CC BY
79
УДК 581.1
ПРОТЕКТОРНЫЙ эффект эндофитных штаммов бактерии ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ ИОНОВ КАДМИЯ НА РАСТЕНИЯ SINAPIS ALBA
© З. М. Курамшина1*, Ю. В. Смирнова1, Р. М. Хайруллин2
1Башкирский государственный университет, Стерлитамакский филиал Россия, Республика Башкортостан, 453109 г. Стерлитамак, пр. Ленина, 49.
Тел./факс: +7 (347) 343 38 69.
E-mail: kuramshina_zilya@.mail.ru 2Институт биохимии и генетики УНЦРАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: + 7 (347) 235 60 88.
Изучено влияние инокуляции семян горчицы (Sinapis alba L.) эндофитными штаммами бактерий B. subtilis на рост и активность антиоксидантных ферментов растений при стрессе, вызванном ионами кадмия (Cd-стрессе). Показано, что под действием клеток B. subtilis уменьшался токсический эффект кадмия на растения, что проявлялось в улучшении их роста при высоких концентрациях металла в среде, сохранении активности ферментов ка-талазы и пероксидазы, снижении интенсивности перекисного окисления липидов.
Ключевые слова: Sinapis alba, Bacillus сидантные ферменты, перекисное окисление
Введение
Кадмий является одним из наиболее токсичных среди тяжелых металлов (ТМ). В почвах сельскохозяйственных угодий кадмий может достигать высоких концентраций и легко ассимилироваться растениями, приводя к остановке их роста и развития, негативно влияя на фотосинтез, дыхание, водный обмен и минеральное питание [1].
Фитотоксичность кадмия может быть связана с его способностью индуцировать в клетках повышенное образование активных форм кислорода (АФК), ведущих к развитию окислительного стресса [2]. Увеличение АФК приводит к усилению перекисного окисления липидов (ПОЛ), что является одной из причин дестабилизации мембран [3].
Одной из важнейших систем, способствующих устойчивости растений в условиях воздействия ТМ является антиоксидантной защита, особая роль в которой принадлежит антиоксидантным ферментам, активность которых значительно возрастает в условиях воздействия стрессовых факторов [4].
В настоящее время, одним из перспективных направлений по повышению устойчивости растений к действию ТМ является использование экологически чистых технологий, основанных на применении эндофитных штаммов B. subtilis, обладающих фунгицидной и ростстимулирующей активностями [5]. Бациллы, как известно, продуцируют большое количество биологически активных веществ, таких как ферменты, антибиотики, различные аминокислоты [6]. Известен антистрессовый эффект B. subtilis (например, штаммы 26Д и 11ВМ) при воздействии на растения различных абиотических факторов (засоление, водный дефицит, действие ТМ) [7, 8, 9]. В литературе, однако, отсутствуют сведения о механизмах антистрессового эффекта этих бактерий, в том числе и при воздействии на растения ТМ. В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния инокуляции семян
subtilis, кадмий, липидов.
окислительный стресс, антиок-
горчицы белой эндофитными штаммами бактерий B. subtilis на рост побегов и активность антиоксидантных ферментов растений горчицы при Cd-стрессе.
Методика
Растительный материал. Объектом исследования служили проростки горчицы белой (Sinapis alba L.). Эксперименты проводили в лабораторных условиях. Семена перед посадкой промывали в мыльной воде, стерилизовали 96%-ым этанолом (1 мин), трижды ополаскивали в дистиллированной воде, подсушивали. В экспериментах использовали бактерии B. subtilis - штамм 26Д (получен из коллекции ВНИИСХМ С.-Пб.- Пушкин, №128) и штамм 11ВМ (выделены в лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из поверхностно стерилизованных тканей растений мягкой яровой пшеницы Triticum aestivum L.). Обработку семян бактериями проводили в ламинар-боксе. В опытах использовали 20-часовую культуру бактерий, растущую на мясо-пептонном агаре при +37 °С. Клетки бактерий отмывали раствором 0.001М KCl. Суспензию клеток доводили до необходимой концентрации по оптической плотности. 1 г семян обрабатывался 20 мкл суспензии бактерий в концентрации 106 кл/мл. Обработанные семена выдерживали в течение часа, затем использовали в экспериментах. Контрольные семена обрабатывали дистиллированной водой.
