CC BY
3
DOI: 10.24412/2226-0757-2023-13001
Актуальные вопросы неврологии
Протеомный профиль ротовой жидкости у пациентов с сосудистыми когнитивными расстройствами
М.Ю. Максимова, С.Н. Иллариошкин, A.B. Митронин, O.A. Антонова
Когнитивные нарушения являются одной из ведущих проблем современной медицины. В недавних исследованиях ротовой жидкости у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями был обнаружен параллелизм биохимических нарушений с прогрессирующим снижением когнитивных функций, однако в отношении сосудистых когнитивных нарушений (СКН) таких работ не проводилось. Целью работы являлось исследование протеомного профиля ротовой жидкости у пациентов с СКН в стадии умеренного когнитивного расстройства (У-СКН). Обследовано 13 пациентов с У-СКН (6 мужчин, 7 женщин; средний возраст 51,2 ± 7,9 года). Контрольная группа была представлена 11 здоровыми лицами (4 мужчины, 7 женщин; средний возраст 52,3 ± 6,8 года). Протеомный профиль ротовой жидкости изучали с помощью хромато-масс-спектрометрии. При исследовании ротовой жидкости обнаружены количественные различия в концентрации 107 белковых молекул между пациентами с У-СКН и здоровыми лицами, причем белок эндоплазмин обнаружен только в группе У-СКН. Полученные результаты пилотного исследования показывают возможность применения хромато-масс-спектрометрии слюны для ранней диагностики У-СКН.
Ключевые слова: сосудистые когнитивные нарушения, слюна, протеомный профиль, хромато-масс-спектрометрия.
В связи с возрастанием общей продолжительности жизни и отчетливой тенденцией к повышению доли лиц пожилого возраста увеличивается частота хронических прогрессирующих форм нарушений мозгового кровообращения и сосудистых когнитивных нарушений (СКН) [1, 2].
Несмотря на достигнутые успехи в разработке концепции СКН, многие вопросы, касающиеся ранней диагностики патологического процесса (на стадии умеренного когнитивного расстройства, УКР), остаются недостаточно изученными [3, 4]. В последние годы предметом углубленных исследований является поиск молекулярно-патобио-химических биомаркеров и сигнальных молекул в крови и
Марина Юрьевна Максимова - докт. мед. наук, профессор, рук. 2-го неврологического отделения ФГБНУ "Научный центр неврологии"; профессор кафедры неврологии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России.
Сергей Николаевич Иллариошкин - докт. мед. наук, профессор, акад. РАН, зам. директора по научной работе ФГБНУ "Научный центр неврологии", директор Института мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии"; зав. кафедрой неврологии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России. Александр Валентинович Митронин - докт. мед. наук, профессор, декан стоматологического факультета, зав. кафедрой кариесологии и эндодонтии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России. Олеся Александровна Антонова - аспирант, ассистент кафедры кариесологии и эндодонтии ФГБОУ ВО "Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова" Минздрава России. Контактная информация: Максимова Марина Юрьевна, ncnmaximova@mail.ru
цереброваскулярной жидкости, ответственных за возникновение СКН [5-7]. Особое внимание уделяется поиску минимально инвазивных методов диагностики СКН и внедрению их в практическое здравоохранение [8-10]. Большие надежды в этой области связаны с проведением про-теомных и метаболомныхисследований [11].
Среди стандартных биологических жидкостей, исследование которых может иметь биомаркерное значение, особое место занимает ротовая жидкость, в которой обнаруживается большой спектр органических и неорганических соединений [12-15]. Забор слюны безопасен, может быть выполнен в любое время и без помощи специализированного медицинского персонала. Неинвазивность получения ротовой жидкости исключает возникновение негативных психологических реакций у пациента [16].
Целью работы являлось исследование протеомного профиля ротовой жидкости у пациентов с СКН в стадии УКР (У-СКН).
Материал и методы
Для реализации цели было проведено обследование 24 пациентов, которые были распределены в 2 группы в соответствии с поставленным диагнозом. Основную группу составили 13 пациентов с У-СКН (6 мужчин, 7 женщин; средний возраст 51,2 ± 7,9 года), которые находились на лечении во 2-м неврологическом отделении ФГБНУ "Научный центр неврологии". В контрольную группу вошло 11 человек (4 мужчины, 7 женщин; средний возраст 52,3 ±6,8 года) без соматической патологии в анамнезе. Все пациенты получили памятку о проводимом исследовании и подписали добровольное информированное согласие.
