CC BY
26
ционном периоде была рекомендована медикаментозная терапия: диеногест 2 мг в сутки от 6 месяцев и более.
Выводы
Лечебно-диагностическая лапароскопия является ведущим методом диагностики и лечения наружного генитального эноме-триоза. Только при проведении лапароскопии были диагностированы малые формы эндометриоза, инфильтративный, распространенный эндометриоз у женщин, стра-
ПРОТЕОМНЫй АНАЛИЗ 1ЧК-КЛЕТОК
дающих бесплодием, хронической тазовой болью. Наиболее информативный метод диагностики аденомиоза — трансвагинальное УЗИ. У пациенток в пре- и постменопаузе с аденомиозом и мено-, метроррагиями, при сочетании аденомиоза с миомой матки, а также при хронической тазовой боли операцией выбора была тотальная или субтотальная гистерэктомия. При диффузной форме аденомиоза у женщин репродуктивного возраста рекомендовали консервативную терапию.
© А.А. Жданова, К.Л. Белякова, Т.Е. Тертычная, К.М. Пятыгина, Ю.П. Милютина ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург
Актуальность исследования
Натуральные киллеры (ЫК-клетки) являются цитотоксическими клетками, которые активно участвуют в формировании иммунологической толерантности при беременности. Основные белки, осуществляющие их цитотоксическую функцию, известны и уже частично описаны в современной литературе. Однако ЫК-клетки, в особенности ЫК-клетки в зоне маточно-плацентарного контакта, участвующие в процессах формирования плаценты, на данный момент представляют интерес для полного протеомного исследования. Клетки линии ЫК-92, взятые для настоящего исследования, воспроизводят основные фе-нотипические и функциональные характеристики активированных ЫК-клеток.
Цель исследования
Исследование белкового профиля клеток линии ЫК-92 при спонтанном культивировании с помощью масс-спектрометрического анализа после разделения белков методом 2Б-электрофореза.
Материалы и методы исследования
Клетки линии ЫК-92 (АТСС, США) спонтанно культивировали, используя полную ростовую среду на основе минимальной среды Игла а-модификации (а-МЕМЕ), содержащую 12,5 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 12,5 % инактивированной лошадиной сыворотки, 500 Ед/мл ре-
комбинантного IL-2 («Ронколейкин», Биотех, Россия). Клетки культивировали во влажной атмосфере при 37 °С, 5 % СО2.
Клетки центрифугировали при 200 g, после чего отмывали от среды фосфатным буфером PBS и замораживали либо в лизирую-щем буфере RIPA, либо в воде Nanopure Water (Bio-Rad, США). Замороженные в воде клетки разрушали методом замораживания-оттаивания с последующей гомогенизацией. Клетки концентрировали, после чего ресуспендировали в регидратирующем буфере, мембраны отделяли центрифугированием, супернатант отбирали для изоэлектрофокусирования. Определение концентрации общего белка в клетках линии NK-92 проводили методом Лоури.
Для разделения белковой смеси использовался метод двумерного электрофореза. Регидратацию на стрипах Mini-Protean 7 cm IPG strip, pH 3-10 (Bio-Rad, США) проводили в течение 12 часов, изоэлектрофоку-сирование проходило при 50 В • ч в течение 6 часов. После изоэлектрофокусирования проводили электрофорез второго направления, белки по молекулярной массе разделяли в полиакриламидном геле в присутствии до-децилсульфата натрия при напряжении 200 В. После электрофореза пятна белковых фракций вырезали и подвергали трипсинизации с использованием трипсина бычьего в 30 мМ Трис (рН 8,2).
Масс-спектрометрический анализ белков проводили на квадруполь-времяпролетном
ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ
ТОМ LXVI СПЕЦВЫПУСК 2017
ISSN 1684-0461
масс-спектрометре Agilent ESI-Q-TOF 6538 UHD (Agilent Technologies, США), совмещенным с высокоэффективным жидкостным хроматографом Agilent 1260. Анализ масс-спектрометрических данных проводился в программе Spectrum Mill MS Proteomic Workbench с поиском по базе данных UniProt. После идентификации пептидов проверялось соответствие идентифицированного белка его реальному положению на геле.
Результаты исследования
Полученные после разрушения клеток с помощью лизирующего буфера RIPA элек-трофореграммы оказались недостаточно информативными по сравнению с разрушением клеток с помощью замораживания-оттаивания. Использование лизирующего буфера RIPA затрудняет прохождение изоэлектрофо-кусирования, особенно в диапазоне pH 8-10, где наблюдалось размывание белковых полос, что указывает на отсутствие нормального прохождения изоэлектрофокусирования в щелочной области. Отсутствие достаточного разделения белков в данном диапазоне pH, в котором, в частности, находятся изо-электрические точки гранзимов, одних из ос-
новных цитотоксических белков ЫК-клеток, указывает на трудности, с которыми можно будет столкнуться при проведении исследований по изменению цитотоксичности ЫК-клеток в присутствии трофобласта. При этом метод замораживания-оттаивания позволил получить адекватную 2Б-электрофореграмму протеома ЫК-клеток с возможностью идентификации и последующего анализа пятен методом масс-спектрометрии.
С помощью метода тандемной квадруполь-времяпролетной масс-спектрометрии были идентифицированы белки цитоскелета, ферменты гликолиза и другие белки — участники различных метаболических путей клетки.
Выводы
Метод масс-спектрометрического анализа позволил определить белковый профиль клеток линии ЫК-92 после их замораживания-оттаивания и дальнейшего разделения белков методом 2Б-электрофореза.
Исследование выполнено с использованием оборудования РЦ РМиКТ СПбГУ.
Работа поддержана грантами
РНФ № 17-15-01230 и РФФИ № 17-04-00679
уровень серотонина в тромбоцитах как показатель морфофункциональной зрелости мозга и готовности к рождению доношенного ребенка
© Н.А. Зверева
ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург
Актуальность проблемы
В последние десятилетия наблюдается рост у детей частоты когнитивных, эмоциональных расстройств, нарушений поведения и сна, истоки которых кроются в патологии перинатального периода жизни ребенка и широкого использования оперативного родоразрешения. Ведущую роль в механизмах программирования нервно-психических заболеваний играет серото-нинергическая система мозга, нормальное развитие которой определяет процессы дифференцировки нейронов, формирования межнейронных связей и становления циркадных ритмов, то есть готовность ребенка к рождению и адаптации в но-
вых условиях среды. Наиболее доступной и адекватной для оценки состояния серото-нинергической системы мозга является модель серотониновой системы тромбоцитов периферической крови, что определяет необходимость изучения содержания серото-нина в тромбоцитах новорожденных детей для разработки диагностических критериев патологии.
Цель исследования
Изучить содержание серотонина в богатой тромбоцитами плазме пуповинной крови и тромбоцитах венозной крови доношенных новорожденных детей различного гестацион-ного возраста.
■ ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА » ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ
ТОМ LXVI СПЕЦВЫПУСК 2017
ISSN 1684-0461
