CC BY
146
ПРОТЕОМИКА КОНДЕНСАТА ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА: ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВОСПАЛЕНИЯ И ДРУГИХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЛЕГКИХ
(ОРГАНИЗМЕ) ЧЕЛОВЕКА
В.С. Курова1 ([email protected]), Э.Х. Анаев2, А.С. Кононихин1, К.Ю. Федорченко1, И.А. Попов1, Д.О.
Братанов1, Е.Н. Николаев1, С.Д. Варфоломеев1
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН;
2 Институт пульмонологии МЗ РФ
Предлагаемое исследование посвящено разработке неинвазивного метода поиска и анализа белковых биомаркеров в дыхательных путях человека. Проведены работы по усовершенствованию методики подготовки конденсатов выдыхаемого воздуха для протеомного анализа, оптимизирован метод сбора конденсатов и получены достоверные данные о белковом составе конденсатов выдыхаемого воздуха 19 здоровых некурящих доноров в возрасте от 20 до 36 лет.
Дыхательная система выполняет наиважнейшую функцию жизнеобеспечения, и ее состояние отражает образ жизни человека и состояние его здоровья. В последнее время все больший интерес вызывает анализ выдыхаемого воздуха, как простой неинвазивный метод диагностики заболеваний нижних отделов дыхательных путей [1-3]. При такой диагностике собирается конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ) в стандартных условиях с помощью специальной стандартизованной аппаратуры [http://www.viasyshealthcare.com/default.aspx] (Рис. 1).
Рис. 1. Аппарат для сбора конденсатов выдыхаемого воздуха
Этот конденсат может быть проанализирован различными химическими, иммунохимическими, метаболомными и протеомными методами анализа на наличие тех или иных низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений. Наибольшее внимание до сих пор уделялось выяснению возможности диагностирования по составу КВВ воспалительных процессов. Например, концентрация пероксида водорода в КВВ в несколько раз выше у больных ХОБЛ, чем у здоровых людей [4]. В ряде работ было показано, что КВВ содержит белки и липиды, среди которых могут присутствовать потенциальные биомаркеры воспаления. Общеизвестными маркерами воспаления, которые удалось найти в КВВ, являются метаболиты арахидоновой кислоты (простагландины, лейкотриены, изопростаны и др.), и цитокины (интерлейкины, альфа-ФНО и др.). Интерес представляют также изменения целого протеома КВВ у больных и людей, подверженных различным вредным воздействиям (курение, вредные условия жизни и др.). Основной инструмент современной протеомики - ВЭЖХ-МС - анализ, который на сегодняшний день позволяет наиболее полно охарактеризовать
белковый состав КВВ, пока широко не использовался для анализа КВВ. Преимуществом этого метода является быстрая идентификация широкого спектра белков в смеси. Благодаря применению ВЭЖХ, расширяется динамический диапазон и повышается селективность МС анализа по сравнению с методами электрофореза, что позволяет одновременно получать данные о белках, концентрации которых в смеси отличаются на несколько порядков. Это является несомненным методическим достоинством при работе с КВВ, где нанограммовые количества потенциальных белковых маркеров должны определяться in situ на фоне мажорных цитоскелетных белков и сложной низкомолекулярной матрицы неизвестного состава.
Одним из хорошо известных факторов воспаления респираторного тракта является длительное курение, которое ведет к активации каскада воспалительных процессов в легких, что, в свою очередь, является причиной повреждения тканей и дисфункции дыхательных путей, хронической обструкционной болезни легких [5]. Предварительные исследования [6-9], проведенные методами бронхоскопии и сбора БАЛ, показали изменение уровня цитокинов и повышение концентрации белков в легочных лаважах у курильщиков. В то же время неизвестно, возникает ли воспалительный ответ у молодых здоровых людей при эпизодическом курении или при пассивном курении. Масштабность этой проблемы здравоохранения вызывает острую необходимость поиска простых неинвазивных методов обнаружения биомаркеров начальной стадии воспалительных процессов дыхательных путей и дисфункции легких в группе риска [10].
В ряде работ, в том числе, и нами, показано, что цитоскелетные кератины являются основными белковыми компонентами КВВ как курильщиков, так и некурящих здоровых доноров [11-14]. Показано, что ряд кератинов циркулирует между легкими и окружающим воздухом [12, 14]. Установлено также, что содержание кератинов значительно повышается в КВВ здоровых молодых интенсивно курящих людей [11, 13, 15].
