CC BY
84
ОГЛЯДИ
УДК 577.15
ПРОТЕЇН С: МЕХАНІЗМИ ФУНКЦІОНУВАННЯ ТА МЕТОДИ ОДЕРЖАННЯ
Д. Д. ЖЕРНОСЄКОВ1, Т. В. КУРКІНА1'2
1 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
2 Київський національний університет імені Тараса Шевченка
E-mail: chemikdd@mail.ru, kurkina_tanya@ukr.net
Система протеїну С становить важливу ланку регуляції численних фізіологічних і патофізіологічних процесів організму. Розглянуто особливості структури протеїну С та механізми його активації. Особливу увагу приділено функціонуванню активованого протеїну С, його антикоагулянтним, протизапальним і профібри-нолітичним властивостям. З’ясовується можливе терапевтичне застосування препарату протеїну С для лікування багатьох патологій, що характеризуються дефіцитом цього білка. Описано існуючі джерела та підходи до одержання препарату протеїну С.
Ключові слова: протеїн С, гемостаз, антикоагулянт, запалення.
За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я, серцево-судинні захворювання є найпоширенішими серед неінфекційних хвороб. Велику роль у розвиткові ускладнень і високій смертності від серцево-судинних захворювань відіграють їхній тісний взаємозв’язок з багатьма хронічними недугами, посилення ризику при гострих хворобах, а також відсутність досконалих методів діагностики, прогнозування та лікування різноманітних патологій. Пошук засобів вдосконалення існуючих методик і впровадження передових підходів для лікування подібних відхилень є вкрай актуальним завданням. Сучасні методики лікування мають враховувати ключові фізіологічні й біохімічні процеси, яким часто притаманний надсистемний характер. Останнім часом дедалі більшу увагу дослідників привертають молекулярні механізми, що лежать в основі взаємодії різних фізіологічних та біохімічних систем. Так, система гемостазу крові перебуває у тісному зв’язку з ланкою імунної системи, що відповідає за ініціацію та розвиток запальних процесів. Регуляція запальних і гемостатичних процесів — це складні й багатокомпонентні каскади реакцій, що перетинаються на різних рівнях, підсилюючи чи інгібуючи один одного. Од-
ним із білків плазми крові, що регулює як запальні, так і гемостатичні реакції, є протеїн С [1]. Завдяки значній функціональній значущості протеїн С видається одним з потенційних засобів лікування серцево-судинних захворюваннь і тромботичних ускладнень, що зумовлені запальними агентами або, навпаки, спричинюють їх появу.
Гемостаз забезпечує циркуляцію крові у рідкому стані кровоносними судинами організму і зупинку кровотеч у разі ушкодження судин. Ці функції виконують три ланки гемостазу: система зсідання крові, фібрино-літична та антикоагулянтна системи. Протеїн С є гуморальним компонентом системи гемостазу, проте функціонування цього білка тісно пов’язано з її тканинними і тром-боцитарними компонентами. Дія протеїну С полягає у виконанні антикоагулянтних функцій, модуляції фібринолізу і запалення, індукції сигнальних шляхів.
Ще в 1960 р. Seegers W. відкрив активований протеїн С (названий тоді автопро-тромбіном IIa) і показав його здатність пригнічувати зсідання крові [2,3]. Неактивний протеїн С уперше було виділено Stenflo J. у 1979 р. з бичачої плазми в комплексі з вітамін К-залежними білками, що розділялися іонообмінною хроматографією на
ДЕАЕ-сефарозі. Згодом цей білок назвали протеїном С; він виявився проферментом відкритого раніше активованого протеїну С [4].
