CC BY
25
УДК 612.821.6
ПРОТЕКТОРНОЕ ВЛИЯНИЕ НИТРАТА МАГНИЯ НА ИШЕМИЮ МОЗГА
В.С. Кузенков, А.Л. Крушинский
(кафедра физиологии человека и животных; кафедра высшей нервной деятельности; e-mail: [email protected])
Изучено влияние нитрата магния (М§(М0з)2) на динамику неврологических нарушений и смертность крыс в результате ишемии мозга, вызванной одномоментной двусторонней перевязкой общих сонных артерий. М§(М0з)2 в дозе 5 мг/1000 г и 50 мг/1000 г, введенный за 60 мин до ишемии мозга и через 1—2 с после окклюзии обеих сонных артерий, достоверно уменьшал тяжесть неврологических нарушений и смертность крыс.
Ключевые слова: ишемия мозга, нитрат магния, оксид азота.
За последнее десятилетие появилось множество научных публикаций, в которых говорится не только о безвредности нитратов и нитритов, но и об их терапевтических свойствах, особенно для сосудистых заболеваний головного мозга [1—2]. Еще в начале XX в. было установлено, что при безнитратной диете в организме все равно присутствуют нитриты (NO ) и нитраты (NO3) [3]. Было замечено, что в странах, где в пищу употребляется много овощей и фруктов, содержащих нитраты и нитриты, наблюдается низкий уровень развития сердечно-сосудистых заболеваний [4—5]. Поэтому исследователи обратили свое внимание на применение нитратов в ишемической патологии мозга, которая имеет широкое распространение и тяжелые последствия для здоровья человека [6]. Также установлено, что нитраты и нитриты являются не инертными продуктами метаболизма оксида азота (NO), а формой хранения NO [7]. Было выяснено, что нитраты и нитриты осуществляют свое положительное влияние на сосудистую систему ише-мического мозга через образование NO [8]. Известно, что в условиях ишемии/гипоксии нитрат/нит-рит-редуктазы осуществляют последовательную цепь трансформации NO^ ^ NOj ^ NO [9]. Более того, в условиях дефицита кислорода, когда NO-синтаза (NOS) не может синтезировать NO, многие ферменты изменяют направленность своего действия. Например, во время ишемии/гипоксии дезоксигемогло-бин и NOS выступают в роли нитритредуктаз [10, 11]. Таким образом, в условиях дефицита кислорода активизируются альтернативные источники образования NO, а субстратом для ферментов являются нитраты и нитриты. Возможно, это древний механизм защиты организма от ишемии/гипоксии, который впоследствии утратил свою ведущую роль, или NOS ошибочно считают ведущим ферментом, синтезирующим NO. Также имеются данные о том, что нитраты и нит-
риты могут оказывать свои протекторные свойства через МО-независимый механизм вследствие их прямого действия на ключевые белки и липиды [12].
В качестве других препаратов, применяемых при ишемическом инсульте, отмечены неорганические формы магния (сульфат или хлорид магния), которые в ряде исследований характеризуются нейропротектор-ным эффектом [13—14]. Магний — четвертый катион по распространенности в теле человека, второй внутриклеточный катион и является кофактором более 500 белков, участвующих в различных биохимических реакциях и сигнальных каскадах [15, 16]. Как предполагают, магний осуществляет свои нейропротектор-ные свойства через раннее восстановление клеточных запасов АТФ, антагонизм всех подтипов кальциевых каналов, неконкурентный антагонизм рецепторов ММОА, ингибирование нейротоксического высвобождения глутамата, ингибирование генерации кислородных радикалов и чрезмерного формирования оксидов азота, ингибирование активации провоспалитель-ных цитокинов и т.д. [17, 18]. В экспериментальных и клинических исследованиях применение неорганических препаратов магния уменьшает негативное действие ишемического каскада [19]. В других работах такого эффекта не наблюдали [20, 21]. Исходя из того, что и нитраты, и неорганические препараты магния оказывают протекторное влияние на сосудистую систему мозга, мы решили проверить соче-танное действие этих двух ионов на неполную ишемию мозга.
