ПРОТЕКТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДОВ И АМИНОКИСЛОТ НА РАЗВИТИЕ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ В ПРИСУТСТВИИ ЦИКЛОФОСФАНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 547

Протекторное влияние пептидов и аминокислот на развитие культуры лимфоидной ткани в присутствии циклофосфана

Чалисова Н.И.1, Иванов М.Б., Аржавкина Л.Г., Пикалова Л.В., Смирнов А.В. 1

Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова, Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт Петербург

В

органотипическои культуре исследовали сочетанное влияние ингибитора синтеза ДНК циклофосфана и 20 кодируемых аминокислот на развитие процессов пролиферации и апоптоза в эксплантатах лимфоидной ткани селезенки от половозрелых крыс. Аминокислоты в концентрации 0,05 нг/мл оказывали либо стимулирующее, либо ингибирующее влияние на зону роста эксплантатов. При введении в культуральную среду цик-

лофосфана в концентрации 1 мкг/ мл происходило угнетение клеточной пролиферации. При сочетанном введении циклофосфана совместно с пептидами или каждой из аминокислот (за исключением гистидина и пролина) наблюдалась отмена ин-гибирующего влияния цитостати-ческого вещества. Исследованные тимусные пептиды и аминокислоты могут оказывать протекторное влияние на клеточную пролиферацию в культуре ткани при действии ци-

тостатика.

Ключевые слова - аминокислоты, пептиды, циклофосфан, культура ткани

Введение. Исследование регуля-торных механизмов многоклеточных систем дает возможность изучить механизмы дифференцировки клеток, принципы регуляции специализированных тканей, а также способы их защиты от повреждающего действия факторов химической природы. В этой связи актуальной является проблема поиска веществ, способных оказывать протекторное действие при нарушениях синтеза и репарации ДНК, возникающих как результат действия таких токсикантов, как иприты и иприто-подобные соединения, а также цитостатичес-кие препараты.

Циклофосфан, являясь ингибитором синтеза ДНК, относится к веществам с выраженным имму-нодепресантным действием в отношении практически всех клонов иммунокомпетентных клеток, как пролиферирующих, так и «покоящихся» [1]. В связи с возможностями тимусных пептидов стимулировать процессы репарации и синтеза ДНК [6] можно предположить их протекторный эффект при действии ингибиторов синтеза ДНК. В то же время в недавних работах [8, 9, 10] показано, что в органотипической культуре ткани селезенки крыс четыре гидрофильные аминокислоты с заряженными боковыми радикалами - лизин, аргинин, аспарагин и глута-миновая кислота, - оказывают стимулирующее влияние на клеточную пролиферацию в лимфоидной ткани, в то время как остальные из 20 ко-

дируемых аминокислот либо угнетают зону роста эксплантатов, либо не вызывают реакции. Наиболее адекватным и удобным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых биологически активных веществ является органотипическое культивирование фрагментов тканей и анализ зоны роста эксплантатов. Это связано с тем, что изменение количества клеток может служить критерием первичной интегральной оценки биологической активности веществ, а само изменение количества клеток быть результатом стимуляции или ингибирования клеточной пролиферации [4, 9, 12, 14, 15].

Целью данной работы явилось исследование влияния комплексного пептида тималина, синтезированного дипептида тимогена ^1и-Тгр) и 20 кодируемых аминокислот в присутствии циклофосфана на развитие органотипической культуры лимфо-идной ткани селезенки крыс.