Инокулированные и контрольные семена проращивали в вегетационных сосудах, заполненных почвой- черноземом выщелоченным. В почву ионы металла вносили в виде раствора соли Сd(NO3)2•4H2O, однократно после посева семян. Растворы готовили в пересчете на ионы металла в концентрации 10 и 200 мг/кг почвы. Контрольные растения поливали дистиллированной водой. Растения выращивали при температуре 18-20 °С. Размещение вегетационных сосудов меняли каждый день по единой схеме, чтобы обеспечить равномерную освещенность.
* автор, ответственный за переписку
Измерение сырой массы побегов и отбор проб проводили на 3, 6, 9, 14, 30 сутки от начала эксперимента.
Экстракция. Проростки растений, выращенные в почве с различной концентрацией ионов кадмия, промывали в дистиллированной воде, удаляли избыток воды фильтровальной бумагой, взвешивали. Растительный материал гомогенизировали в 0.1М К-фосфатном буфере pH 6.0 (при определении пероксидазы) или в Трис буфере pH 7.8 (при определении каталазы и малонового диальдегида (МДА)) в соотношении навеска: экстрагент - 1:10 (г:мл), центрифугировали 10 минут при 8 тыс. об./мин. Надосадочную жидкость центрифугировали еще 10 минут при 16-18 тыс. об./мин. Для определения активности ферментов и уровня МДА использовали надосадочную жидкость.
Определение активности ферментов и концентрации МДА. Активность пероксидазы оценивали согласно методике Хайруллина с соавторами (2001), исходя из количества окисленного ортофе-нилендиамина [7]. Концентрацию белка определяли согласно методу Bradford [10]. Активность каталазы определяли согласно методике Королюк с соавторами. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [11]. Содержание МДА измеряли, используя метод Costa с соавторами [12]. Метод основан на образовании окрашенного комплекса между МДА и тиобарби-туровой кислотой при нагревании.
Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. В таблицах и на рисунках приведены средние значения трех повторностей и их стандартные отклонения.
Результаты и их обсуждение
Влияние ионов кадмия на сырую массу побегов. Обработка семян бактериями B. subtilis положительно влияла на рост растений. Растения, ино-кулированные клетками B. subtilis, имели более высокие показатели биомассы побегов, чем необработанные, и по мере роста эти различия становились заметнее (табл. 1). Ростстимулирующий эффект бактерий, вероятно, связан с тем, что бациллы могут продуцировать фитогормоно-подобные ве-
Влияние кадмия на сырую
щества [13, 14], а также повышать содержание питательных веществ в доступной для растений форме [9] и подавлять развитие фитопатогенных микроорганизмов [14].
Содержание тяжелого металла в почве в концентрации 10 и 200 мг/кг на начальных этапах роста растений (до четырнадцати суток) оказывало слабое стимулирующее действие, однако на тридцатые сутки роста начинался проявляться ингиби-рующий эффект металла. Подобные эффекты ТМ описаны в литературе. Так, известно, что кадмий в очень низких концентрациях не вызывает заметных изменений и даже способен оказывать положительное влияние на состояние растений: стимулировать рост, повышать содержание пигментов, уменьшать интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) [15]. При действии высоких концентраций кадмия происходит торможение роста, уменьшение сырой и сухой массы растений, прогрессирующие с увеличением концентрации металла в среде выращивания [16, 17].
Растения, обработанные бактериями, в присутствии кадмия росли лучше необработанных. Так, при концентрации 200 мг/кг масса побегов у обработанных бактериями В. тЫШь 26Д и 11ВМ растений была больше на 8% и 19%, соответственно.
