CC BY
11УДК615.9
ПРОТЕКТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ ПОЛИПЕПТИДА И АМИНОКИСЛОТ НА РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ НЕРВНОЙ ТКАНИ В ПРИСУТСТВИИ ЦИКЛОФОСФАНА
Ворганотипической культуре исследовали сочетанное влияние ингибитора синтеза ДНК цикло-фосфана, используемого для моделирования резорбтивного действия иприта, с полипептидом кортексином или с каждой из 20 кодируемых аминокислот на развитие процессов клеточной пролиферации в эксплантатах коры головного мозга крыс. При сочетанном введении циклофосфана совместно с кортексином или с каждой из 20 кодируемых аминокислот, за исключением глицина, наблюдалась отмена ингибирующего влияния цитостатического вещества. Таким образом, кортексин и аминокислоты оказывают протекторное влияние на клеточную пролиферацию в культуре ткани ЦНС при действии ипритоподобных веществ.
Ключевые слова: циклофосфан, аминокислоты, полипептиды, культура ткани.
В.Б. Долго-Сабуров1, Н.И. Чалисова2, Л.В. Лянгинен1, Е.С. Заломаева2
ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», 192019, г. Санкт Петербург, Российская Федерация 2Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, 197034, г. Санкт Петербург, Российская Федерация
Введение. Актуальной проблемой клинической токсикологии является поиск веществ, способных оказывать протекторное действие при нарушениях синтеза и репарации ДНК, возникающих как результат действия таких токсикантов, как иприты и иприто-подобные соединения, а также цитостатические препараты. Одним из основных патогенетических особенностей действия иприта на организм является чрезвычайная вялость процессов регенерации тканей, развитие кахексии, депрессии, ослабление защитных иммунологических реакций организма [1]. Для моделирования действия иприта используется противоопухолевый цитостатик цикло-фосфан. Молекулярный механизм токсического действия циклофосфана, как у иприта, связан с его алкилирующими свойствамии и с угнетением системы антиоксидантной защиты [2,3].
В последние десятилетия большое внимание уделяется комплексным полипептидным препаратам, существенно увеличивающим регенера-ционные способности различных тканей за счет
стимуляции процессов репарации и синтеза ДНК [4-6]. Один из таких препаратов - кортексин, представляющий комплекс полипептидных фракций, экстрагированных из мозга телят, используется в неврологической практике и предположительно может оказать защиту от повреждающего действия факторов химической природы. В недавних работах [7,8], показано, что в органотипиче-ской культуре ткани каждая из 20 кодируемых аминокислот оказывает различное - стимулирующее или ингибирующее, - влияние на развитие эксплантатов. Органотипическое культивирование фрагментов тканей и анализ зоны роста эксплантатов является наиболее адекватным и удобным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ. Целью данной работы явилось исследование влияния комплексного пептида кортексина и 20 кодируемых аминокислот в присутствии циклофосфана на развитие органотипической культуры коры головного мозга крыс.