Структура протеїну С. У крові може циркулювати як одно,- так і дволанцюгова форма протеїну С з переважанням останньої. Концентрація протеїну С у плазмі є досить низькою (2-5 мкг/мл або 40-80 нМ). Легкий ланцюг дволанцюгового протеїну С містить Gla-домен, до складу якого входять 9 залишків у-карбоксиглутамінової кислоти. Саме тому протеїн С відносять до групи вітамін К-залежних білків. у-Карбоксильо-ваними є залишки глутамату в положеннях
6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26 і 29 [5]. Asp71 піддається в-гідроксилюванню [6]. До складу протеїну С також входять два домени, подібні до епідермального фактора росту (Epidermal Growth Factor domain — EGF). Основну частину важкого ланцюга становить типовий для серинових протеїназ каталітичний домен. Також важкий ланцюг містить №Н2-кінцевий активаційний пептид, що містить 12 амінокислотних залишків (рис. 1). Молекулярна маса протеїну — 62 кДа (21 кДа і 41 кДа для легкого і важкого ланцюгів відповідно). Вуглеводна частина молекули становить 23% від маси. Глікози-льованими у протеїну С є амінокислотні залишки Asn 97, Asn248, Asn313 i Asn329. Глікозилювання цих сайтів впливає на секрецію, подальший процесинг, інгібіторні властивості Са2+ відносно активації протеїну С тромбіном без тромбомодуліну та на Е-се-лектинопосередковану клітинну адгезію [7, 8]. Ізоелектрична точка протеїну С лежить у межах рН 4,4-4,8. Коефіцієнт екстинкції Е2801% = 14,5. Час півжиття у плазмі — 8-12 годин. Ген протеїну С людини містить 8 екзо-нів та локалізується на хромосомі 2q13-q14. Унаслідок трансляції утворюється поліпеп-тидний ланцюг, у якому 42 амінокислотні залишки складає лідерна послідовність, 155 — легкий ланцюг, 262 — важкий ланцюг [9].
Активація протеїну С відбувається на мембрані ендотеліальних клітин і тромбоцитів (рис. 2). В основі активації лежить реакція відщеплення активаційного пептиду тромбіном. Однак для здійснення цієї реакції тромбіну необхідно перемкнутися зі шляху зсідання на шлях протизсідання. Білком, що забезпечує таке перемикання, є тромбо-модулін. Внаслідок зв’язування з ним тром-бін перестає виконувати прокоагулянтні функції, тобто перетворювати фібриноген на фібрин та активувати тромбоцити, фактори V і XIII. При цьому в 1 000 разів зростає здатність тромбіну зв’язувати й активувати
Рис 1. Схема первинної структури протеїну С:
* — амінокислотні залишки активного центру;
♦ — глікозильовані амінокислотні залишки; у-залишки у-карбоксиглутамінової кислоти [10]
протеїн С [11]. У процесі активації протеїну С суттєва роль належить іонам кальцію і мембранним фосфоліпідам [12]. Також в активації бере участь ендотеліальний рецептор протеїну С (Endothelial cell Protein C Receptor — EPCR), що посилює цю реакцію у 20 разів. EPCR міститься на мембранах клітин артерій. На поверхні тромбоцитів активація протеїну С стимулюється тромбоци-тарним фактором 4 (Platelet Factor 4 — PF4). Окрім тромбіну, протеїн С може бути активований фактором Ха. Ця реакція посилюється фактором Va. Також як специфічні активатори протеїну С можуть використовуватися активатори з отрут щитомордника. Неспецифічно протеїн С може бути активований трипсином і активатором фактора Х з отрути гадюки Рассела. Фізіологічними інгібіторами активованого протеїну С у плазмі є а1-інгібітор протеїназ [13], а2-макрогло-булін [14], а2-антиплазмін і гепарин-сти-мульований інгібітор протеїну С (protein C inhibitor — PCI) [15]. На поверхні тромбоцитів нексин І [16,17], а також вітронектин у комплексі з інгібітором активатора плаз-міногену контролюють дію активованого протеїну С [18].
Як же протеїн С здійснює антикоагу-лянтні функції? Відомо, що перетворення протромбіну на тромбін опосередковано
Рис. 2. Активація протеїну С (розміщено в порядку зростання швидкості активації):
а — механізм активації комплексом тромбін-тромбомодулін — сульфатований глюкозаміноглікан; б — із залученням тромбоцитарного фактора 4 на поверхні тромбоцитів;
в — із залученням епідермального рецептора протеїну С на поверхні епітеліальних клітин великих артерій. APC — активований протеїн С; ІІа — тромбін;
РС — протеїн С; GAG — глюкозаміноглікан;
PF4 — тромбоцитарний фактор 4; ТМ — тромбомодулін;
EPCR — рецептор протеїну С ендотеліальних клітин [19]
формуванням білкових комплексів (теназ-ного — фактори VIII, IX і протромбіназно-го — фактори Х, V) на мембрані активованих клітин судин. Фактори VIIIа і Vа є кофакторами активації протеїназ зсідання. У процесі генерації тромбіну він сам посилює свою подальшу активацію шляхом активування факторів VIII і V. Дія активного протеїну С спрямована на розщеплення цих факторів і таким чином на інгібування генерації тромбіну [20].
