CC BY
71
УДК 615.225:617.735-007.23
ПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ СЕТЧАТКИ
А.С. ШАБЕЛЬНИКОВА А.С. КАШУБА А.А. ПЕРЕСЫПКИНА М.В. ПОКРОВСКИЙ А.А. ДОЛЖИКОВ Л.К. БУСЛОВСКАЯ
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
e-mail: [email protected]
Моделирование ишемии-реперфузии сетчатки у белых лабораторных крыс путем оказания механического давления на переднюю камеру глаза приводило к усилению регионарного кровотока в сетчатке после 1 ч. реперфузии с последующим развитием отека и снижению уровня микроциркуляции в сетчатке после 72 ч. реперфузии. В условиях этой модели выявлена выраженная коррекция нарушений микроциркуляции рекомбинантным эритропоэ-тином (50 МЕ/кг). Протективный эффект эритропоэтина снимался глибенкламидом, что свидетельствует о прекондиционирующем действии с участием К+-АТФ-азных каналов.
Ключевые слова: прекондиционирование, рекомбинантный эритропоэтин, ишемия-реперфузия сетчатки.
Профилактика и коррекция ишемических заболеваний сетчатки является актуальной проблемой, которую можно решить с помощью фармакологического прекондиционирования. Прекондиционирование может рассматриваться как универсальный инструмент предупреждения ишемического повреждения тканей, что подтверждается многочисленными исследованиями [3, 5]. В разных работах показано протективное действие эритропоэтина на ишемию-реперфузию в различных органах и тканях, включая головной мозг [8], спинной мозг [9], мышечную ткань сосудов [12], сердце [8, 11], заднюю конечность [6], почки [7], плаценту [4], печень [1]. Рекомбинантный эритропоэтин оказывает противовоспалительное действие, которое реализуется по механизму прекондиционирования с вовлечением АТФ-зависимых калиевых каналов, eNOS и iNOS [2].
Целью работы явилось изучение влияния дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) и фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэ-тином на уровень микроциркуляции в сетчатке при моделировании ишемии-реперфузии глаза.
Материалы и методы. Опыты проведены на 140 белых лабораторных обоеполых крысах массой 225-275 г. Моделирование ишемии-реперфузии сетчатки глаза проводили под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) путем оказания механического давления (110 мм.рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут. Подтверждением формирования ишемии служило отсутствие глазного кровотока. Для изучения протективных свойств рекомбинантного эритропоэтина выполнено 7 серий экспериментов. Первая группа (п=10) - группа интактных животных, вторая (п=10) - с ишемией-реперфузией сетчатки (контроль), третья (п=10) - с коррекцией ДИП; четвертая (п=10) - с коррекцией эритропоэтином; пятая (п=10) - контроль + глибенкламид (блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов); шестая (п=10) - ДИП + глибенкламид; седьмая (п=10) - эритропоэтин + глибенкламид. ДИП проводили 10-минутным пережатием бедренной артерии путем наложения жгута на проксимальную треть бедра за 40 мин до моделирования ишемии сетчатки, после чего сл е-довал 30-минутный эпизод реперфузии. Рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин» (ФГУП ГосНИИ ОЧБ) вводили внутрибрюшинно в субэритростимулирующей дозе 50МЕ/кг однократно за 30 мин до моделирования ишемии. Глибенкламид («Манинил» (Берлин-Хеми АГ) вводили в дозе 5 мг/кг однократно за 60 мин до моделирования ишемии.
О выраженности протективного эффекта эритропоэтина и ДИП судили по уровню микроциркуляции в сетчатке крыс при помощи лазер-Доплер флоуметра Biopac-systems МР-150 и датчика игольчатого типа TSD-l44 (США) через 1 и 72 часа реперфузии. Для этого под наркозом животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в десяти точках по окружности склеры с шагом 1 мм. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 20 секунд в каждой точке. Из полученных десяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке в данной группе животных.
Для гистологических исследований глаза с непосредственно прилегающими тканями фиксировали в 10% растворе формалина. После фиксации материал полностью заливали в
стандартном режиме в парафин. Кусочки ориентировали в блоках таким образом, чтобы при изготовлении срезов получить препараты в меридианном направлении строго через середину глазного яблока. Срезы для стандартного гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином. Описательное исследование гистологических препаратов выполняли под микроскопом Axio Scope Al (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия).
Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05.
Результаты и их обсуждение. Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс после l ч. реперфузии после моделирования ишемии-реперфузии глаза и ее коррекции ДИП и рекомбинантным эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг представлены в таблице 1.
Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составил 738,9±37,6 п.е. (перфу-зионных единиц). Уровень микроциркуляции после моделирования патологии в группе контроля составил после 1 ч. реперфузии 1155,0±51,9 п.е., что достоверно выше значения в группе интактных животных (р<0,001). На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции в сетчатке после 1 ч. реперфузии достоверно снижался до 952,0±25,8 п.е. (р<0,05) по сравнению с группой контроля. При коррекции патологии эритропоэтином уровень микроциркул я-ции в группе снижался до 798,5±12,3 п.е. и также достоверно отличался от значений в группе контроля (р<0,001). Введение глибенкламида в группах с коррекцией ДИП и эритропоэтином предотвращало снижение уровня микроциркуляции (табл. l).
