, муравьиную кислоту, уксусный
ангидрид, хлорную кислоту, кристаллический фиолетовый (все реагенты с маркой «чда»), субстанцию проспидина (ФСП 1501 - 10).
Приборы
HK-спектрофотометр Thermo Nicolet FT-IR Nexus, спектрофотометр UV VIS РВ 2201, аппарат для определения азота, р^метр HI 9321, газовый хроматограф Agilent 7890A с двумя детекторами FID и MSD.
Получение
иммобилизованной формы проспидина
Для получения иммобилизованной формы проспидина (ПР) в качестве полимера-носителя использовали фосфат декстрана (ФД) с содержанием фосфорнокислых групп 2,2 ммоль/г, образующий при набухании в воде (степень набухания 160 г/г) суспензию микрогелей, проходящую через иглу шприца (2 мл). Синтез ФД осуществляли проведением реакции этерификации декстрана ортофосфорной кислотой в присутствии мочевины в течение 3 ч при массовом соотношении декстран: ^РО4 : CO(NH2)2= 1 : 0,44 : 1,49, температуре 125 °С и остаточном давлении в зоне реакции < 0,2 атм [3].
Образцы иммобилизованной формы проспи-дина с соотношением ФД : ПР = 1 : 1 (ФД(1) - ПР) и 2 : 1 (ФД(2) - ПР) синтезировали путем набухания ФД в водных растворах цитостатика с заданными концентрациями и последующего лиофильного высушивания. Полученные образцы стерилизовали радиационным методом (доза 2,5 Мрад).
О химическом взаимодействии проспидина с ФД свидетельствуют данные ИK-спектроскопии: в nK-спектрах иммобилизованных форм проспидина по сравнению с HK-спектром аддитивной смеси ФД и проспидина отсутствует полоса поглощения при 2360 см-1 (валентные колебания гидроксилов фосфорнокислых групп, ассоциированных водородными связями) и уменьшается интенсивность полос поглощения при 2980, 2900 и 2847 см-1 (валентные колебания С-H в группах Œ, Œ2, Œ2Q проспидина).
Отмеченные изменения в nK-спектрах, а также данные рH-метрии свидетельствуют об электростатических и донорно-акцепторных связях проспи-дина и ФД.
^оме того, нельзя исключить и наличие свободных не связанных с полимером молекул проспи-дина, которые при набухании препарата в воде распределены в пространственной сетке образовавшегося геля. Разделение свободной, растворенной в воде гидрогеля, и полимер-связанной фракций про-спидина в набухших препаратах, в работе не проводили. Однако, сопоставление содержания фосфорнокислых групп в ФД и соотношения полимер: цитостатик показывает, что доля свободных молекул проспидина выше в препарате ФД(1) - ПР.
Исследование
противоопухолевой активности
иммобилизованной формы проспидина in vivo
Исследования проведены на 120 белых беспородных крысах обоего пола (80 крыс с саркомой М-1 и 40 крыс с саркомой Йенсена), полученных из вивария PHПЦ ОМР им. H.H. Александрова. Животные находились на стандартной диете и в обычном питьевом режиме.
Использовали два штамма перевиваемых опухолей крыс: саркому М-1, полученную из Банка опухолевых штаммов ФГБУ «РОИЦим. H.H. Блохина» PAMH (Москва) и саркому Йенсена, полу-
ченную из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) [4], которые поддерживали путем перевивки животным каждые 2 недели. Для экспериментов крысам с массой тела 120-160 г перевивали опухоли подкожно в область левого бедра, вводя по 0,5 мл 20 %-ной взвеси опухолевой ткани.
Эксперименты проводили на 7-10 сутки после перевивки опухоли крысам. В каждой контрольной и опытной группах использовали по 8-10 крыс.
Перед применением к препаратам ФД1 - ПР и ФД(2) - ПР добавляли по 10 мл стерильной воды и выдерживали для набухания и образования суспензии набухших микрогелей.