Збалансований рівень білків гемостазу в плазмі забезпечує активацію протеїну С генерованим тромбіном. Активований протеїн С запобігає підсиленню продукування тромбіну через інактивацію кофакторів цього процесу. Паралельно в нормальному режимі працює фібриноліз, що забезпечує розчинення недоцільно утворених полімерів фібрину. Інактивація факторів VШа і Vа активованим протеїном С пришвидшується за наявності Са2+ і фосфоліпідів. Спорідненість активного протеїну С до фосфоліпідів підвищує протеїн 8, що також є вітамін К-залеж-ним білком і синтезується печінкою, ендо-теліальними клітинами і тромбоцитами. Наявність іонів Са2+ є важливим регулювальним фактором у функціонуванні протеїну С, оскільки вони не лише стимулюють активацію зимогену тромбіном у присутності тромбомодуліну, а й інгібують активацію за його відсутності. Розміщена поряд з Са2+-зв’язувальним сайтом протеазного домену автолітична петля протеїну С (залиш-
ки 301-316) на 5 амінокислотних залишків довша від цієї самої структури в інших сери-нових протеаз. Вважають, що ця петля, просторово взаємодіючи з активаційним пептидом, відіграє вирішальну роль у підтримці конформації зимогену, що не піддається розщепленню тромбіном за відсутності тромбомодуліну [21].
Важливу роль відіграє протеїн С також як профібринолітик. У численних експериментах in vivo й in vitro показано здатність активованого протеїну С стимулювати фібриноліз, однак механізм цієї реакції ще пов-ною мірою не з’ясовано. Видається вірогідною ідея про посилення фібринолізу через інгібування генерації тромбіну, що призводить до зменшення активації інгібітора фібринолізу, який активується тромбіном (TAFI) [22], а також пригнічення низки процесів, зумовлених тромбіном, у тому числі й секреції інгібіторів активаторів плазміно-гену. TAFI інгібує фібриноліз, відщеплюючи C-кінцеві лізини фібрину, що є місцем зв’язування плазміногену — проформи ключового ферменту фібринолізу. Подібно до протеїну С, активація TAFI забезпечується комплексом тромбін-тромбомодулін. Таким чином, на рівні цього комплексу відбувається балансування процесів зсідання крові та фібринолізу. За умов запалення вірогіднішою є активація TAFI, оскільки окисні реакції, характерні для вогнища запалення, не зачіпають важливі для цього процесу сайти в молекулі тромбомодуліну,
тимчасом як здатність активувати протеїн С значно зменшується. Досліджуючи хворих на діабет, виявили кореляцію рівня циркулюючого TAFI і комплексу APC-PCI, що свідчить про сприяння APC фібринолізу через модуляцію дії TAFI. Проте значне зменшення відношення концентрації D-димерів до комплексів тромбіну з антитробіном ІІІ (DD/TAT) у цих пацієнтів порівняно з контролем дозволяє припустити, що рівень APC недостатній для протидії пригніченню фібринолізу [23].
Деякі вчені запропонували механізм регуляції фібринолізу через комплексоутворення з інгібітором активатора плазміногену (РАІ-1) і вивільнення активаторів плазміногену [25]. Так, антикоагулянтний ефект протеїну С значно послаблений на активованих тромбоцитах. Активовані тромбоцити виділяють велику кількість РАІ-1 і вітронектину. Вітронектин у 300 разів посилює інгібування активованого протеїну C інгібітором активатора плазміноге-ну-1 (константа швидкості другого порядку
1,8105 M-1-s-1 порівняно з 5,7-102 M-1-s-1 у разі системи без вітронектину). Отже, РАІ-1 може бути основним фізіологічним інгібітором активованого протеїну С за умов гострої фази, коли посилюються прокоагулянтні процеси [18]. Тому нейтралізації протитромболітично-го і прокоагулянтного ефекту РАІ-1 можна досягти шляхом уведення екзогенного АПС пацієнтам, яких лікують тромболітиками. Так, позитивний ефект спостерігався під час уведення АПС пацієнтам з гострим інфарктом міокарда, яких лікували рекомбінантним тканинним активатором плазміногену. Крім того, активований протеїн С інгібує продукування TNF-b, що стимулює експресію PAI-1 ендо-теліальними клітинами [26].