+ Белки со статистически незначимыми различиями Белки со статистически значимыми различиями
Рис. 1. Volcano-диаграмма. Точки в области отрицательных значений принадлежат белкам, интенсивность сигнала пептидов которых выше у пациентов контрольной группы. Точки в области положительных значений принадлежат белкам, интенсивность сигнала пептидов которых выше у пациентов с У-СКН.
Критерии включения:
- мужчины и женщины в возрасте от 45 до 60 лет;
- У-СКН (показатель по Монреальской шкале оценки когнитивных функций (Montreal Cognitive Assessment, МоСА) от 21 до 25 баллов), отсутствие транзиторных ишемических атак и ишемических инсультов в анамнезе, изменения на магнитно-резонансной томограмме, соответствующие церебральной микроангиопатии согласно критериям STRIVE-1 (STandards for Reporting Vascular changes on nEuroimaging 1 - Стандарты регистрации сосудистых изменений при нейровизуализации 1) [17];
- проведение профессиональной гигиены полости рта.
Критерии исключения: декомпенсированная соматическая патология.
Диагноз СКН был основан на критериях исследования VICCCS [18].
Пациентов тестировали с использованием госпитальной шкалы тревоги и депрессии (Hospital Anxiety and Depression Scale, HADS) и шкалы МоСА.
Образцы ротовой жидкости собирали в градуированные пластиковые пробирки объемом 15 мл в течение 5-7 мин в утренние часы (9:00-11:00) натощак методом сплевывания. Полученные образцы ротовой жидкости до начала лабораторного исследования замораживали при -4°С, затем медленно размораживали при комнатной температуре с последующим изучением методом хромато-масс-спектрометрии. Исследование проводили в 2 этапа. На 1 -м этапе осуществляли пробоподготовку образцов для протеомного анализа: измеряли концентрацию белка и гидролизовали трипсином на фильтре S-trap. На 2-м этапе выделенные пептиды анализировали с использованием системы нанопотоковый хроматограф-масс-спектрометр
высокого разрешения и проводили биоинформатическую обработку результатов.
Хромато-масс-спектрометрический анализ проб после гидролиза осуществляли с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии UltiMate 3000 RSLCnano, соединенной с масс-спектрометром Q-Exactive.
Идентификацию белков проводили при помощи программы MaxQuant v. 1.6.17.0 с использованием поискового алгоритма Andromeda. Для идентификации белков использовали базу данных UniProt (Swiss-prot) Homo sapiens. Белки рассматривались в качестве достоверно идентифицированных, если для них было обнаружено по крайней мере 2 пептида. Безметковая количественная оценка содержания белков производилась с помощью ¡BAQ (intensity based absolute quantification - абсолютное количественное определение на основе интенсивности) и LFQ (label-free quantification - количественный анализ без меток).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы Statistica 10.0. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
УобследованныхпациентовсУ-СКН средняя сумма баллов по HADS (раздел "тревога") составила 13,8 ± 1,3 (клинически выраженная тревога), по шкале МоСА - 21,8 ± 1,4. Изменения на магнитно-резонансной томограмме соответствовали стадии Fazekas 1-2 церебральной микроангиопатии.
Методом хромато-масс-спектрометрии был проведен анализ 2 образцов слюны для каждого обследуемого. Идентифицировано 218 белков в пробах ротовой жидкости пациентов основной и контрольной групп. По результатам биоинформатического анализа установлены наиболее часто представленные в пробах белки: проба 1 - аннексии А1, а-амилаза 1, а-амилаза 2В, а-амилаза панкреатическая, лизоцим С; проба 2 - нейтрофильный дефензин 3, человеческий белок 3-56, нейтрофильный дефензин 2, нейтрофильный дефензин 1, человеческий белок 1-56, а-амилаза 1, а-амилаза 2В, а-амилаза панкреатическая, гистон Н2А.
Статистический анализ проб ротовой жидкости позволил выявить закономерности в распределении белков в группах. С использованием Volcano-диаграммы было выявлено 107 белков, интенсивность сигналов пептидов которых значимо различалась в образцах ротовой жидкости у пациентов с У-СКН и у лиц контрольной группы (рис. 1).