Полученные суспензии вводили крысам однократно внутрибрюшинно в объемах 1 или 2 мл на 100 г массы тела так, чтобы дозы препаратов составляли от 1000 до 3000 мг/кг массы животного. Дозы препаратов и составляющих их компонентов, а также результаты оценки эффективности противоопухолевого действия приведены в таблицах 1, 2 и на рисунках 1 - 3.
Использовали следующие критерии оценки противоопухолевой эффективности:
■ динамика роста опухоли: для этого 3 раза в неделю проводили измерения размеров опухолей в контрольных и опытных группах с последующим построением кривых роста;
■ объем опухоли (V, см3) рассчитывали по формуле:
Л, (а х b х с)ж
V =--------------, где
6
a, b и с - линейные размеры опухоли в см; индекс роста опухоли (ИРО) [1]:
ИРО,% = р°.)100% , где Sk
S0 и Sk - площади под кинетической кривой роста опухолей в опытной и контрольной группах животных;
■ средняя продолжительность жизни (СПЖ) павших животных;
■ число излеченных животных: излеченными считали выживших через 60 дней после лечения животных, у которых опухоль не пальпировалась.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, используя программу Origin 7 (2002 год).
Результаты
Изучение противоопухолевой активности
на штамме саркомы М-1
Результаты, представленные на рис. 1 и 2 и в табл. 1, свидетельствуют, что проспидин и его иммобилизованные формы: ФД(1) - ПР и ФД(2) - ПР, а также и сам ФД вызывали торможение роста опухоли у крыс с перевитой саркомой М-1 (Са М-1) по сравнению с контролем.
Динамика изменения объемов опухолей в течение 40 дней наблюдения показывает, что наиболее выраженное противоопухолевое действие оказывал препарат ФД(1) - ПР в дозе 2000 мг/кг, что эквивалентно вводимым дозам проспидина и ФД по 1000 мг/кг веса животного (рис. 1; 2).
\ / 3
V, см
Время, сут.
Рис. 1. Динамика роста Са М-1 крыс в контроле (1) и после однократного внутрибрюшинного введения ФД (2) в дозе 2000 мг/кг, субстанции ПР (3) в дозе 1000 мг/кг и ФДр) - ПР (4) в дозе 2000 мг/кг.
\ / 3
V, см
Время, сут.
Рис. 2. Динамика роста Са М-1 крыс после однократного внутрибрюшинного введения препаратов ФДц - ПР (1, 4) и ФД(2) - ПР (2, 3) в дозах в пересчете на проспидин 500 (1, 2) и 1000 (3, 4) мг/кг.
V, см3
Время, сут.
Рис. 3. Динамика роста саркомы Йенсена крыс в контроле (1) и после однократного внутрибрюшинного введения препаратов: 2 - ФД в дозе 1000 мг/кг, 3 - субстанция ПР в дозе 1000 мг/кг, 4 - ФД(1) - ПР в дозе 2000 мг/кг (эквивалентно 1000 мг/кг проспидина).
62 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ...
Таблица 1
Влияние исследуемых препаратов на ИРО, СПЖ и число излеченных животных с саркомой М-1
Группа доза, мг/кг доза компонента , мг/кг 8 под кривой роста опухоли, см X с. ИРО, % СПЖ, с. Излеченные животные, %
ПР ФД
1 - - - 690,91±55,62 100 31,5±2,24 0
2 2000 - 2000 239,75±17,01 34,70 40,0±7,25 0
3 500 500 - 36,14±3,37 5,23 65,5±9,40' 50
4 1000 1000 - 34,18±2,50 4,95 62,8±4,97' 50
5 1000 500 500 127,95±8,52 18,52 60,1±8,90* 0
6 2000 1000 1000 14,85±1,96 2,15 >60 100
7 1500 500 1000 43,85±2,65 6,35 >60 100
8 3000 1000 2000 31,06±2,60 4,50 67,6±2,66* 50
достоверные различия с контролем (р<0,05); число крыс в каждой группе - 8. Группа: 1 - контроль, 2 - ФД, 3-4 - ПР, 5-8 - ФД-ПР
Таблица 2
а п п р Г доза, мг/кг доза компонента, мг/кг 8 под кривой роста опухоли, см X с. ИРО, % СПЖ, с. Излеченные животные, %
ПР ФД
1 - - - 353,45±31,91 100 30,5±2,52 0
2 1000 - 1000 36,80±2,17* 10,41 37,4±7,25 10
4 1000 1000 - 7,65±0,44* 4,95 62,8±2,96' 50
6 2000 1000 1000 4,80±0,41' 1,36 >60 100
достоверные различия с контролем (р<0,05); число крыс в каждой группе - 10. Группа: 1 - контроль, 2 - ФД, 4 - ПР, 6 - ФД(і)-ПР
Площадь под кривой роста опухоли Са М-1 после введения крысам препарата ФД<1) - ПР в дозе, эквивалентной 1000 мг/кг проспидина, статистически достоверно меньше, чем при введении такой же дозы чистой субстанции цитостатика -14,85±1,96 и 34±2,50 см3хсутки (табл. 1). Препарат ФД(1) - ПР в указанной дозировке вызывал статистически достоверное торможение роста Са М-1 во все сроки наблюдения, а начиная с 28 суток после перевивки, процент торможения опухоли достигал 100 %. Наименее выраженным противоопухолевым действием обладал ФД, для которого на 28 сутки наблюдения за животными процент торможения опухоли равнялся 57 %.