Материал и методы исследования. Органотипическое культивирование тканей проводили в стерильных условиях. В экспериментах использовано 800 фрагментов селезенки 3-месячных самцов крыс популяции Вистар. Выделенные фрагменты селезенки разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки. В

среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед/мл), гентамицин (100 ед/мл). Использованы комплексный биорегуляторный пептид тималин, дипептид тимоген (Glu-Trp), L-ами-нокислоты (фирма «Sigma» США) -глицин (Gly), аланин (Ala), аспарагин (Asn), гистидин (His), лизин (Lys), серин (Ser), глютамин (Gln), аргинин (Arg), пролин (Pro), аспарагиновая (Asp) и глутаминовая (Glu) кислоты, тирозин (Tyr), цистеин (Cys), валин (Val), треонин (Thr), метионин (Met), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), фе-нилаланин (Phe), триптофан (Trp). В предварительных экспериментах выявлено, что для пептидов эффективной концентрацией была 2 нг/мл, для аминокислот 0,05 нг/мл, для цик-лофосфана 1 мкг/мл. В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли 3 мл питательной среды с исследуемой концентрацией препаратов, в чашки Петри с контрольными эксплантатами - 3 мл питательной среды, без добавления препаратов, таким образом, эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37о С в условиях постоянного поступления 5% СО2 и через 3 сут просматривали под фа-зово-контрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади

центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 «Альфа-Телеком», Россия). Для расчета индекса площади (ИП) эксплантатов использовали программу РЬюйМ 1.2. Результаты обрабатывались с помощью компьютерной программы STATISTIKA 5.0.

Результаты и обсуждение. В 1-е сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, выселение пролиферирующих и мигрирующих лимфобластов, лимфоцитов, фиброб-ластов, составляющих зону роста от края эксплантата. Через 3 сут, если в эксперименте имелась стимуляция развития зоны роста в результате клеточной пролиферации, ИП экспериментальных эксплантатов увеличивался по сравнению с ИП контрольных эксплантатов. В случаях угнетения зоны роста, ИП эксплантатов понижался по сравнению с контрольными значениями.

Для изучения действия цикло-фосфана на эксплантаты селезенки в органотипической культуре в питательную среду вводили циклофос-фан в концентрациях 0,1-10 мкг/мл (Рис.1).

Обнаружено, что уже начиная с концентрации 0,01 мкг/мл начиналось частичное ингибирование зоны роста, что приводило к статистически достоверному уменьшению индекса площади на 18±3% (п=20, р<0,05), по сравнению с контрольными значениями (п=22). При дальнейших увеличениях концентраций рост эксплантатов затормаживался еще больше. При концентрации циклофосфана 0,5 мкг/мл ИП эксплантатов уменьшался уже на 25±5% (п=21, р<0,05), по сравнению с индексом площади в контроле (п=23). При введении цик-лофосфана в культуральную среду в концентрации 1 мкг/мл всегда возникало статистически достоверное угнетение развития эксплантатов селезенки крыс, выражавшееся в снижении ИП на 23-32% по сравнению с ИП контрольных эксплантатов.

При изолированном введении в культуральную среду тималина в эффективной концентрации выявлено статистически достоверное увеличение зоны роста эксплантатов и ИП увеличивался на 28±5% (п=23, р<0,05) выше контрольного значения ИП (п=22) (Рис.2).

При сочетанном действии цикло-фосфана с тималином наблюдалось

устранение ингибирующего влияния цитостатика и статистически достоверная стимуляция роста эксплантатов селезенки на 22±3% (п=21, р<0,05) по сравнению с контрольным значением ИП (п=23).

Введение в культуральную среду тимогена в эффективной концентрации вызывало статистически достоверное увеличение клеточной пролиферации, ИП увеличивался на 24±5% (п=21, р<0,05) по сравнению с контролем ИП (п=24) (Рис.3).

При сочетанном действии цикло-фосфана с тимогеном происходило устранение угнетающего влияния цитостатика и статистически достоверная стимуляция роста эксплантатов на 18±3% (п=25, р<0,05) по сравнению с контрольным значением ИП (п=23).

В следующей серии экспериментов изучались эффекты гидрофильных аминокислот с заряженным боковым радикалом - лизина, аргинина, аспарагина, глутаминовой кислоты, в концентрации 0,05 нг/ мл при изолированном введении в культуральную среду. Обнаружено увеличение ИП эксплантатов на 25-38%, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (таблица 1).