Участь протеїну С у регуляції запальних процесів є яскравим прикладом функціональної залежності процесів запалення і коагуляції (рис. 3). Ініціатором зсідання є контакт тканинного фактора з кров’ю. У нормі тканинний фактор представлений клітинами у місцях, ізольованих від крові. Порушення цілісності тканин призводить до припинення цієї ізоляції. При цьому утворюється комплекс тканинного фактора з фактором VII, що зумовлює активацію фактора Х і утворення тромбіну. При запаленнях, спричинених патологіями, і потраплянні в кров’яне русло ендотоксину, що супроводжується запаленням, моноцити і ендотеліальні клітини можуть бути стимульовані до експресії тканинного фактора. Це може спричинити активацію зовнішнього механізму зсідання крові і генерації тромбіну. Тромбін є підси-
Зсідання Фібриноліз Запалені
Рис. З. Роль активованого протеїну С в регуляції
запалення, зсідання крові та фібринолізу:
PC — протеїн С; аРС — активований протеїн С; PS — протеїн S; PAI-1 — інгібітор активатора плаз-міногену першого типу; Tr — рецепор тромбіну; CD1/MHC — головний комплекс гістосумісності; Va — активований фактор V; УШа — активований фактор VIII [24]
лювачем запальних реакцій. Як активатор тромбоцитів, він індукує секрецію білків адгезії, стимуляторів хемотаксису моноцитів, тромбоцитарного фактора росту. Також тромбін є мітогеном для більшості клітин, що реалізують запалення. Aктивація тром-біном тканинних фібробластів індукує секрецію фактора росту судинного ендотелію і простагландину E2.
Наслідком запалення є пригнічення фібринолізу і зниження антикоагулянтного потенціалу плазми, у тому числі й у зв’язку з інгібуванням шляху протеїну С. Причинами зниження протеїн С-обумовленого антикоа-гулянтного потенціалу плазми при запаленнях є блокування медіаторами запалення IL-1 і TNF-a, а також ендотоксинами транскрипції генів тромбомодуліну і ендотеліа-льного рецептора протеїну С, збільшення кількості вищеплюваних із мембрани молекул тромбомодуліну та ендотеліального рецептора протеїну С, пов’язане зі збільшенням кількості окисників у вогнищі запалення, окиснення метіоніну в молекулі тромбо-модуліну, що зумовлює зменшення його кофакторної активності в реакції активації протеїну С, а також підвищення рівня С4Ь-зв’язувального білка, який утворює коплек-си з протеїном S, позбавляючи його можливості виступати кофактором активного протеїну С [1].
Велика кількість експериментальних даних підтвердила важливу роль активованого протеїну С як протизапального агента.
Його протизапальна дія виявляється у впливі на моноцити (він зменшує продукування II-1, TNF-a), інгібуванні ролінгу нейтрофілів, захисті епітеліальних клітин від загибелі. Індукцію сигнальних шляхів спричинює протеолітична активація PAR-1 рецепторів активованим протеїном С у комплексі з EPCR. Показано антиоксидантну, цито-протекторну і антиапоптичну дію активованого протеїну С та розглядається можливість застосування його на противагу згубним для нервової системи ефектам рекомбінантного тканинного активатора плазміногену [27, 28]. У свою чергу, зменшення запалення сприяє зниженню прокоагулянтних і проти-фібринолітичних властивостей плазми загалом, що, знову ж таки, має сприяти зменшенню запалення. Тому патології в системі протеїну С спричинюють серйозні порушення діяльності всього організму.
Існує низка хвороб, безпосередньо пов’язаних із дисфункцією протеїну С. Так, відома спадкова недостатність протеїну С двох типів: тип І, зумовлений зниженням синтезу протеїну С печінкою, і тип ІІ, пов’язаний з дефектами структури молекули. Рівень протеїну С перебуває в межах норми, але він втрачає здатність до взаємодії з тромбіном. Спадкова недостатність протеїну С може бути як гетерозиготною (частота — 1 випадок серед 200-300 дорослих), так і гомозиготною (1 випадок на 160 000-360 000 новонароджених). Серйозні клінічні симптоми з’являються, коли концентрація протеїну С перебуває на рівні 20-25% від норми. У такому разі судини шкіри, очей, нирок і мозку найбільшою мірою схильні до некрозів
і тромбозів [29, 30].