Долго-Сабуров Валерий Борисович (Dolgo-Saburov Valeriy Borisovich). доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник по специальности токсикология лаборатории биохимической токсикологии и фармакологии ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства». 192019, г. Санкт Петербург. institute@toxicology.ru
Чалисова Наталья Иосифовна (Chalisova Natalia Iosifovna), профессор. доктор биологических наук. ведущий научный сотрудник по специальности физиология человека и животных группы пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П.Павлова РАН. 197034, г. Санкт Петербург. ni_chalisova@mail.ru
Лянгинен Лидия Васильевна (Lyaginen Lidiya Vasilyevna). кандидат медицинских наук. старший научный сотрудник по специальности токсикология лаборатории биохимической токсикологии и фармакологии ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства». 192019. г. Санкт Петербург. pikalova_lidiya@mail.ru
Заломаева Екатерина Сергеевна (Zalomaeva Ekaterina Sergeevna). научный сотрудник группы пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П.Павлова РАН. 197034. г. Санкт Петербург. kostikorange@yandex.ru
Материалы и методы исследования. Орга-нотипическое культивирование тканей проводили в стерильных условиях. В экспериментах использовано 1200 фрагментов коры головного мозга 3-месячных самцов крыс линии Вистар. Фрагменты коры головного помещали в чашки Петри с питательной средой, состоящей из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% феталь-ной телячьей сыворотки с добавлением глюкозы (0,6%), гентамицина (100 ед/мл). Использованы комплексный биорегуляторный пептид кортексин, L-аминокислоты (фирма «Sigma» США) - глицин (Gly), аланин (Ala), аспарагин (Asn), гистидин (His), лизин (Lys), серин (Ser), глютамин (Gln), аргинин (Arg), пролин (Pro), аспарагиновая (Asp) и глутаминовая (Glu) кислоты, тирозин (Tyr), цистеин (Cys), валин (Val), треонин (Thr), метионин (Met), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp). Для пептида эффективной концентрацией было 2 нг/мл, для аминокислот 0,05 нг/мл, для циклофосфана 1 мкг/мл. Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37оС и 5% СО2 и через 3 сут просматривали под фазово-кон-трастным микроскопом с микротеленасадкой (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком»). Используя программу PhotoM 1.2. определяли индекс площади (ИП) в условных единицах, как соотношение площади эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны. Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и опытных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с использованием пакета программ «Microsoft Excell».
Результаты и обсуждение. В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих нейроци-тов, глиоцитов, фибробластов. Через 3 сут, если в эксперименте имелась стимуляция развития зоны роста в результате клеточной пролиферации, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.
В первой серии опытов циклофосфан вводили в культуральную среду эксплантатов коры головного мозга в концентрациях 0,1-10 мкг/мл. Обнаружено, что уже начиная с концентрации 0,1 мкг/мл начиналось частичное ингибирова-ние зоны роста, что приводило к статистически достоверному уменьшению индекса площади на 18±3% (п=20, р<0,05), по сравнению с контрольными значениями (п=19). При дальнейших увеличениях концентраций рост эксплантатов затормаживался еще больше. При концентрации циклофосфана 0,5 мкг/мл ИП эксплантатов уменьшался уже на 25±5% (п=18, р<0,05), по сравнению с индексом площади в контроле (п=20). При введении циклофосфана в культу-ральную среду в концентрации 1 мкг/мл возникало статистически достоверное угнетение развития эксплантатов коры головного мозга крыс, ИП был меньше на 23-32% , чем ИП контрольных эксплантатов.
При изолированном введении в культураль-ную среду кортексина в эффективной концентрации 2 нг/мл выявлено статистически достоверное увеличение зоны роста эксплантатов и ИП увеличивался на 28±5% (п=20, р<0,05), по сравнению с значением ИП в контроле (п=19) (табл. 1). При сочетанном действии циклофос-фана с кортексином наблюдалось устранение ингибирующего влияния цитостатика и статистически не достоверная стимуляция роста эксплантатов коры головного мозга на 7±3% (п=20, р<0,05) по сравнению с контрольным значением ИП (п=20). Для того, чтобы подтвердить протекторное действие кортексина на фоне действии цитостатика, были проведены эксперименты с введением этих веществ с интервалами во времени 10 мин после введения каждого препарата. Ингибирующее влияние циклофосфана уменьшилось при одновременном введении веществ в целом на 31%, а при разновременном на 3% и 6% (табл. 1).
Таким образом, наиболее эффективное протекторное влияние происходит при одновременном введении в питательную среду полипептида и цитостатика.
Таблица1
Влияние кортексина и циклофосфана (ЦФ) на индекс площади (ИП) эксплантатов коры головного
мозга крыс
ИП (% ) по отношению к контролю
Кортексин ЦФ Кортексин одновременно с ЦФ Кортексин,через 10 мин ЦФ ЦФ,через 10 мин кортексин
+28±5* -24±5* 7±3 -18±5* -21±3*
Примечание: *р< 0,05 по сравнению с показателем в контроле.