Таблица 1
Влияние эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования на уровень микроциркуляции в сетчатке крыс после 1 ч. реперфузии при моделировании ишемии глаза (М±т; n=io)
№ п/п Экспериментальные группы Уровень микроциркуляции, п.е. (пер-фузионные единицы)
1. Интактные 738,9±37,6у
2. ИГ (ишемия глаза) 1155,0±51,9*
3. ИГ + ДИП 952,0±25,8*у
4. ИГ + эритропоэтин, 50МЕ/кг 798,5±12,3 у
Б. ИГ + глибенкламид, 5 мг/кг 1135,8±31,2*
6. ИГ + ДИП + глибенкламид, 5 мг/кг 1144,7±20,7*
7. ИГ + эритропоэтин, 50МЕ/кг + глибенкламид, 5 мг/кг 1148,5±14,3*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных; у - р<0,05 в сравнении с группой контроля.
Результаты морфологического исследования сетчатки подтвердили наличие протектив-ных свойств ДИП, фармакологического прекондиционирования эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг при коррекции ишемии-реперфузии сетчатки после 1 ч. реперфузии (рис. 1, 2).
5000 pm 100 и"п 1
Ч ь"'' А Ф
Рис. 1. Резкое изменение объемных и топографических соотношений структур глазного яблока в группе контроля за счет отека с частичным отслоением сосудистой оболочки и сетчатки (А); Б - отек и расслоение сетчатки на уровне наружного сетчатого слоя (светлая стрелка), дилатация и неравномерное кровенаполнение венозных сосудов на уровне ганглионарного слоя и слоя нервных волокон (двойная стрелка) в группе контроля. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х10 (А), Х400 (Б)
5000 ут 100 ут
іГЙ .
Рис. 2. Общий вид меридианного среза глаза с окружающими структурами (А) - топография и объемные соотношения структур без видимых изменений (коррекция эритропоэтином); Б - минимальные структурные изменения сетчатки в виде отечных изменений и разрыхления внутреннего ядерного слоя (стрелка) (коррекция эритропоэтином). Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х10 (А), Х400 (Б)
Результаты оценки уровня микроциркуляции в сетчатке крыс после 72 ч. реперфузии после моделирования ишемии-реперфузии сетчатки и ее коррекции ДИП, эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг представлены в таблице 2.
Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составлял 743,9±5,0 п.е. Уровень микроциркуляции через 72 ч. после моделирования патологии существенно снизился, и в группе контроля составил 353,3±11,7 п.е. (р<0,001), что свидетельствует о формировании повреждения сетчатки к 72 ч. реперфузии. На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции после 72 ч. реперфузии достоверно возрастал до 6з8,5±15,8 п.е. (р<0,05) по сравнению с группой контроля (табл. 2).
Таблица 2
Влияние эритропоэтина и дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) на уровень микроциркуляции в сетчатке после 72 часов реперфузии при моделировании ишемии глаза крыс (М±т; 11=10)
№ п/п Экспериментальные группы Уровень микроциркуляции, п.е.
1. Интактные 743,9±5,0 у
2. ИГ (ишемия глаза) 353,3±11,7*
3. ИГ + ДИП 6з8,5±15,8*у
4. ИГ + эритропоэтин, 50МЕ/кг 724,0*4,1 у
5. ИГ + глибенкламид, 5 мг/кг 359,4±10,3*
6. ИГ + ДИП + глибенкламид, 5 мг/кг 361,7±13,9*
7. ИГ + эритропоэтин, 50МЕ/кг + глибенкламид, 5 мг/кг 372,3±13,4*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой ингактных животных; у - р<0,05 в сравнении с группой контроля.
При коррекции ишемии эритропоэтином уровень микроциркуляции увеличивался до 724,0±4,1 п.е., что достоверно отличалось от значений в группе контроля (р<0,001) и приближалось к значениям в группе интактных животных. Введение глибенкламида в группах с коррекцией ДИП и эритропоэтином предотвращало повышение уровня микроциркуляции.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии протективных свойств ДИП и рекомбинантного эритропоэтина в субэритростимулирующей дозе на модели ишемии-реперфузии сетчатки крыс, заключающихся в предотвращении увеличения микроциркуляции на 1 ч. после реперфузии и улучшении гистологической структуры слоев сетчатки с сохранением минимальных структурных изменений, а также в улучшении показателей уровня микроциркуляции в ишемизированной сетчатке на 72 ч. после реперфузии. Введение глибен-кламида в группах с коррекцией ДИП и эритропоэтином предотвращало коррекцию нарушений микроциркуляции в сетчатке за счет блокады АТФ-зависимых калиевых каналов, что подтверждает наличие прекондиционирующих свойств эритропоэтина в дозе 50МЕ/кг на модели ишемии-реперфузии сетчатки.