Дефіцит протеїну С, як й інших антикоагулянтів, — досить рідкісне явище, на відміну від резистентності до активованого протеїну С. Ця хвороба характеризується мутацією гена фактора V, за якої фактор Vа втрачає здатність до інактивації протеїну С. Ще частішими є випадки набутої недостатності протеїну С, що може бути спричинено хворобами печінки, ДВС-синдромом, лікуванням антагоністами вітаміну К, злоякісними новоутвореннями й іншими патоло-гіями [31].
Ключова роль протеїну С у захисних системах організму зумовила потребу в одержанні очищеного препарату цього білка. Для отримання концентрату протеїну С використовують плазму крові, культуру клітин та молоко трансгенних тварин. Кожне із цих вихідних джерел має певні недоліки та переваги. Так, одержання протеїну С з куль-
тури Е. coli є відносно недорогим та ефективним засобом, однак синтезований таким чином протеїн С може бути неактивним через неправильний фолдинг або посттрансляцій-не глікозилювання. Препарат протеїну С, отриманий з молока трансгенних тварин, є досить дорогим, але його фолдинг та пост-трансляційні модифікації є більш відповідними до природного білка. Вже одержано препарат з молока трансгенних свиней
з концентрацією протеїну С 1 г/л (для порівняння: концентрація протеїну С у плазмі людини — 4 мг/л) [32]. Однак технологія подальшого очищення протеїну С з молока трансгенних тварин виявилась украй неефективною. Кінцевий вихід цільового білка становив лише 24%, головним чином через значні втрати протеїну С на стадії відділення від казеїнів молока [33].
У подальшому було запропоновано використання методу очищення протеїну С з молока трансгенних тварин на основі метало-афінної хроматографії на залізовмісному сорбенті. Таким чином вдалося досягти відділення протеїну С від а-лактальбуміну, ß-лактоглобуліну та казеїнів, однак, як свідчили результати перевірки амідолітич-ної активності очищеного препарату, кінцевий вихід протеїну С був невисоким. Автори роботи вважають, що значна кількість протеїну С залишилася зв’язаною з колонкою [34]. Отже, хоча використання трансгенних тварин для одержання протеїну С має свої переваги, цей метод є досить високовартіс-ним. Окрім того, отримані з молока транс-генних тварин білки можуть викликати у пацієнтів алергійні реакції. Відомо, що домішка денатурованих похідних у натив-них білках сприяє ініціації автоімунних процесів відносно нативної ізоформи, що зумовлює виникнення тяжких патологічних ускладнень [35]. Тому для отримання протеїну С актуальним залишається використання донорської плазми та її фракцій. Найефективнішим методом для очищення протеїну С вважають імуноафінну хроматографію. Ще в 1995 р. Ortner та співавтори запропонували метод імуноафінного очищення, поєднаний з вірусною інактивацією препарату Pr С [36]. Для вірусної інактивації було розроблено сольвентдетергентний прийом, завдяки якому здійснювалась інактивація вірусу СНІДу. Протеїн С було очищено в 13 600 разів порівняно з препаратом плазми, кінцевий продукт мав специфічну активність 231 одиниця/мг [36]. Незважаючи на високу ефективність цього методу, деякі автори [37, 38] відзначають його
недоліки, пов’язані із забрудненням кінцевого продукту антитілами мишей. До того ж технологія використання моноклональних антитіл дуже високовартісна.
Оскільки перед хроматографічним очищенням препарату протеїну С донорська плазма потребує додаткових етапів очищення (адсорбція вітамін К-залежних білків на сульфаті барію, фракціонування сульфатом амонію), деякі автори вважають за доцільне використання фракції IV-1 за Коном. З літературних джерел відомо, що ця фракція містить близько 100 мкг протеїну С на 1 г пасти [39]. Але крім Pr С, фракція IV-1 за Коном містить й інші білки: альбумін, а-1-антитрипсин, антитромбін ІІІ, церулоплаз-мін, протромбін тощо. Деякі з цих білків є інгібіторами активованого протеїну С, тому присутність їх в очищеному препараті є небажаною [40]. Фракції IV та IV-1 за Коном є зручним джерелом для одержання Pr С, тому що це побічний продукт у процесі фракціонування плазми крові з метою отримання сироваткового альбуміну. У вітчизняній фармакологічній промисловості ці фракції використовують для одержання препарату полібіоліну [41]. Доведено, що полібіолін має протизапальну дію. Цілком імовірно, що певною мірою це зумовлено присутністю в цьому препараті Pr С та церу-лоплазміну, для яких теж визначено протизапальний ефект. У разі очищення фракції IV за Коном доцільним є послідовне використання іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-FF-сефарозі та хроматографії на ме-талоафінному сорбенті [42]. За даними цих авторів, завдяки сумісному використанню зазначених носіїв, можна досягти очищення фракції IV-1 за Коном у 128 разів.