Таблица 2
Влияние аминокислот, циклофосфана и их сочетаний на индекс площади (% по отношению к контролю) эксплантатов коры головного мозга крыс
Аминокислоты (АК) АК (0,05 нг/мл) Циклофосфан (ЦФ) (1 мкг/мл) ЦФ+АК
Gly -30±9* -29±5* -27±3*
Ala 3±1 -25±3* 2±1
Asn 5±3 -32±7* 11±5
Hys +42±7* -27±3* -8±3
Lys 3±2 -29±5* -10±2
Ser -5±2 -31±5* -3±1
Gln -15±6 -23±2* -4±2
Arg 8±5 -25±5* 8±3
Pro -23±2* -24±3* -15±2
Glu 24±3* -32±4* 6±2
Asp +47±7* -27±2* 1±1
Cys -2±1 -27±5* 7±1
Tyr -20±5* -29±7* -5±3
Val +50±9* -25±5* 9±5
Thr +41±5* -29±5* 4±3
Met +39±9* -25±7* -11±5
Leu +45±11* -27±5* -7±1
Ile +42±9* -28±7* 3±1
Phe -7±5 -31±9* -6±2
Trp -18±3* -26±5* 8±3
Примечание: * р<0,05 по сравнению с контролем.
Изучены влияния аминокислот на эксплантаты коры головного мозга. При изолированном введении в культуральную среду гистидина, глу-таминовой и аспарагиновой кислот, валина, треонина, метионина, лейцина, изолейцина обнаружено увеличение ИП эксплантатов на 24-50%, по сравнению с контрольными ИП (табл.2).
При сочетанном введении циклофосфана в культуральную среду в концентрации 1 мкг/мл с глутаминовой кислотой в эффективной кон-
центрации 0,05 нг/мл, происходило устранение угнетающего эффекта на эксплантаты, которое выражалось в том, что устраненялось ингибиру-ющее влияние циклофосфана, снижающее ИП на 32±4 % (п=24, р<0,05), по сравнению с контролем (п=20), и происходило статистически не достоверное увеличение зоны роста эксплантатов на 6±2% (п=24, р>0,05) Таким образом, ингибиру-ющее влияние циклофосфана в целом уменьшилось на 38% (рис.1).
Рис. 1. Влияние циклофосфана, глутаминовой кислоты (Glu) и одновременного введения в культуральную среду циклофосфана и глутаминовой кислоты на индекс площади (ИП) эксплантатов коры головного мозга крыс. По оси ординат: индекс площади в %. Вертикальные отрезки - 95% доверительные интервалы средних значений. * - достоверные различия, по сравнению с контролем (р<0,05).
Устранение ингибирующего влияния цито-статика на культуру нервной ткани на 17-21% отмечалось также при сочетанном действии с аминокислотами (за исключением глицина), не оказывавшими стимулирующего влияния на эксплантаты. Полученные нами данные показывают, что кодируемые аминокислоты, являющиеся простейшими регуляторами физиологических функций [9-11], способны устранять ингибирующий эффект циклофосфана в орга-нотипической культуре нервной ткани. В настоящее время накапливаются данные, подтверждающие концепцию о том, что в организме имеются относительно независимые регуля-торные системы - пептидная и аминокислотная [12-13]. Результаты наших экспериментов показывают, что полипептид и кодируемые аминокислоты могут оказывать протекторное действие в присутствии цитостатического агента. Возможным объяснением может быть то, что иприто-подобное вещество циклофосфан способно вступать в связь с анионами фосфорных и карбоновых кислот, фенолов, а также с аминогруппами. Эти химические радикалы широко представлены в нуклеиновых кислотах, ферментах и структурных белках. Возможно, при сочетанном введении циклофосфана с по-
липептидом или аминокислотами, цитостатик связывается с аминогруппами пептида или аминокислот, теряя возможность связывания с другими химическими радикалами в клетках ткани.
Выводы:
1. При действии циклофосфана, моделирующего резорбтивное действие иприта, в культуре ткани коры головного мозга происходит угнетение клеточной пролиферации. Этот эффект ци-клофосфана необходимо учитывать при развитии побочных последствий химиотерапии с его применением, т.к. в случаях курсового применения препарата могут развиваться патологические изменения в тканях ЦНС.
2. Полипептид кортексин и кодируемые аминокислоты устраняют ингибирующее действие циклофосфана в культуре ткани коры головного мозга. Зона роста эксплантатов после соче-танного воздействия с циклофосфана с этими веществами увеличивалась, достигая контрольных значений.