Под влиянием гидрофобных аминокислот - аспарагиновой кислоты, валина, тирозина, треонина, метио-нина, лейцина, фенилаланина, трип-

тофана, цистеина ИП уменьшался на 25-38%. Ингибирующее влияние отмечалось также у гистидина, глу-тамина, пролина. Остальные аминокислоты (глицин, аланин, серин, изо-лейцин) не оказывали статистически достоверного влияния на развитие эксплантатов и значения ИП оставались на уровне контрольных.

При сочетанном введении цикло-фосфана в культуральную среду в концентрации 1 мкг/мл с аминокислотами лизином, аргинином, аспара-гином в эффективной концентрации 0,05 нг/мл, происходило устранение угнетающего эффекта на эксплантаты. Отсутствие ингибирующего влияния циклофосфана выражалось в том, что происходило лишь статистически не достоверное уменьшение зоны роста эксплантатов селезенки на 9-11%. Сочетанное действие эффективной концентрации ингибиру-ющего агента циклофосфана с глу-таминовой кислотой в концентрация 0,05 нг/мл приводило уже не только к полному устранению ингибиру-ющего влияния цитостатика, но и к статистически не достоверному увеличению зоны роста эксплантатов селезенки на 8±5% (п=24, р>0,05) по сравнению с контрольными значениями (п=20). Устранение инги-бирующего влияния цитостатика на культуру лимфоидной ткани отмечалось также при сочетанном с цик-

Рис. 1 - Влияние циклофосфана на эксплантаты селезенки.

120 г

100 -

80 -

60 40 20 0

0,01 0,05 0,5 1 10 мкг/мл. Контроль

Концентрация циклофосфана 0,01; 0,05; 0,5; 1; 10 мкг/мл. По оси ординат индекс площади эксплантатов (%).

Вертикальные отрезки — 95% доверительные интервалы средних значений. * - достоверные различия, по сравнению с контролем (р<0,05).

Рис. 2 - Влияние циклофосфана (1), тималина (2) и одновременного введения в культуральную среду цикло-фосфана и тималина (3) на индекс площади (ИП) эксплантатов селезенки крыс.

40 30 -20 -о 10 - С Б 0 -10 --20 -30 1 1.1. 2 3

Вертикальные отрезки — 95% доверительные интервалы средних значений. * - достоверные различия, по сравнению с контролем (р<0,05).

Рис. 3 - Влияние циклофосфана (1), тимогена (2) и одновременного введения в культуральную среду циклофосфана и тимогена (3) на индекс площади (ИП) эксплантатов селезенки крыс.

Вертикальные отрезки — 95% доверительные интервалы средних значений. * - достоверные различия, по сравнению с контролем (р<0,05).

лофосфаном действии гидрофобных аминокислот и даже при сочетанном действии с аминокислотами, не оказывавшими какого-либо стимулирующего или угнетающего влияния на эксплантаты. Исключение составили аминокислоты гистидин и пролин, которые не отменяли угнетающее действие циклофосфана и ИП оставался статистически достоверно ниже контрольных значений на 1518%.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при изолированном действии циклофосфана в лимфоидной ткани эксплантатов селезенки крыс происходит угнетение клеточной пролиферации. Молекулярный механизм токсического действия циклофосфана связан с его алкилирующими свойствами и, вследствие этого, с его способностью вступать в связь с анионами фос-

форных и карбоновых кислот, фенолов, а также с аминогруппами. Эти химические радикалы широко представлены в нуклеиновых кислотах, ферментах и структурных белках. В этой связи их цитостатический эффект начинается уже в фазе G1 клетки и содействует торможению в фазе S. Для их действия необходимо наличие в молекуле препарата 2 алки-лирующих групп, которые образуют в молекуле ДНК поперечные связи и, таким образом, блокируют репликацию ДНК и затем прекращают митозы в клетках, с чем связано также цитостатическое действие цикло-фосфана [4, 5].