Противоопухолевые эффекты исследуемых препаратов оценивались и по показателю ИРО, который, согласно [5], учитывает не только величину, но и продолжительность противоопухолевого действия (чем меньше ИРО, тем продолжительнее и сильнее противоопухолевый эффект).
По эффективности противоопухолевого действия, оцениваемой по показателю ИРО (табл. 1), изученные препараты, вводимые животным-опухо-леносителям в дозах, эквивалентных 500 и 1000 мг/кг проспидина, можно расположить в следующих последовательностях:
ФД(1) - ПР < ФД(2) - ПР < ПР (для дозы 500 мг/кг) и пР < ФД(2) - ПР< ФД(1) - ПР (для дозы 1000 мг\кг).
Сравнение этих двух последовательностей позволяет сделать предположение о том, что при одинаковой дозе активного вещества существенное влияние на выраженность противоопухолевого действия оказывает количество содержащегося в препарате ФД.
Так, при введении крысам препаратов ФДр)
- ПР и ФД(2) - ПР в дозах, эквивалентных 1000 мг/кг проспидина (№9 6 и 8 в табл. 1), противоопухолевый эффект препарата ФД(1) - ПР был выше по сравнению с эффектом препарата ФД(2) - ПР, со-
держащего в два раза больше ФД (ИРО составляют 2,15 и 4,65 соответственно). Причиной такого влияния ФД в препарате может быть увеличение доли свободных не связанных с функциональными группами полимера молекул проспидина, распределенных в пространственной сетке набухшего геля ФД и характеризующихся значительно более высокой скоростью поступления в окружающие ткани организма животных. Это позволяет в более ранние сроки достигать эффективных концентраций цитостатика в опухоли и затем постоянно поддерживать их за счет более медленного высвобождения, связанного с функциональными группами проспидина, протекающего за счет обменных и биодеструктивных процессов. Кроме того, необходимо отметить, что приготавливаемые непосредственно перед применением суспензии с различными концентрациями по полимерному компоненту (ФД), имеют, соответственно, и различную консистенцию: если микрогели препарата ФД(2) - ПР занимают практически весь объем суспензии, то в случае ФДо) - ПР наблюдается ее расслоение. Это не влияет на эффективность препарата ФД(1) - ПР при его внутрибрюшинном введении в дозе, эквивалентной 1000 мг/кг проспидина, но может являться причиной аномально низкой противоопухолевой активности (ИРО=18,52) при уменьшении дозы в два раза (500 мг/кг проспидина).
Для препарата ФД(1) - ПР и субстанции ПР, вводимых в дозе, эквивалентной 1000 мг/кг цитостатика, в начальный период времени (до 22 суток после перевивки) тенденция торможения объема опухоли одинакова. Далее в случае введения субстанции наблюдается рост объема опухоли, а в случае введения препарата ФД(1) - ПР рецидивный рост опухоли отсутствует. Это свидетельствует о более длительном противоопухолевом эффекте иммобилизованной формы проспидина по сравнению с субстанцией.