3. Создается база для разработки методов терапевтического использования полипептида кор-тексина и аминокислот при лечении последствий отравлений ипритом и для снятия побочных эффектов курса цитостатиков в онкологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Beheshti J., Mark E., Akbaei H. Mustard lung secrets:Long term clinico-pathological study following mustard gas exposure. Pathol. Res. Pract. 2006; 202 (10): 739-44.
2. Кашуро В.А., Глушков С.И., Карпищенко А.И., Новикова Т.М., Глушкова Т.И., Минаева Л.В., Сибирев С.А. Состояние системы глутатиона в тканях паренхиматозных органов лабораторных животных при повторном введении циклофосфана. Нефрология. 2006; 10 (4): 823. Кашуро В.А., Карпищенко А.И., Куценко С.А., Глушков С.И. Возможность использования определения показателей системы глутатиона в лабораторной диагностике осложнений курсового лечения циклофосфаном. Клиническая лабораторная диагностика. 2002; (10): 43.
REFERENCES:
1. Beheshti J., Mark E., Akbaei H. Mustard lung secrets:Long term clinicopathological study following mustard gas exposure. Pathol. Res. Pract. 2006; 202 (10): 739-44.
2. Kashuro V.A., Glushkov S.I., Karpish-chenro A.I., Novikova T.M., Glushkova T.I., Minaeva L.V., Sibirev S.A .Glutathione system in parenchimatous tissues of laboratory animals by repeated cyclophos-phane introduction. Nephrology. 2006;
10 (4): 823. Kashuro V.A., Karpishchenro A.I.,Kutsenko S.A., Glushkov S.I., Possibility of use of glutathione system parameters in laboratory diagnostics of the complications of cyclophosphane curse treatment. Clinic laboratory diagnostics. 2002; (10): 43.
4. Головко А.И., Иванов М.Б., Башарин В.А., Носов А.В. Терапевтическая эффективность церебролизина и пира-цетама при закрытой черепно-мозговой травме у крыс на фоне острой интоксикации этанолом. Medllne.ru. 2003; 4 (1): 482-5.
5. Иванов М.Б., Башарин В.А., Сорокина Е.Г., Гранстрем О.К. Применение церебрамида для восстановления высших нервных функций после черепно-мозговой травмы. Terra Medica. 2007; (6): 30-4.
6. Коваленко А.Л., Носов А.В., Башарин В.А., Иванов М.Б., Александров М.В., Луцык М.А. Цитофлавин и церебролизин в коррекции последствий экспериментального геморрагического инсульта. Профилактическая и клиническая медицина.2002; (3):104-
4. Golovko A.I., Ivanov M.B., Basharin V.A., NosovA.V. Therapeutic effect of cerebro-lysin and pirapetam by the craniocerebral trauma in rats on the background of acute ethanol intoxication. Medline.ru. 2003; 4 (1): 482-5.
5. Ivanov M.B., Basharin V.A., Sorokina E.G., Granstrem O.K. Cerebramide use for the repair of higher nervous functions after craniocerebral trauma. Terra Medica. 2007; (6): 30-4.
6. KovalenkoA.L., NosovA.V., Basharin V.A., IvanovM.B., AlexandrovM.V., Lutsik M.A. Cytoflavinum and cerebrolysin in the correction of sequela of the experimental haemorrhagic insult. Prophylactic and Clinical Medicine. 2002; (3):104-
7. Chalisova N.I., Kontsevaya E.A., Voitsek-hovskaya M.A., Komashnya A.V.Regulatory
7. Чалисова, Н.И. Концевая Е.А.,Войце-ховская М.А., Комашня А.В. Регулятор-ное влияние кодируемых аминокислот на основные клеточные процессы у молодых и старых животных. Успехи геронтологии. 2011; 24 (2): 189-99.
8. Чалисова Н.И., Иванов М.Б., Аржавкина Л.Г., Пикалова Л.В., Смирнов А.В. Протекторное влияние пептидов и аминокислот на развитие культуры лимфоидной ткани в присутствии циклофосфана. Токсикологический вестник. 2010; (4): 41-5.