Полученные нами данные показывают, что подавляющее большинство из 20 кодируемых аминокислот, яв-ляющися простейшими регуляторами физиологических функций [5, 11, 15], способны устранять ингибиру-

ющий эффект циклофосфана в орга-нотипической культуре лимфоидной ткани. В настоящее время накапливаются данные, подтверждающие концепцию о том, что в организме имеются относительно независимые регуляторные системы - пептидная и аминокислотная [2, 6, 9, 12]. Результаты наших экспериментов показывают, что аминокислоты могут оказывать протекторное действие в присутствии цитостатического агента.

Как отмечалось нами и ранее [7, 10], эффективной концентрацией для аминокислот была концентрация 0,05 нг/мл, что может быть связано с эффектом действия ультрамалых доз [3, 10]. Действие ультрамалых доз возможно связано с адаптационными явлениями в клетках различных тканей, т.е. клетка может реагировать не на величину присутствующей в организме концентрации аминокислот, а именно на небольшие сдвиги этой концентрации. На основании полученных данных можно также полагать, что тимусные пептиды, обладающие иммуномоду-лирующими свойствами, способны устранять ингибирующее действие цитостатических агентов. Причем их эффективность выше, чем у отдельных аминокислот, при действии которых происходило, только возвращение ИП эксплантатов на уровень контрольных значений. Комплексный пептид тималин и тимоген, имеющий в составе аминокислоты, устраняющие ингибирующее влияние цитостатика, не только отменяли угнетающее действие циклофос-фана, но клеточная пролиферация в эксплантатах лимфоидной ткани статистически достоверно увеличивалась на 22-24% по сравнению с контролем.

Выводы:

1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при действии циклофосфана, модулирующего резорбтивное действие иприта, в лимфоидной ткани происходит угнетение клеточной пролиферации. Данный эффект циклофосфана необходимо учитывать при развитии отдаленных последствий отравлений ипритом и иприто-подобными соединениями, т.к. даже в случаях легкого поражения могут развиваться патологические изменения в тканях иммунной системы и иммунно-депрессивные состояния.

2. В данной работе установлено, что кодируемые аминокислоты, ти-

мусные пептиды тималин, тимоген устраняют ингибирующее действие циклофосфана в культуре лимфоидной ткани селезенки. Зона роста эксплантатов после сочетанного воздействия циклофосфана, изолированное действие которого угнетало зону роста, и тимусных пептидов значительно увеличивалась и не только достигала контрольных значений, но была сопоставима с зоной роста при действии самих пептидов.

3. Таким образом, полученные в экспериментах данные создают базу для разработки методов терапевтического использования тимусных пептидов и ряда аминокислот для снятия побочных иммунодепресантных эффектов при лечении отдаленных последствий отравлений ипритом и иприто-подобными соединениями.

Таблица 1

Влияние аминокислот, циклофосфана и их сочетаний на индекс площади (% по отношению к контролю) эксплантатов селезенки крыс.

Аминокислоты (АК) АК (0,05 нг/мл) Циклофосфан(ЦФ) (1 мкг/мл) ЦФ+АК

Gly 2±1 -27±5* i±i

Ala 3±1 -26±3* 2±1

Asn 25±5* -32±7* -11±5

^s -32±3* -27±3* -18±3*

Lys 30±5* -28±5* -10±5

Ser -5±1 -30±5* 3±1

Gln -15±1* -23±2* -4±2

Arg 28±3* -25±5* -9±3

Pro -20±2* -24±3* -15±1*

Glu 27±5* -30±4* 8±5

Asp -38±7* -27±2* 1±1

Cys -20±3* -28±5* 2±1

Tyr -37±7* -29±7* -7±3

Val -38±9* -25±5* -8±5

Thr -38±5* -29±5* -5±1

Met -37±3* -26±7* -11±5

Leu -28±5* -27±5* -8±1

Ile -2±1 -29±7* 2±1

Phe -27±5* -32±9* -7±2

Trp -25±3* -26±5* 5±1

р<0,05 по сравнению с контролем

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баркан Р.С., Яковлева Т.К. Мутагенный эффект циклофосфана на клетки костного мозга облученных крыс // Генетика. -1979. -Т.15, № 5. -С. 862867.