Подтверждением достижения пролонгации действия цитостатика при иммобилизации его на ФД являются полученные нами данные по исследованию фармакокинетики меченых 14С проспидина и препарата ФД(1) - ПР при их однократном внутри-брюшинном введении крысам в одинаковых дозах в пересчете на активное вещество: для проспидина и препарата ФД(1) - ПР значения периода полувы-ведения (Т1/2) составляли 0,25 и 25,09 ч, соответственно (по результатам изучения фармакокинетики иммобилизованных форм проспидина при различных путях поступления препаратов в организм животных готовится отдельная статья).
Из результатов, приведенных в табл. 1, видно, что в группах животных, где для противоопухолевой терапии использовались препараты иммобилизованной формы проспидина (гр. 6 и 7, табл. 1), у всех животных через 60 дней после лечения опухоль не пальпировалась, т. е. число излеченных животных достигало 100 %.
Этот показатель был в два раза выше по сравнению с таковым для животных тех групп, в которых в качестве средства противоопухолевой терапии использовался проспидин.
Тем не менее, во всех группах наблюдалось статистически достоверное увеличение средней продолжительности жизни по сравнению с контролем.
Таким образом, на модели опухоли Са М-1 наиболее эффективным оказался препарат ФД(1)
- ПР, вводимый однократно внутрибрюшинно в дозе 2000 мг/кг (эквивалентно дозе цитостатика 1000 мг/кг).
Изучение противоопухолевой активности на штамме саркомы Йенсена крыс Результаты сравнительного исследования противоопухолевой активности субстанции ПР, ФД и препарата ФД(1) - ПР при однократном внутрибрюшинном введении крысам с перевитой саркомой Йенсена приведены на рис. 3 и в табл. 2. Видно, что, как и в случае саркомы М-1, наиболее выраженным противоопухолевым эффектом обладает препарат ФД(1) - ПР. Так, площади под кривой роста опухоли и значения ИРО после однократного внутрибрюшинного введения крысам с перевитой саркомой Йенсена препарата ФДщ -ПР были статистически достоверно меньше, чем при введении субстанции проспидина. Однократное внут-рибрюшинное введение субстанции проспидина в дозе 1000 мг/кг крысам с перевитой саркомой Йенсена достоверно увеличивало СПЖ по сравнению с контролем и ФД, при этом у 50 % животных через 60 суток после лечения опухоль не пальпировалась, т. е. они считались излеченными. При введении препарата ФД(1) - ПР излеченными были все животные.
Заключение
Препарат ФД^) - ПР, представляющий собой иммобилизованный на фосфате декстрана проспи-дин с соотношением компонентов 1 : 1, при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 2000 мг/кгкрысам с перевитыми саркомой М-1 и саркомой Йенсена (эквивалентно 1000 мг/кг субстанции проспидина), обеспечивает значительное повышение эффективности противоопухолевой активности по сравнению с субстанцией проспидина.
Литература
1. Деев В.Б., Сингин Ф.С., Королев Г.К. и др. Синтез и особенности распределения проспидина-14С, меченого по диспиротрипиперазинию // Хим.-фарм. ж. - 1980. - Т. l4, № 1. - С. 7-10.
2. Чернов В.А., Богомолова Н.С., Минакова С.М. и др. Фармакокинетика проспидина у крыс. Сборник научных трудов Всесоюзного науч.-исслед. Химико-фармац. Института, «Фармакокинетика и метаболизм лекарственных препаратов». - Москва, 1978. Вып. 7. - С. 23 - 46.
3. Юркштович Т.Л., Кладиев А.А., Голуб Н.В. и др. Гидрогелевый противоопухолевый препарат. Пат.
РБ № 14762 .
4. Каталог Российской коллекции клеточных культур. - СПб, 2004. - С. 315.
5. Стуков А.Н., Иванова М.А., А.К. Никитин и др. Индекс роста опухоли как интегральный критерий эффективности противоопухолевой терапии в эксперименте // Вопросы онкологии. - 2001. - Т. 47, № 5. - С. 616 - 618.