Цель настоящей работы — изучение влияния неорганических форм магния: нитрата магния ^§(N03)2), сульфата магния (М§804) и хлорида магния (М§С12), введенных в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг внутрибрю-шинно за 1 ч до ишемии мозга и через 1—2 с после окклюзии общих сонных артерий, на течение ише-мического инсульта (ИИ).
Материалы и методы
Для создания модели глобальной ишемии мозга применяли одномоментную двустороннюю перевязку общих сонных артерий. Крысам под эфирным наркозом выделяли и перевязывали общие сонные артерии. Длительность операции составляла не более 10 мин. После эфирного наркоза у крыс быстро восстанавливалось сознание. Животных помещали в отдельные клетки и полуколичественно оценивали динамику неврологического дефицита [23]. Оценивали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные припадки), парезы конечностей, кому и смерть. В соответствии с использованной методикой оценки неврологической симптоматики за 0—3 балла принимали состояние, близкое к нормальному; за 3—6 баллов — среднюю степень; за 7—24 балла — тяжелую степень ИИ; за 25 баллов — смерть животного. Неврологический дефицит оценивали через каждые 30 мин в течение 8 ч. Суммарный балл по каждому промежутку времени усредняли для всех животных в группе. На основе полученных данных строили графики динамики неврологических нарушений, отложив по оси ординат баллы, по оси абсцисс — время.
В экспериментах использовано 448 крыс линии Вистар массой 120—140 г. У всех крыс была произведена окклюзия обеих сонных артерий. Было проведено четыре серии опытов по 112 крыс в каждой серии. В 1-й и 3-й сериях опытов препараты вводились за 1 ч до ишемии мозга, во 2-й и 4-й сериях — через 1—2 с после окклюзии общих сонных артерий. В каждой серии эксперимента животные были разбиты на 4 группы: три опытные и контрольную. Всего было 16 групп по 28 крыс в каждой. Препараты вводились по следующей схеме.
Первой группе — контроль (п = 28) внутрибрю-шинно в те же сроки в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор (0,9% №0).
Второй группе (п = 28) в каждой серии вводили MgSO4 в дозе 5 мг/кг или 50 мг/кг внутрибрю-
шинно через 1—2 с после окклюзии общих сонных артерий.
Третьей группе (n = 28) в каждой серии вводили MgCl2 в дозе 5 мг/кг или 50 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга и через 1—2 с после окклюзии общих сонных артерий.
Четвертой группе (n = 28) в каждой серии вводили Mg(NO3)2 в дозе 5 мг/кг или 50 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до ишемии мозга и через 1—2 с после окклюзии общих сонных артерий.
Достоверность различий средних параметров в разный экспериментальный группах животнык оценивали с помощью критерия Манна—Уитни (U Test) в программе STATISTIKA 6. Для оценки летальности неврологических проявлений применяли критерий Фишера.
Результаты и обсуждение
Влияние Mg(NOj)2f MgSO4 и MgCfy в дозах 5 мг/кг, введенных за 1 ч до ишемии мозга, на течение ИИ.
Интенсивность нарастания неврологических нарушений в группе крыс, которым вводили Mg(NO3)2 в дозе 5 мг/кг за 1 ч до окклюзии обеих сонных артерий на протяжении 300—480-й мин опыта, была достоверно (p < 0,01) ниже, чем в контрольной группе животных (рис. 1). Смертность в группе 4 была также достоверно ниже (p < 0,05), чем в контрольной. Неврологический дефицит в группе 4 Mg(NO3)2 был достоверно (p < 0,05) ниже, чем в группах, которым вводили MgSO4 и MgCl2 в дозе 5 мг/кг (рис. 1). Смертность в группе 4 была достоверно (p < 0,05) ниже, чем в группах 2 и 3. Достоверный различий между группами 1 и 2 и группами 1 и 3 не наблюдалось (рис. 1).