2. Белокрылов Г.А., Деревнина О.Н., Попова О.Я. Различия в иммунном ответе, фагоцитозе и детоксицирующих свойствах под влиянием пептидных и аминокислотных препаратов // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1995. -Т.118, № 2. -С. 509-512.

3. Готовский Ю.В., Перов Ю.Ф. Особенности биологического действия физических факторов малых и сверхмалых интенсивностей и доз. Москва: Наука, -2000. -118 с.

4. Калюнов В.Н. Биология фактора роста нервной ткани. Минск: Наука и техника, -1986. -208 с.

5. Кричевская А.И., Лукаш С.А., Шугалин В.И.. Аминокислоты. Ростов-на-Дону: Наука, -1983. -153 с.

6. Морозов В. Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем - цитомедины // Успехи соврем. биологии. -1983. -Т.96, № 6. -С. 339-352.

7. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А. Модулирующая роль незаменимых и заменимых аминокислот в органотипической культуре тканей у крыс разного возраста // Рос. физиол. журн. -2003. -Т. 89, № 5. -С. 591-597.

8. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А., Ноздрачев А.Д. Регулирующее действие аминокислот в органотипической культуре лимфоидных тканей с различной степенью зрелости // Доклады Академии наук. -2003. -Т. 389, № 2.

-С. 117-119.

9. Чалисова Н.И., Пеннияйнен В.А., Хаазе Г. Регулирующая роль некоторых аминокислот при развитии апоптоза в культуре нервной и лимфоидной ткани // Рос. физиол. журн. -2002. -Т. 88, № 5. -С. 627-633.

10. Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х., Пеннияйнен В.А., Григорьев Е.И. Влияние полипептидных фракций тимуса на развитие органотипической культуры вилочковой железы и селезенки крысы // Цитология. -1999. -Т. 41, № 10. -С. 889-894.

11. Cid C, Alvarez-Cermeno J.C, Regidor I. . Low concentrations of glutamate induce apoptosis in cultured neurons: implications for amyotrophic lateral sclerosis // J. Neurol.Sci. -2003. -V.206, № 1. -P.91-95.

12. Fu Y.M, Yu Z.X, Li Y.Q. Specific amino acid dependency regulates invasiveness and viability of androgen-independent prostate cancer cells // Nutr. Cancer. -2003. -V.45, № 1. -P.60-73.

13. Kim K.Y, Moon J.I, Lee E.J. The effect of arginine, a nitric oxide synthase substrate, onretinal cell proliferation in the postnatal rat // Dev. Neurosci. -2002. - V.24, № 4. -P.313-21.

14. Levi-Montalcini R., Angeletti P. Nerve growth factor // Physiol. Rev. -1982. -V.48. -P. 534-569.

Chalisova N.I.1, Ivanov M.B.2, Arzhavkina L.G.2, Pikalova L.V.2, Smirnov A.V.1

Protective effect of peptides and amino acids on the development of the adenoid tissue culture in the presence of

cyclophosphane

1P.Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences, St. Petersburg

2S.M.Kirov Medical Military Academy

A combined effect of cyclophosphane, the DNA synthesis inhibitor, and 20 coded amino acids on the development of proliferation and apoptosis was studied in explants of the spleen lymphoid tissue in mature rats. Amino acids at a concentration of 0.05 ng/ml produced either a stimulatory or inhibitory effect on the growth zone of explants.

Cyclophosphane ( 1 mcg/ml) induced into the culture medium suppressed the cell proliferation. At a joint induction of cyclophosphane and peptides under test or together with each amino acid ( excluding histidine and proline) the inhibitory effect of the cytostatic agent stopped. Thus, thymus peptides and amino acids may have a protective impact on the cell proliferation in the tissue culture in the presence of the cytostatic agent.

Материал поступил в редакцию 05.02.2010 г