9. Vary T. Oral leucine enhances myocardial protein synthesis in rats acutely administered ethanol. J Nutr.2009; 139(8):1439-
10. Brasse-Lagnel C., Lavoinne A., Husson A. Control of mammalian gene expression by amino acids, especially glutamine. Febs J. 2009;.276: 1826-44.
effect of the coded amino acids on basic cellular processes in young and old rats. Advance in Gerontology. 2011; 24 (2): 189-99.
8. Chalisova N.I., Ivanov M.B., Ar-gavkina L.G., Pikalova L.V., SmirnovA.V. Protector effect of peptides and amino acids on the development of lymphoid tissue culture at the cyclophosphane presence. Toxicological Review. 2010; (4): 41-5.
9. Vary T. Oral leucine enhances myocardial protein synthesis in rats acutely administered ethanol. J Nutr.2009; 139(8):1439-
10. Brasse-Lagnel C., Lavoinne A., Husson A. Control of mammalian gene expression by amino acids, especially glutamine. Febs J. 2009;.276: 1826-44.
11. Fafournoux P., Averous J., Bruhat A., Carraro V., Jousse C., Maurin A.C. et al. Adaptation to the availability of essential amino-acids: role of GCN2/ eIF2 /ATF4 pathway. Biol Aujourd-hui. 2015; 209 (4): 31712. Кашуро В.А., Батоцыренова Е.Г., Елаева Н.Л., Савенко Ю.Н., Лапина Н.В., Аксёнов В.В. Динамика содержания нейротрофических факторов головного мозга при экспериментальной коме у крыс. Казанский медицинский журнал. 2013; 94 (5): 69513. Швецов А.В., Дюжикова Н.А., Савенко Ю.Н., Батоцыренова Е.Г., Кашуро В.А. Влияние экспериментальной комы на экспрессию белка bcl-2 и каспаз-3 ,9 в мозге крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 160 (8): 178-81.
11. Fafournoux P., Averous J., Bruhat A., Carraro V., Jousse C., Maurin A.C. et al. Adaptation to the availability of essential amino-acids: role of GCN2/ eIF2a/ATF4 pathway. Biol Aujourd-hui. 2015; 209 (4): 31712. Kashuro V.A., Batotsirenova E.G., Elaeva N.L., Savenko Yu.N., Lapina N.V., Aksenov V.V. Dynamic of the neurotrophic factor content in the brain by the experimental coma in rats. Medical J. of Kazan. 2013; 94 (5): 69513. ShvetsovA.V., Dyuzhikova N.A., Saven-ko Yu.N., Batotsirenova E.G., Kashuro V.A. Effect of the experimental coma on expression of bcl-2 protein and caspase-3 ,9 in rat brain. Bull. Exper. Biology Medicine. 2015; 160 (8): 178-81.
V.B. Dolgo-Saburov1, N.I. Chalisova2, LV. Lyanginen1, E.S. Zalomaeva2
PROTECTIVE EFFECT OF POLYPEPTIDE AND AMINO ACIDS ON THE DEVELOPMENT OF THE NERVOUS TISSUE CULTURE IN THE PRESENCE OF CYCLOPHOSPHAMIDE
institute of Toxicology, Federal Medical-Biological Agency, 192019, St. Petersburg, Russian Federation
2I.P. Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Sciences, 199034, Saint-Petersburg, Russian Federation
In an organotypic culture, an investigation was conducted into combined effects of cyclophosphamide DNA as synthesis inhibitor used to model a resorptive action of mustard gas, and cortexin polypeptide or each of 20 encoded amino acids on the development of cell proliferation in cerebral cortex explants of the rat. The combined administration of cyclophosphamide together with cortexin or with each of the 20 encoded amino acids, except glycine, showed suppression of the cytostatic agent inhibitory effect. Thus, cortexin and amino acids have a protective effect on cell proliferation in the tissue culture of the central nervous system under the action of mustardlike substances.
Keywords: Cyclophosphamide, amino acids, polypeptides, tissue culture.
Материал поступил в редакцию 13.01.2017 г.