Влияние ионов кадмия на активность антиок-сидантных ферментов. У контрольных растений активность каталазы повышалась по мере роста растений, достигая максимума на девятые сутки, и снижалась к тридцатым суткам (табл. 2). У растений, обработанных В. тЫШь, активность фермента увеличивалась и была максимальной на шестые сутки роста проростков, затем начинала снижаться. При наличии ионов кадмия в почве в концентрации 10 мг/кг и 200 мг/кг активность каталазы у необработанных растений увеличивалась на начальных этапах роста, на тридцатые сутки снижалась в 1.6 и 1.8 раза, соответственно. У инокулированных бациллами растений активность каталазы была высокой во все точки фиксации (при концентрации кадмия 10 мг/кг и 200 мг/кг почвы показатели активности каталазы на тридцатые сутки были в 1.5 и 2.1 раза, соответственно выше, чем необработанных).
Таблица 1
массу побегов горчицы, мг
Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки
3 6 9 14 30
0 Не обр. 30.6±4.9 60.1±5.6 71.8±5.7 86.6±7.1 110.0±2.5
Обр. B.s. 26Д 32.2±5.3 59.7±4.6 72.3±3.3 88.5±2.5 123.8±2.2
Обр. B.s. 11ВМ 29.4±2.9 59.2±2.4 69.2±2.8 88.2±2.4 118.1±6.1
10 Не обр. 37.8±8.9 54.6±6.2 76.6±6.2 81.4±1.2 106.2±5.7
Обр. B.s. 26Д 27.8±4.7 57.1±3.9 82.1±8.8 85.0±2.8 123.8±8.6
Обр. B.s. 11ВМ 34.2±5.7 58.9±5.7 82.1±2.8 94.1±9.4 107.6±6.8
200 Не обр. 36.6±6.5 63.4±6.6 78.9±9.1 92.0±9.0 101.4±7.8
Обр. B.s. 26Д 27.5±3.1 60.4±3.7 83.7±3.0 93.3±9.2 121.4±5.4
Обр. B.s. 11ВМ 35.9±6.8 64.2±6.7 93.3±1.6 105.4±9.5 110.9±5.1
Таблица 2
Активность каталазы и пероксидазы в побегах горчицы, при загрязнении почвы тяжелым металлом
Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки
3 | 6 | 9 | 14 | 30
0 Активность каталазы, мкат/л
Не обр. 0.6±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1
Обр. B.s. 26Д 0.4±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 0.5±0.1 0.9±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1
10 Не обр. 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1
Обр. B.s. 26Д 0.6±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 0.6±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.7±0.1
200 Не обр. 0.7±0.1 0.7±0.1 0.6±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1
Обр. B.s. 26Д 0.7±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.9±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 0.7±0.1 0.7±0.1 0.7±0.1 0.8±0.1 0.9±0.1
Активность пероксидазы, ед. мг'1-с'1
0 Не обр. 2.3±0.1 5.4±0.5 5.0±0.1 3.1±0.4 3.3±0.2
Обр. B.s. 26Д 3.7±0.1 7.3±0.2 5.6±0.3 2.6±0.1 2.7±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 3.5±0.1 7.2±0.9 5.2±0.6 2.6±0.1 2.9±0.2
10 Не обр. 3.8±0.2 7.8±0.5 5.6±0.3 2.0±0.1 2.6±0.2
Обр. B.s. 26Д 5.2±0.3 6.7±0.8 4.7±0.1 3.5±0.3 3.5±0.2
Обр. B.s. 11ВМ 4.7±0.1 4.7±0.5 4.6±0.1 3.4±0.4 3.2±0.1
200 Не обр. 3.2±0.1 7.4±0.2 3.1±0.1 2.3±0.1 2.1±0.1
Обр. B.s. 26Д 2.8±0.1 7.1±0.3 3.6±0.1 4.2±0.1 3.9±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 3.2±0.3 7.1±0.1 4.2±0.1 4.0±0.3 3.9±0.2
Активность пероксидазы в побегах растений была максимальной на шестые сутки роста в почве без металла (табл. 2), у обработанных растений клетками В. тЫШь обоих штаммов активность фермента была выше, чем у необработанных на в среднем на 35%. При внесение ионов кадмия в почву в концентрации 10 мг/кг и 200 мг/кг активность пероксидазы у неинокулированных бациллами растений на шестые сутки роста повышалась на 44% и 37%, а к 30-м суткам роста активность снижалась на 22% и 35%, соответственно при обработке клетками штаммов 26Д и 11ВМ. У обработанных бактериями растений резкого изменения активности пероксидазы под действием кадмия не наблюдали, на тридцатые сутки опыта активности фермента у растений оставалась высокой и была сопоставима с показателями активности у контрольных растений.