Группы, вовлеченные в исследования протеомного состава КВВ, используют различные методы сбора КВВ и протеомного анализа. Однако в настоящее время ни одна из перечисленных работ не предлагает оптимального унифицированного метода подготовки пробы для протеомного анализа и не дает оценки чувствительности применяемых методов анализа белкового состава КВВ в норме. Целью данной работы являлся анализ индивидуальных протеомов КВВ ряда здоровых молодых некурящих доноров. Была разработана следующая схема анализа конденсатов выдыхаемого воздуха: конденсаты выдыхаемого воздуха собираются в тефлоновый коллектор, переносятся в не сорбирующие белок пробирки из полипропилена, устойчивые к низкой температуре и замораживаются при -70 °С. Часть образца лиофилизуется и подготавливается к дальнейшему гидролизу трипсином и хроматомасс-спектрометрическому анализу. Часть сохраняется в течение всего времени исследования для возможности воспроизведения экспериментов. Данные хромато-масс-спектрометрического анализа обрабатываются при помощи программы BioworksBrowser 3.1 SR1 (Thermo Electron, Бремен, Германия), которая формирует список из точных масс пептидов и масс их фрагментов. Данный список используется для поиска и идентификации белков по базе данных NCBInr (Comprehensive, non-identical protein database) при помощи программы Mascot (Matrix Science, London, UK; version 2.0.04). С помощью стандартных методов протеомики был определен белковый состав КВВ девятнадцати некурящих доноров и показано наличие в КВВ 17 белков, отличных от кератинов. Большое внимание уделено повышению чувствительности анализа и его информативности за счет увеличения количества образца. В результате проведенного исследования сформирован список основных белков,
обнаруживаемых в КВВ здоровых некурящих людей при стандартном ВЭЖХ-МС анализе, который может служить основой для сравнения протеомов здоровых людей и людей, имеющих заболевания дыхательных путей.
1. Kharitonov S.A., Barnes P.J., Exhaled markers of pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, 183: 1693-1722.
2. Mutlu G.M., Garey K.W., Robbins R.A. et al. Collection and analysis of exhaled breath condensate in humans. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001, 164(5): 731737.
3. Hunt J. Exhaled breath condensate: an overview. Immunol Allergy Clin North Am. 2007 Nov; 27(4):587-96.
4. Karyakin 2006
5. Roth MD, Arora A, Barsky SH, et al. Airway inflammation in young marijuana and tobacco smokers. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:928-937.
6. McCrea KA, Ensor JE, Nall K, et al. Altered cytokine regulation in the lungs of cigarette smokers. Am J Respir Crit Care Med 1994; 150:696-703.
7. Brown GP, Iwamoto GK, Monick MM, et al. Cigarette smoking decreases interleukin 1 release by human alveolar macrophages. Am J Physiol 1989; 256:C260-C264.
8. Gotoh T, Ueda S, Nakayama T, et al. Protein components of bronchoalveolar lavage fluids from non-smokers and smokers. Eur J Respir Dis 1983; 64:369-377.
9. Morrison D, Strieter RM, Donnelly SC, et al. Neutrophil chemokines in bronchoalveolar lavage fluid and leukocyteconditioned medium from nonsmokers and smokers. Eur Respir J 1998; 12:1067-1072.
10. Wechsler H, Rigotti NA, Gledhill-Hoyt J, et al. Increased levels of cigarette use among college students: a cause for national concern. JAMA 1998; 280:16731678.
11. Gianazza E, Allegra L, Bucchioni E, Eberini I, Puglisi L, Blasi F, Terzano C, Wait R, Sirtori CR. Increased keratin content detected by proteomic analysis of exhaled breath condensate from healthy persons who smoke. Am. J. Med. 2004, 117: 5154.
12. V. Kurova, E. Nikolaev, E. Anaev, T. Kalupov, A. Kononikhin, I. Popov, S. Varfolomeev, Proteomics of Exhaled Breath Condensates Molecular & Cellular Proteomics,р.244 (HA-0731), HUPO 6th Annual World Congress, October 6-10, 2007, Seoul, Korea
13. Bloemen K., Witters E., Hooyberghs J., Desager K., Schoeters G. ERS, 2007. Proteins in exhaled breath condensate: identification and pattern.
14. Hoffmann HJ, Tabaksblat LM, Enghild JJ and Dahl R. Human skin keratins are the major proteins in exhaled breath condensate. Eur Respir J 2008; 31: 380-384.
15. Grise M, Noss J, von Bredow C. Proteomics 2002, 2(6):690-696.
PROTEOMICS OF EXHALED BREATH CONDENSATE: PERSPECTIVES IN DEVELOPING OF NONINVASIVE DIAGNOSTICS OF INFLAMMATION AND OTHER PATHOLOGICAL PROCESSES IN HUMAN AIRWAYS
V. Kurova1 ([email protected]), E. Anaev2, A. Kononikhin1, K. Fedorchenko1, I. Popov1,
D. Bratanov1, and E. Nikolaev1, S. Varfolomeev1
1 Institute for biochemical physics RAS;
2 Institute for pulmonology MH RF
The proposing research is related with a development of a noninvasive method for searching of protein biomarkers in the human respiratory tract. We have optimized the procedure of obtaining and preparing of exhaled breath condensates for the proteomic analysis and provided the information about the normal EBC protein content for 19 healthy nonsmoking donors between 20 and 36 years of age.