Влияние Mg(NOj)2, MgSO4 и MgCl2 в дозах 5 мг/кг, введенных через 1—2 с после ишемии мозга, на течение ИИ. У животных, которым вводили Mg(NO3)2 в дозе 5 мг/кг через 1—2 с после окклюзии обеих сонных артерий, неврологический дефицит на протяжении 360—480-й мин опыта был достоверно (p < 0,05) менее выражен, чем у контрольной группы крыс (рис. 2). Смертность в группе крыс, которой вводи-
Рис. 1. Влияние Mg(NOз)2, MgSO4 и MgCl2, введенных за 1 ч до ишемии мозга, на течение ишемического инсульта. 1 — контроль; 2 — MgSO4 в дозе 5 мг/кг; 3 — MgCl2 в дозе 5 мг/кг; Mg(NOз)2 в дозе 5 мг/кг. **р < 0,01 — достоверность различий между 4-й и 1-й группами; # р < 0,05 — достоверность различий между 2-й, 3-й и 4-й группами
Рис. 2. Влияние М§(М0з)2, М§Б04 и М§С12, введенных 1—2 с после ишемии мозга, на течение ишемического инсульта. 1 — контроль; 2 — М§Б04 в дозе 5 мг/кг; 3 — М§С12 в дозе 5 мг/кг; М§(М0з)2 в дозе 5 мг/кг. **р < 0,01 — достоверность различий между 4-й и 1-й группами; # р < 0,05 — достоверность различий между 2-й, 3-й и 4-й группами
ли М§(М03)2 в дозе 5 мг/кг, была достоверно ниже (р < 0,05), чем в контрольной группе животных. У крыс, которым вводили М§804 и М§С12 в дозе 5 мг/кг через 1—2 с после ишемии мозга, интенсивность нарастания неврологических нарушений на протяжении 360—480-й мин была достоверно (р < 0,05) выше, чем у крыс, которым вводили М§(М03)2 в дозе 5 мг/кг (рис. 2). Смертность в группе 4 была достоверно (р < 0,05) ниже, чем в группах 2 и 3. Достоверных различий между группами 1 и 2 и группами 1 и 3 не наблюдалось (рис. 2).
Влияние Mg(NOз)2, М^04 и MgCl2 в дозах 50 мг/кг, введенных за 1 ч до ишемии мозга, на течение ИИ. Введение М§(М03)2 в дозе 50 мг/кг за 1 ч до окклюзии сонных артерий оказывало значительный протекторный эффект, что проявилось в менее интенсивном развитии тяжелой неврологической симптоматики и смертности в этой опытной группе по сравнению с контрольной группой животных. Интенсивность нарастания неврологического дефицита в опытной группе на протяжении 210—480-й мин опыта оказалась достоверно ниже (р < 0,01), чем в контрольной группе животных (рис. 3). Смертность в опытной группе крыс была также достоверно (р < 0,01) ниже, чем в контрольной группе. По сравнению с животными, которые получали М§804 в дозе 50 мг/кг (2-я груп-
па) и М§С12 в дозе 50 мг/кг (3-я группа) до ишемии мозга у крыс, которым вводили М§(М03)2 в дозе 50 мг/кг за 1 ч до ишемии мозга, неврологическая симптоматика была достоверно (р < 0,05) менее выражена на протяжении 399—480-й мин (рис. 3). Смерт ность в группе 4 также оказалась ниже (р < 0,05), чем в группах 2 и 3. Достоверных различий между группами 1 и 2, а также между группами 1 и 3 не наблюдалось, хотя интенсивность нарастания неврологического дефицита в группах 2 и 3 была менее интенсивной, чем в контрольной группе крыс (рис. 3).