На начальных этапах роста растений (3 сутки) содержание МДА в побегах было наиболее высоким, по мере взросления отмечена тенденция уменьшения продуктов ПОЛ (табл. 3). У инокули-рованных бактериями В. ьпЫШь 26Д и 11ВМ растений показатели ПОЛ на тридцатые сутки опыта были ниже на 42% и 37%, соответственно, чем у необработанных. Наличие кадмия в почве приводило к снижению уровня МДА у молодых растений почти в два раза, затем по мере роста растений концентрация МДА увеличивалась и к тридцатым суткам содержание МДА в побегах неинокулиро-ванных бациллами растений было на 23% (Сё 10 мг/кг) и 57% (Сё 200 мг/кг) выше, чем в варианте без металла. В тканях побегов растений, обработанных бактериями, показатели МДА колебались на уровне контрольных растений, не подвергшихся воздействию металла.
Таблица 3
Концентрация малонового диальдегида в побегах горчицы, выросшей на почве, содержащей кадмий,
моль/г сырого веса х10-5
Концентрация, (мг/кг) Вариант Время, сутки
3 6 9 14 30
0 Не обр. 6.5±0.6 1.9±0.3 2.9±0.2 3.3±0.2 3.5±0.4
Обр. B.s. 26Д 6.1±0.6 1.3±0.3 3.0±0.1 2.1±0.2 2.0±0.2
Обр. B.s. 11ВМ 5.9±0.2 3.5±0.1 2.5±0.1 2.5±0.1 2.2±0.1
10 Не обр. 3.1±0.3 2.9±0.1 3.2±0.5 3.6±0.2 4.3±0.6
Обр. B.s. 26Д 4.8±0.9 2.8±0.1 2.4±0.2 2.9±0.2 2.8±0.1
Обр. B.s. 11ВМ 5.6±0.1 2.0±0.1 1.4±0.4 3.6±0.7 3.1±0.3
200 Не обр. 2.9±0.4 2.5±0.4 2.4±0.4 3.5±0.6 5.5±0.1
Обр. B.s. 26Д 4.4±0.2 1.1±0.1 1.7±0.2 2.3±0.6 3.6±0.2
Обр. B.s. 11ВМ 5.3±0.5 1.7±0.1 1.5±0.1 2.5±0.4 3.7±0.2
Известно, что в токсичных концентрациях ионы ТМ индуцируют образование АФК и могут вызывать значительные отклонения метаболизма [2, 3]. В растениях горчицы вызванный кадмием окислительный стресс выражался в повышении активности антиокислительных ферментов. Активация каталазы и пероксидазы направлена на разрушение H2O2 и АФК и защиту клетки от вызываемых ими повреждений [17]. Об эффективной работе ферментов свидетельствует низкий уровень продуктов ПОЛ в побегах горчицы. Более высокий уровень МДА у необработанных бактериями растений по сравнению с контрольными позволяет предположить нарушение растительной ферментной системы антиоксидантной защиты. Повреждающий эффект ионов кадмия был хорошо заметен только на тридцатые сутки эксперимента. Вероятно, это связано с меньшей чувствительностью к воздействию стрессора надземной части, по сравнению с корнями [1]. Кроме того, можно предположить, что в течение определенного времени растение активно борется с действием фактора, и только затем наступают повреждения.