Анализ с использованием биологических баз данных показал, что наибольшая доля идентифицированных белков выполняют каталитическую функцию (рис. 2-4), т.е. являются ферментами (каталитическая активность, G0:0003824 (GO - Gene Ontology ("Генная онтология")). Вторая по частоте группа белков, содержащихся в пробе, участвует в процессах взаимодействия с другими компо-
Каталитическая активность (60:0003824) Связывающая активность (00:0005488) Структурная молекулярная активность (30:0005198) Регулятор молекулярной функции (60:0098772) ■ Транспортная функция (00:0005215) Активность фактора трансляции (00:0045182)
Рис. 2. Распределение идентифицированных белков в ротовой жидкости по молекулярным функциям согласно аннотации йО у пациентов с У-СКН.
нентами клетки (белки, ДНК, субстраты и т.д.) (связывающая активность, 00:0005488).
При исследовании ротовой жидкости были обнаружены количественные различия в концентрации 107 белковых молекул между пациентами с У-СКН и здоровыми лицами. Отличительной особенностью результатов группы У-СКН явилась повышенная экспрессия белка эндоплазмина.
Выявление СКН на ранней стадии имеет важное значение, поскольку вероятность перехода УКР в демен-цию ежегодно составляет 14-18% [19]. Ранее проведен-
ный метаболомный анализ сыворотки крови показал, что повышенные уровни глутамата, орнитина, цитидина, сфинганина-1 -фосфата, а также галактозы и ацетона являются биомаркерами перехода УКР в болезнь Альцгеймера [20, 21]. Кроме того, обнаружено, что повышенный уровень тау-белков и фосфорилированных тау-белков в цереброспинальной жидкости ассоциируется с прогрессировани-ем УКР при болезни Альцгеймера [22].
Недавний прогресс в развитии протеомных подходов и разработке методов масс-спектрометрии высокого разрешения способствовал достижениям в идентификации и количественной оценке белков и пептидов ротовой жидкости [11, 23, 24]. Исследование методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрораспылительной ионизацией в режиме тандемной масс-спектрометрии стало "золотым стандартом" в протеомном анализе. На основании данных масс-спектрометрии устанавливают молекулярный состав, структуру и аминокислотную последовательность белков и пептидов [25].
Для определения потенциальных неинвазивных биомаркеров У-СКН нами выполнен пилотный протеом-ный анализ ротовой жидкости с использованием метода хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. В результате проведенного исследования мы обнаружили количественные изменения в белках множества клеточных путей и процессов, что при дальнейшем развитии этого подхода, основанного на интеграции параметров протео-мики, может способствовать идентификации новых биомаркеров У-СКН. Предварительные результаты свидетельствуют о том, что в профиле ротовой жидкости пациентов с У-СКН 107 белковых молекул имеют различия в экспрессии в сравнении с контрольной группой. Установлено, что
Клеточный процесс (00:0009987) Метаболический процесс (00:0008152) Физиологическая реакция на раздражитель (00:0050896) Биологическая регуляция (00:0065007) Локализация (00:0051179) Иммунный процесс (00:0002376) Физиологический процесс (00:0032501) Межвидовое взаимодействие (00:0044419) Передвижение (00:0040011) Биологическая сигнализация (00:0023052) Развитие (00:0032502) Биологическая адгезия (00:0022610) Рост (00:0040007)
Репродуктивный физиологический процесс (00:0000003) Биоминерализация (00:0110148) Репродуктивный процесс (00:0022414)
10
15 Белок,'
20
25
30
Рис. 3. Распределение идентифицированных белков в ротовой жидкости по их вовлеченности в определенные биологические процессы согласно аннотации йО у пациентов с У-СКН.
Клеточные структурные компоненты (G0:0110165) Белоксодержащий комплекс (G0:0032991) Внутриклеточные компоненты (G0:0005622)
Рис. 4. Распределение идентифицированных белков в ротовой жидкости по их локализации в клетке согласно аннотации GO у пациентов с У-СКН.
эксклюзивно представленным белком в ротовой жидкости пациентов с У-СКН является эндоплазмин. Дальнейшие исследования позволят уточнить, может ли этот белок быть принят в качестве биомаркерной молекулы для ранней диагностики заболевания.
Список литературы
1. Virani SS, Alonso A, Aparicio HJ, Benjamin EJ, Bittencourt MS, Callaway CW, Carson AP, Chamberlain AM, Cheng S, Delling FN, Elkind MSV, Evenson KR, Ferguson JF, Gupta DK, Khan SS, Kisse-la BM, Knutson KL, Lee CD, Lewis TT, Liu J, Loop MS, Lutsey PL, Ma J, Mackey J, Martin SS, Matchar DB, Mussolino ME, Nava-neethan SD, Perak AM, Roth GA, Samad Z, Satou GM, Schroed-er EB, Shah SH, Shay CM, Stokes A, VanWagner LB, Wang NY, Tsao CW; American Heart Association Council on Epidemiology and Prevention Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report from the American Heart Association. Circulation 2021 Feb; 143(8):e254-e743.