Влияние Mg(N0з)2, М^04 и MgCl2 в дозах 50 мг/кг, введенные через 1—2 с после ишемии мозга, на течение ИИ. У крыс, которым вводили М§(М03)2 в дозе 50 мг/кг через 1-2 с после ишемии мозга, неврологический дефицит на протяжении 240—480-й мин был достоверно (р < 0,01) менее выражен, чем у контрольной группы крыс (рис. 4). Смертность в группе 4 была достоверно ниже (р < 0,05), чем в контрольной. У крыс, которым вводили М§804 и М§С12 в дозе 50 мг/кг через 1—2 с после ишемии мозга, интенсивность нарастания неврологических нарушений была достоверно (р < 0,05) выше, чем у крыс, которым вводили М§(М03)2 в дозе 50 мг/кг (рис. 4). Смертность в группе 4 также была достоверно (р < 0,05) ниже, чем в группах 2 и 3. Достоверных различий
Рис. 3. Влияние М§(М03)2, М§Б04 и М§С12, введенных за 1 ч до ишемии мозга, на течение ишемического инсульта. 1 — контроль; 2 — М§Б04 в дозе 50 мг/кг; 3 — М§С12 в дозе 50 мг/кг; М§(М03)2 в дозе 50 мг/кг. *р < 0,05 — достоверность различий между 4-й и 1-й группами; **р < 0,01 — достоверность различий между 4-й и 1-й группами; #р < 0,05 — достоверность различий между 2-й, 3-й и 4-й группами
Рис. 4. Влияние М^ЫОз^, М^304 и М^С12, введенных 1—2 с после ишемии мозга, на течение ишемического инсульта. 1 — контроль; 2 — М^04 в дозе 50 мг/кг; 3 — М^С12 в дозе 50 мг/кг; М^(Ы0з)2 в дозе 50 мг/кг. *р < 0,05 — достоверность различий между 4 й и 1-й группами; **р < 0,01 — достоверность различий между 4-й и 1-й группами; #р < 0,05 — достоверность различий между 2-й, з-й и 4-й группами
между группами 1 и 2 и группами 1 и 3 не наблюдалось (рис. 4).
Обсуждение
В клинических и экспериментальных исследованиях установлено, что применение препаратов магния и нитратов при ишемии головного мозга оказывает протекторный эффект [1, 13, 14]. Поскольку М§(М0з)2 содержит как катион М§2+, так и анион N0 з, то он должен обладать протекторными свойствами как неорганических препаратов магния, так и нитратов.
Действительно, в нашем исследовании применение М§^0з)2 как в дозе 5 мг/кг, так и в дозе 50 мг/кг сопровождалось достоверным (р < 0,01) защитным эффектом. Мы предполагаем, что это может быть связано с трансформацией нитратов в N0. Известно, что при гипоксии/ишемии мозга повышается ферментативная активность нитрат/нитрит-редуктаз, которые осуществляют последовательную цепь трансформации N0^ ^ N0 2 ^ N0 [1, 9]. Будучи сильным вазо-дилататором, N0 способен увеличивать кровоток в мозге и ингибировать агрегацию тромбоцитов [24]. Защитный эффект проявляется уменьшением выраженности неврологического дефицита и снижением летальности. Умеренное увеличение концентрации N0 приводит к переходу белков из растворимого в мемб-ранно-связанное состояние [9], что способно повысить стабильность белков и мембран. Протекторный эффект М§^0з)2, влияющий на ишемию мозга, связан не только с образованием N0, но и с действием катионов М§2+. Известно, что ионы М§2+ приводят к увеличению производства простагландина 12, который в свою очередь уменьшает агрегацию тромбоцитов. Катионы М§2+ блокируют кальциевые каналы, снижают чрезмерный вход ионов Са2+ в клетки, ин-гибируют NMDA-рецепторы, тем самым уменьшая эксайтотоксичность, способствуют раннему восстановлению клеточных запасов АТФ и ингибируют активацию провоспалительных цитокинов, что может
уменьшить повреждающее действие ишемии и гипоксии мозга [16, 17].
Меньший протекторный эффект М§^0з)2, взятого в дозе 5 мг/кг, по сравнению с М§^0з)2, взятого в дозе 50 мг/кг, можно объяснить как меньшей концентрацией катионов М§2+, так и анионов N0 3. В наших экспериментах при введении нитрата натрия №N03 в дозе 5 мг/кг и 50 мг/кг мы также наблюдали зависимость протекторного эффекта нитратов от дозы введения препарата. При введении NN03 в дозе 50 мг/кг он достоверно снижал неврологический дефицит и смертность у крыс, а NN03, взятый в дозе на порядок меньше (5 мг/кг), не обладал протекторным эффектом [26].