Инокуляция клетками B. subtilis снижала токсический эффект кадмия, что проявлялось не только в показателях лучшего роста при высоких концентрациях металла, но и в сохранении активности каталазы и пероксидазы, уменьшении интенсивности ПОЛ. Таким образом, повышение устойчивости растений, обработанных бактериями B. subtilis, при воздействии ионов кадмия можно объяснить повышением активности антиокислительных ферментов и менее интенсивным развитием окислительного стресса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Серегин И. В., Иванов В. Б. Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения // Физиология растений. 2001. Т.48. № 4. С. 606-630.
2. Cho U. H., Seo N. H. Oxidative Stress in Arabidopsis thaliana Exposed to Cadmium Is due to Hydrogen Peroxide Accumulation // Plant Sci. 2005. V. 168. P. 113-120.
3. Курганова Л. Н., Балалаева И. В., Веселов А. П., Синицы-на Ю. В., Васильева Е. А., Цыганова М. И. Прооксидант-но-антиоксидантный статус хлоропластов гороха при действии стрессирующих абиотических факторов среды: 1. Продукция активных форм кислорода и липопероксида-ция // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2010. №2(2). С. 544-549.
4. Шевякова Н. И., Нетронина И. А., Аронова Е. Е., Кузнецов Вл. В. Распределение Cd и Fe в растениях Mesembryanthemum crystallinum при адаптации к Cd-стрессу // Физиология растений. 2003. Т. 50. №5. С. 756-763.
5. Мубинов И. Г. Реакции пшеницы на действие клеток эндофитного штамма 26D Bacillus subtilis: основы биофунгицида фитоспорин: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Уфа. 2007. 22 с.
6. Недорезков В. Д. Биологическое обоснование применения эндофитных бактерий в защите пшеницы от болезней на Южном Урале: Автореф. дисс. д-ра с.-х. наук. С-Пб, 2003. 41 с.
7. Хайруллин Р. М., Недорезков В. Д., Мубинов И. Г., Захарова Р. Ш. Повышение устойчивости пшеницы к абиотическим стрессам эндофитным штаммом Bacillus subtilis // Вестник ОГУ. 2007. №2. С. 129-134.
8. Курамшина З. М., Смирнова Ю. В., Хайруллин Р. М. Повышение толерантности проростков подсолнечника Helianthus annuus, инокулированных эндофитным штаммом Bacillus subtilis, к действию тяжелых металлов. Сообщение 2. Антистрессовая активность эндофита Bacillus subtilis 26D при действии тяжелых металлов на растения подсолнечника Helianthus annuus // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии Южного Урала»: приложение к 10 номеру (2009 г.) журнала «Вестник ОГУ», 2021 октября 2009 г. Оренбург: Оренбургский государственный университет, 2009. С. 461-463.
9. Егоршина А. А., Р. М. Хайруллин, Лукьянцев М. А., Курамшина З. М., Смирнова Ю. В. Фосфат-мобилизующая активность эндофитных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на степень микоризации корней пшеницы / Научный журнал Сибирского федерального университета. Краснояраск. 2011. №1. С. 172-182.
10. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding//Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. №2. P. 248-254.
11. Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16 - 18.
12. Costa H., Gallego S. M., Tomaro M. L. Effect of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons // Plant Sci. 2002. V. 162. P. 939-945.
13. Архипова Т. Н., Веселов С. Ю., Мелентьев А. И., Мартынен-ко Е. В., Кудоярова Г. Р. Сравнение действия штаммов бактерий, различающихся по способности синтезировать цитоки-нины, на рост и содержание цитокининов в растениях пшеницы // Физиология растений. 2006. Т. 53. №4. С. 567-574.
14. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohc в агроэкосистемах. М.: Наука. 2007. 147 с.
15. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М., Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. 172 с.
16. Ghorbanli M., Kavaeh S.H., Serehr M.F. Effects of Cadmium and Gibberellin on Growth and Photosynthesis of Glycine max // Photosynthetica. 1999. V. 37. P. 627-631.
17. Zhang F., Shi W., Jin Z., Shen Z. Response of Antioxidative Enzymes in Cucumber Chloroplasts to Cadmium Toxicity // J. Plant Nutr. 2003. V. 26. P. 1779-1788.
Поступила в редакцию 03.08.2013 г.