2. Вайсман Д.111., Александрова Г.А., Леонов С.А., Савина A.A. Достоверность показателей и структуры причин смерти от болезней системы кровообращения в Российской Федерации при международных сопоставлениях. Современные проблемы здравоохранения и медицинской статистики 2019;3:87-102.
3. Суслина З.А., Гулевская Т.С., Максимова М.Ю., Моргунов В.А. Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, лечение, профилактика. М.: МЕДпресс-информ; 2016. 536 с.
4. Пирадов М.А., Максимова М.Ю., Танашян М.М. Инсульт: пошаговая инструкция. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Гэотар-Медиа; 2020.288 с.
5. Azizkhanian I, Sheth SA, lavarone AT, Lee S, Kakarla V, Hinman JD. Plasma lipid profiling identifies biomarkers of cerebral microvascular disease. Frontiers in Neurology 2019 Aug; 10:950.
6. Тулаев М.Д. Проблемы оптимизации диагностики нарушений мозгового кровообращения и когнитивной дисфункции. Central Asian Journal of Medical and Natural Science 2022:100-5.
7. Maciejczyk M, Nesterowicz M, Zalewska A, Biedrzycki G, Ger-reth P, Hojan K, Gerreth K. Salivary xanthine oxidase as a potential biomarker in stroke diagnostics. Frontiers in Immunology 2022 May; 13:897413.
8. Writing Group Members; Mozaffarian D, Benjamin EJ, Go AS, Ar-nett DK, Blaha MJ, Cushman M, Das SR, de Ferranti S, Després JP, Fullerton HJ, Howard VJ, Huffman MD, Isasi CR, Jiménez MC, Judd SE, Kissela BM, Lichtman JH, Lisabeth LD, Liu S, Mackey RH,
Magid DJ, McGuire DK, Mohler ER 3rd, Moy CS, Muntner P, Mussolino ME, Nasir K, Neumar RW, Nichol G, Palaniappan L, Pandey DK, Reeves MJ, Rodriguez CJ, Rosamond W, Sorlie PD, Stein J, Towfighi A, Turan TN, Virani SS, Woo D, Yeh RW, Turner MB; American Heart Association Statistics Committee; Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation 2016 Jan;133(4):e38-360.
9. Чуканова A.C., Гулиева M.LU., Чуканова Е.И., Багманян С.Д. Применение сывороточных биомаркеров повреждения, апоп-тоза и нейротрофичности в оценке прогноза ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуск 2022; 122(8-2):48-53.
10. БелокопытоваМ.Н., Долгова И.Н., Батурин В.А., Муратова А.Ю. Роль белка S 100 в диагностике когнитивных нарушений у больных сахарным диабетом 2 типа. Современные проблемы здравоохранения и медицинской статистики 2022;5:1-10.
11. O'Sullivan ЕМ, Dowling Р, Swandulla D, Ohlendieck К. Pro-teomic identification of saliva proteins as noninvasive diagnostic biomarkers. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 2023;2596:147-67.
12. Farah R, Haraty H, Salame Z, Fares Y, Ojcius DM, Said Sadier N. Salivary biomarkers for the diagnosis and monitoring of neurological diseases. Biomedical Journal 2018 Apr;41 (2):63-87.
13. ЯнушевичО.О., Духовская H.E., Вавилова Т.П., Островская И.Г., Еварницкая Н .Р. Показатели смешанной слюны у лиц с соматической патологией. Dental Forum 2019;1(72):2-5.
14. Punyadeera С, Slowey PD. Saliva as an emerging biofluid for clinical diagnosis and applications of MEMS/NEMS in salivary diagnostics. In: Nanobiomaterials in clinical dentistry. Subramani K, Waqar Ahmed W, Hartsfield JK, editors. Oxford, UK: Elsevier; 2019: 543-65.
15. Pittman TW, Decsi DB, Punyadeera C, Henry CS. Saliva-based microfluidic point-of-care diagnostic. Theranostics 2023 Jan;13(3):1091-108.