Из рис. 1—4 видно, что неврологический дефицит при введении М§^03)2 на протяжении всего эксперимента был меньше, чем в контроле, но только через 3—4 ч после начала наблюдений неврологическая симптоматика стала достоверно (р < 0,01) меньше. Вероятно, отсроченное протекторное действие М§^03)2 на неполную глобальную ишемию мозга связано с низкой нитрат/нитрит-редуцирующей активностью катиона М§2+, а значит, с низким образованием N0, который вместе с ионами М§2+ осуществлял протекторное действие Для умеренного протекторного накопления N0 требуется время. Потенцирующее протекторное взаимодействие N0 и М§2+, вероятно, также играло роль. У неорганических препаратов магния (М§804 и М§С^) также есть катион М§2+, но они не оказывали протекторного влияния на ишемию мозга.
Незначительный недостоверный защитный эффект, который наблюдался при введении М§804 и мбс12, введенных в дозе 5 мг/кг и 50 мг/кг, по-видимому, связан с катионами М§2+. Из наших результатов следует, что протекторный эффект М§^03)2 не зависел от срока введения. Как видно из рис. 1 и 2, введение М§^03)2 как за 60 мин до окклюзии сонных артерий, так и введение через 1—2 с после развития ишемии оказывало достоверный протекторный эффект.
Таким образом, результаты нашего эксперимента предполагают, что значительный протекторный эффект Мб(МОз)2 в дозах 5 мг/кг и 50 мг/кг на неполную ишемию мозга связан с сочетанным влиянием катионов Мб2+ и анионов N0 3. Вероятно, неудачи, связанные с применением солей неорганического магния (М£804 и М§С^) в медицинской и экспериментальной практике, связаны с противоионом магния, а именно с анионами 804" и С1". Мы предпо-
лагаем, что продолжающиеся экспериментальные и медицинские исследования терапевтических эффектов неорганических препаратов магния будут связаны с изучением эффектов М£^Оз)2. Нитрат магния отвечает многим требованиям, предъявляемым к идеальным фармакологическим препаратам: недорогой, доступный, легко вводится и, по всей видимости, без побочных неблагоприятных эффектов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Calvert J.W., Lefer D.J. Clinical translation of nitrite therapy for Cardiovascular Diseases // Nitric Oxide. 2010. Vol. 22. N 2. P. 91-97.
2. Lundberg J.O., Weitzberg E. NO-synthase independent NO generation in mammals // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010. Vol. 396. N 1. P. 39-45.
3. L'hirondel J., L'hirondel J.-L. Nitrate and man: toxic, harmless or beneficial? CABI Publishing, Wallingford & NY, 2001. P. 184.
4. Pluta R.M., Oldfield E.H., Bakhtian K.D., Fathi A.R., Smith R.K., DeVroom H.L., Nahavandi M., Woo S., Figg W.D., Lonser R.R. Safety and feasibility of long-term intravenous sodium nitrite infusion in healthy volunteers // PLoS One. 2011. Vol. 6. N 1. P. 14504.
5. Gupta V.K. Intravenous magnesium for neuroprotection in acute stroke: Clinical hope versus basic neuropharmacology // Stroke. 2004. Vol. 35. P. 2758-2759.
6. Kaste M., Norrving B. From the World Stroke Day to the World Stroke Campaign: one in six: act now! // Int. J. Stroke. 2010. Vol. 5. P. 342-343.
7. Hord N.G., Tang Y., Bryan N.S. Food sources of nitrates and nitrites: the physiologic context for potential health benefits // Am. J. Clin. Nutr. 2009. Vol. 90. N 1. P. 1-10.
8. Dezfulian C., RaatN.J.H., Shiva S., Gladwin M.T. Role of the anion nitrite in ischemia-reperfusion cytoprotection and therapeutics // Cardiovasc Res. 2007. Vol. 75. N 2. P. 327-338.
9. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин B.E., Коси-цин Н.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука, 1997. 156 с.
10. Machha A., Schechter A.N. Dietary nitrite and nitrate: a review of potential mechanisms of cardiovascular benefits // Eur. J. Nutr. 2011. Vol. 50. N 5. P. 293-303.
11. Wink D.A., Paolocci N. Mother was right: eat your vegetables and do not spit! When oral nitrate helps with high blood pressure // Hypertension. 2008. Vol. 51. P. 617-619.