Підсумовуючи дані щодо очищення протеїну С з різних джерел, можна зробити висновок, що найбільш доцільним для розроблення препарату протеїну С може бути очищення IV-1 фракції за Коном та послідовне очищення препарату на іонообмінни-ку та металоафінному сорбентах. Слід також зазначити, що внаслідок складної багатомодульної будови протеїн С належить до лабільних білків, що схильні до аутоінак-тивації та потребують розроблення спеціальних методів збереження нативної структури [35].
Застосуванню протеїну С з терапевтичною метою присвячено чимало робіт. Велику роль у цих дослідженнях відіграла програма PROWESS (Recombinant Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis), що завершилась уведенням
до клінічної практики рекомбінантного активованого протеїну С Xigris [Drotrecogin alpha (Eli Lilly, США/Німеччина)] для лікування тяжкого сепсису з високим ризиком летального кінця. Використання активованого протеїну С у клініці продемонструвало зниження смертності від сепсису на 19,4%. При цьому ризик масивних кровотеч дорівнював 3,5% у досліджуваній групі (проти 2% у контрольній). Водночас у рамках дослідження RESOLVE (REsearching severe Sepsis and Organ dysfunction in children: a gLobal perspectiVE) підтвердити ефективність активованого рекомбінантного протеїну С у дітей з тяжкою формою сепсису не вдалося [43].
Окрім рекомбінантного, зареєстровано отримані з плазми крові людини препарати протеїну С Ceprotin (Baxter International, Австрія) і Protexel (LFB, Франція) [44], а також його активної форми AnactC (Kaketsuken, Японія) [45]. Вони призначені для запобігання і лікування венозних тромбозів і геморагічної висипки за значної вродженої недостатності протеїну С. Донедавна ці препарати були зареєстровані лише на внутрішніх (європейському чи японському) ринках. Але в березні 2007 р. американська Агенція з контролю якості їжі і лікарських препаратів (Food and Drug Administration, FDA) схвалила використання Ceprotin для лікування вродженої недостатності цього білка. В Європі цей препарат було затверджено ЕМЕА ще в 2001 р. Відзначається ефективність препаратів протеїну С при терапії набутої недостатності цього білка [29].
Виходячи з наведених даних про властивості протеїну С, видається доцільним подальше розроблення методів його одержання, вивчення функціональної ролі, а також дослідження застосування цього білка чи його активної форми для запобігання повторному тромбоутворенню і патологічним наслідкам експресії значної кількості РАІ-1, для корекції запальних процесів, як нейропротектора при інсульті та для лікування дефіциту протеїну С. Враховуючи вагомість системи протеїну С у регуляції як запальних, так і гемостатичних процесів, модуляція вмісту її компонентів може стати основою прогресивних і якісно нових стратегій лікування серцево-судинних та багатьох інших захворювань [46, 47, 48].
ЛІТЕРАТУРА
1. Esmon C. The anticoagulant and anti-inflammatory roles of the protein C anticoagulant pathway // J. Autoimmun. — 2000. — V. 15, N2. — Р. 113-116.
2. Mammen E, Thomas W., Seegers W. Activation of purified prothrombin to autoprothrombin I or autoprothrombin II (platelet cofactor II) or autoprothrombin II-A // Thromb Diath Haemorrh. — 1960. — V. 5. — P. 218-249.
3. Seegers W., Novoa E., Henry R., Hassouna H. Relationship of «new» vitamin K-dependent Protein C and «old» autoprothrombin II-a // Thromb Res. — 1976. — V. 8, N5. — P. 543-552.
4. Stenflo J. A new vitamin K-dependent protein. Purification from bovine plasma and preliminary characterization //J. Biol. Chem. — 1976. — V. 251, N2. — P.355-363.