16. D'SouzaW, Saranath D. OMICS, oral cancer molecular landscapes, and clinical practice. OMICS 2017 Dec;21(12):689-703.
17. Wardlaw JM, Smith EE, Biessels GJ, Cordonnier C, Fazekas F, FrayneR, LindleyRI, O'Brien JT, Barkhof F, BenaventeOR, Black SE, BrayneC, BretelerM, Chabriat H, DecarliC, de LeeuwFE, Douba F, Duering M, Fox NC, Greenberg S, Hachinski V, Kilimann I, Мок V, van Oostenbrugge R, Pantoni L, Speck O, Stephan ВС, Teipel S, Viswanathan A, Werring D, Chen C, Smith C, van Buchem M, Nor-rving B, Gorelick PB, Dichgans M; STandards for Reporting Vascular changes on nEuroimaging (STRIVE v1). Neuroimaging standards for research into small vessel disease and its contribution to ageing and neurodegeneration. The Lancet. Neurology 2013 Aug;12(8):822-38.
18. Skrobot OA, O'Brien J, Black S, Chen C, DeCarli C, Erkinjuntti T, Ford GA, Kalaria RN, Pantoni L, Pasquier F, Roman GC, Wallin A, Sachdev P, Skoog I; VICCCS group; Ben-Shlomo Y, Pass-more AP, Love S, Kehoe PG. The vascular impairment of cognition classification consensus study. Alzheimer's & Dementia 2017 Jun;13(6):624-33.
19. Petersen RC, Roberts RO, Knopman DS, Boeve BF, Geda YE, Ivnik RJ, Smith GE, Jack CR Jr. Mild cognitive impairment: ten years later. Archives of Neurology 2009 Dec;66( 12): 1447-55.
20. Liang Q, Liu H, Lia X, Zhang A. High-throughput metabolom-ics analysis discovers salivary biomarkers for predicting mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. RSC Advances 2016;6:75499-504.
21. Yilmaz A, Geddes T, Han B, Bahado-Singh RO, Wilson GD, Imam K, Maddens M, Graham SF. Diagnostic biomarkers of Alzheimer's disease as identified in saliva using 1H NMR-based metabolomics. Journal of Alzheimer's Disease 2017;58(2):355-9.
22. Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, Londos E, Blennow K, Minthon L. Association between CSF biomarkers and incipient Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment: a follow-up study. The Lancet. Neurology 2006 Mar;5(3):228-34.
23. Рарра Е, Vougas К, ZoidakisJ, Vastardis Н. Proteomic advances in 25. Shen X Tolic N, Xie F, Zhao R, Purvine SO, Schepmoes AA,
Proteomic Profile of Oral Fluid in Patients with Vascular Cognitive Impairment
M. Yu. Maksimova, S.N. Marioshkin, A. V. Mitronin, and O.A. Antonova
Cognitive impairment is one of the main problems of modern medicine. Recent studies of oral fluid in patients with neurodegenerative diseases have found an overlapping of biochemical abnormalities with progressive cognitive decline, but no such work has been reported for vascular cognitive impairment (VCI). The purpose of the work was to study the proteomic profile of oral fluid in patients with VCI in the stage of mild cognitive decline (M-VCI). We examined 13 patients (6 men and 7 women, mean age 51.2 ±7.9 years) with M-VCI. The comparison group consisted of 11 healthy subjects (4 men and 7 women, mean age 52.3 ± 6.8 years). The proteomic profile of oral fluid was studied by gas chromato-graphy-mass spectrometry. According to the results of the study, quantitative differences in the concentration of 107 protein molecules were established in the oral fluid of patients with M-VCI compared to healthy subjects, with endoplasmin being an exclusively represented protein in M-VCI. The results of this pilot study show the possibility of using chromatography-mass spectrometry of the oral fluid for early diagnosis of M-VCI.
Keywords: vascular cognitive impairment, saliva, proteomic profile, gas chromatography-mass spectrometry.
salivary diagnostics. Biochimica et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics 2020 Nov; 1868( 11): 140494.
Moore RJ, Anderson GA, Smith RD. Effectiveness of CID, HCD, and ETD with FT MS/MS for degradomic-peptidomic analysis: comparison of peptide identification methods. Journal of Proteome Research 2011 Sep; 10(9):3929-43. ,
24. Kallianta M, Pappa E, Vastardis H, Rahiotis C. Applications of mass spectrometry in dentistry. Biomedicines 2023 Jan;11 (2):286.