12. Bryan N.S. Cardioprotective actions of nitrite therapy and dietary considerations // Front. Biosci. 2009. Vol. 14. P. 4793-808.
13. Sen A.P., Gulati A. Use of magnesium in traumatic brain injury // Neurotherapeutics. 2010. Vol. 7. P. 91-99.
14. Ginsberg M.D. Neuroprotection for ischemic stroke: past, present and future // Neuropharmacol. 2008. Vol. 55. N 3. P. 363-389.
15. Gums J.G. Magnesium in cardiovascular and other disorders // Amer. J. Health Syst. Pharm. 2004. Vol. 61. N 15. P. 1569-1576.
16. Muir K.W. Magnesium in stroke treatment // Postgrad Med. J. 2002. Vol. 78. P. 641-645.
17. Громова О.А., Торшин И.Ю., Калачаева А.Г., Курам-шин Д.Б. Молекулярно-биологические основы нейропро-текторных эффектов магния // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2011. Т. 111. С. 12-90.
18. Lin J.Y., Yang D.Y., Cheng F.C. Experimental cerebral ischemia and magnesium // Clin. Calcium. 2004. Vol. 14. N 8. P. 15-21.
19. Saver J.L. Targeting the brain: neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke // Pharmacotherapy. 2010. Vol. 7. N 2. P. 62-69.
20. Singh H., Jalodia S., Gupta M.S., Talapatra P., Gupta V., Singh I. Role of magnesium sulfate in neuroprotection in acute ischemic stroke // Ann. Indian Acad. Neurol. 2012. Vol. 15. N 3. P. 177-180.
21. Aslanyan S., Weir C.J, Muir K.W., Lees K.R. IMAGES Study Investigators. Magnesium for treatment of acute lacunar stroke syndromes: Further analysis of the IMAGES trial // Stroke 2007. Vol. 38. P. 1269-1273.
22. Zhu H.D., Martin R., Meloni B, Oltvolgyi C., Moore S., Majda B., Knuckey N. Magnesium sulfate fails to reduce infarct volume following transient focal cerebral ischemia in rats // Neurosci Res. 2004. Vol. 49. N 3. P. 347-353.
23. Durukan A., Strbian D., Tatlisumak T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development // Curr. Pharm. Des. 2008. Vol. 14. N 4. P. 359-370.
24. Саркисов К.Ю., Опиц Б., Оеме П. Влияние фрагмента субстанции Р. (3-4) на течение ишемии мозга у крыс с разным типом поведения // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 1996. Т. 121. № 4. С. 399-403.
25. Iadecola C. Bright and dark sides of nitric oxide in ischemia brain injury // Trend. Neurosci. 1997. Vol. 20. P. 132-139.
26. Kouzenkov V.S., Krushinsky A.L., Reutov V.P. Sodium Nitrate Effect on Development of Neurological Deficiency in Rats after Semi-Global Brain Ischemia // Moscow Univer. Biol. Sci. Bull. 2011. Vol. 66. N 1. Р. 1-5.
Поступила в редакцию 13.04.13
SODIUM POTASSIUM EFFECT ON DEVELOPMENT OF NEROLOGICAL
DEFICIENCY IN EXPERIMENTAL MODEL OF BRAIN ISHEMIA
V.S. Kouzenkov, A.L. Krushinsky
Effects of magnesium nitrate Mg(NO3)2 on the dynamic of neurological disorders after brain ischemia induced by bilateral occlusion of common carotid artery were investigated in rats of Wistar line. Mg(NO3)2 in dose 5 mg/1000 g and 50 mg/1000 g injected either 60 minutes or just before the bilateral occlusion carotid artery significantly reduced severity of the neurological disorders and death-rate of the rats.
Key words: brain ischemia, magnesium nitrate, nitric oxide.
Сведения об авторах
Кузенков Виктор Сергеевич — канд. биол. наук, лаборант-инженер I категории кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-304-81-17; e-mail: [email protected]
Крушинский Алексей Леонидович — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ. Тел.: 8-499-238-32-81; e-mail: [email protected]