Прекондиционирование способно уменьшать последствия ишемических явлений за счет активации АТФ-зависимых калиевых каналов митохондрий, уменьшать оксидативный
стресс за счет индукции ферментов антиоксидантной системы и синтеза белков теплового шока [10].
Полученные результаты совпадают с исследованиями, проведенными в «Центре доклинических и клинических исследований» ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» при моделировании ишемии-реперфузии сердца, кожного лоскута, конечности, печени, почек, поджелудочной железы, плаценты и кишечника у различных животных [1, 2, 3, 4, 6, 7], что свидетельствует об общебиологическом принципе реакции микроциркуляции и ее коррекции с помощью дистантного и фармакологического пре-кондиционирования рекомбинантным эритропоэтином.
l. Алехин, С.Л. Фармакологический анализ влияния прямого и дистантного прекондициониро-
вания на микроциркуляцию в печеночной паренхиме в условиях ее ишемии и реперфузии/ С.А. Алехин, М.В. Покровский, Д.И. Колмыков и др.//Материалы IV фармакологов России «Инновации в современной фармакологии».- М.: Фолиум, 2012. - С.9.
2. Bлияние дистантного ишемического прекондиционирования и рекомбинантного эритропоэ-
тина на воспаление / Л.М. Даниленко, М.В. Покровский, А.Е. Королев и др. // V Конгресс «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология». - СПб., 2010. - С. 98-99-
3. Колесник, ИМ. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином - новые воз-
можности оптимизации выживаемости ишемизированных тканей/ И.М. Колесник, М.В. Покровский, В.А. Лазаренко / / Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". - 2010. №3. - С.32-36.
4. Пат. 2466462 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в пла-
центе рекомбинантным эритропоэтином при ADMA-подобной модели гестоза / M.B. Покровский, B.B. Гуреев, O.C Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ^Oy BПO «Курский государственный медицинский университет Mинистерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации».
- № 20llll637l/l4; опу6л.10.11.2012, Бюл. № 3l. - 4 с.
Б. Писаренко, O. И. Ишемическое прекондиционирование: оттеории к практике / O. И. Писаренко // Кардиология. - 2005. - Т. 45. - № 9. - 62-72.
б. Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином при ишемии конечности / ИМ. Колесник, M.B. Покровский, И.Н. Должикова и др. / / Биомедицина. - 20ll. - № 4. - 90-92.
у. Экспрессия эндоглина и эндотелиальной NO-синтазы в почках при дистантном и фармакологическом прекондиционировании / M.B. Покровский, B.^ Кочкаров, И.Н. Должикова и др. //Буковинський медичний вісник. - 20l2. - Т. 16. - №3 (63), ч. 2. - С. 185 - lSS.
S. Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart / C. J. Parsa, J. Kim, R. U. Riel [et al.] // J. Biological. - 2004. - Vol. 279, N 20. - Р. 655-662.
9. Circulating Erythropoietin Levels and Prognosis in Patients With Congestive Heart Failure. Comparison With Neurohormonal and Inflammatory Markers / J. George, S. Patal, D. Wexler [et al.] // Arch. Intern. Med.
- 2005. - Vol. і6б. - P. l304-l309.
10. Downey, J. M. Signaling pathways in ischemic preconditioning / J. M. Downey, A. M. Davis, M. V. Cohen // Heart Fail Rev. - 2007. - N 12. - P. lSl-lSS.
11. Erythropoietin induces neovascularization and improves cardiac function in rats with heart failure after myocardial infarction / P. Van der Meer, E. Lipsic, R. H. Henning [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. - 2005. -Vol. 4б. - P. l25-l33.
12. The upregulation of glial glutamate transporter-1 participates in the induction of brain ischemic tol-
erance in rats / M. Zhang, W. B. Li, J. X. Geng [et al.] // J. Cereb. Blood. Flow. Metab. - 2007. - Vol. 27. -P. 1352-136S.
PROTECTIVE EFFECT OF ERYTHROPOIETIN IN MODELING RETINAL ISCHEMIA-REPERFUSION
Литература
A.S. SHABELNIKOVA AS. KASHUBA
Modeling of retinal ischemia-reperfusion in white laboratory rats by providing mechanical pressure to the anterior chamber of the eye caused increasing regional blood flow in the retina after 1 h of reperfusion, followed by the development of edema and reduction of retinal microcirculation after 72 hrs. of reperfusion. In terms of this model revealed pronounced correction of microcirculation by recombinant erythropoietin (50 IU/kg). The protective effect of erythropoietin was shot glibenclamide, indicating that preconditioning action involving K +-ATP-ase channels.
А.А. PERESYPKINA M.V. POKROVSKIY А.А. DOLZHIKOV
L.K. BUSLOVSKAYA
Belgorod National Research University
Key words: preconditioning, recombinant erythropoietin, ischemia-reperfusion injury of the retina.
e-mail: [email protected]