5. Beckmann R., Schmidt R., Santerre R. et al. The structure and evolution of a 461 amino acid human protein C precursor and its messenger RNA, based upon the DNA sequence of cloned human liver cDNAs // Nucleic Acids Research. — 1985. — V. 13, N14. — Р. 5233-5247.
6. Drakenberg T., Femlund P., Roepstorff P. et al. в-Hydroxyaspartic acid in vitamin K-de-pendent protein C // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1983. — V. 80, N7. — P. 1802-1806.
7. Grinnell S., Walls J., Gerlitz B. Glycosylation of human protein C affects its secretion, processing, functional activities, and activation by thrombin // J. Biol. Chem. — 1991. — V. 266, N15. — Р. 9778-9785.
8. Grinnell S., Hermann R., Yan S. Human protein C inhibits selectin-mediated cell adhesion: role of unique fucosylated oligosaccharide // Glycobiology. — 1994. — V. 4, N2. — Р. 221-225.
9. Patracchini P., Aiello V., Palazzi P. et al. Sublocalization of the human protein C gene on chromosome 2q13-q14 // Hum. Genet. — 1989. — V. 81, N2. — Р. 191-192.
10. Castellini F. Human protein C and activated protein C // Trends Cardiovasc. Med. — 1996. — V. 5, N2. — P. 55-62.
11. Esmon N., Owen W., Esmon C. Isolation of a membrane-bound cofactor for thrombin-catalyzed activation of protein C // J. Biol. Chem. — 1982. — V. 257, N2. — Р. 859-64.
12. Kisiel W., Canfield W., Ericsson L. et al. Anticoagulant properties of bovine plasma protein C following activation by thrombin // Biochemistry. — 1977. — V. 16, N26. — Р. 5824-31.
13. Van der Meer F., van Tilburg N., van Wijngaarden A. A second plasma inhibitor of activated protein C: a1-antitrypsin // Thromb Haemost. — 1989. — V. 62, N2. — P. 756-762.
14. Hoogendoorn H., Toh C, Nesheim M. et al. Alpha 2-macroglobulin binds and inhibits activated protein C // Blood . — 1991. — V. 78, N9. — P. 2283-2290.
15. Laurel M., Stenflo J., Carlson T. Turnover of
*I-protein C inhibitor and *I-antitrypsin and their complexes with activated protein C // Ibid. — 1990. — V. 76, N11. —
P. 2990-2995.
16. Hermans J., Stone S. Interaction of activated protein C with serpins // Biochem. J. — 1993. — V. 295, N1. — P. 239-245.
17. Suzuki K, Nishioka J, Hashimoto S. Protein C inhibitor: purification from human plasma and characterization // J. Biol. Chem. — 1983. — V. 258, N1. — P. 163-168.
18. Rezaie A. Vitronectin Functions as a Cofactor for Rapid Inhibition of Activated Protein C by Plasminogen Activator Inhibitor-1 // Ibid. — 2001. — V. 276, N19. — P. 15567-15570.
19. Laurent O., Mosnier J., Griffin H. Protein C anticoagulant activity in relation to antiinflammatory and anti-apoptotic activities // Frontiers in Bioscience. — 2006. — V. 11. — P. 2381-2399.
20. Davie E., Fujikawa K., Kisiel W. The coagulation cascade: Initiation, maintenance and regulation // Biochemistry. — 1991. — V. 30, N43. — P. 10363-10370.
21. Yang L., Manithody C., Rezaie A. The functional significance of the autolysis loop in protein C and activated protein C // Thromb Haemost. — 2005. — V. 94, N1. — P. 60-68.
22. Gresele P., Momi S., Berrettini M. et al. Activated Human Protein C Prevents Thrombin-induced Thromboembolism in Mice. Evidence that Activated Protein C Reduces Intravascular Fibrin Accumulation through the Inhibition of Additional Thrombin Generation // J. Clin. Invest. — 1998. — V. 101, N3. — P. 667 — 676.
23. Yano Y., Gabazza E., Hori Y. et al. Association Between Plasma Thrombin-Activatable Fibrinolysis Inhibitor Levels and Activated Protein C in Normotensive Type 2 Diabetic Patients // Diabetes Care. — 2002. — V. 25, N7. — P.1245-1246.
24. Dettenmeier P., Swindell B., Stroud M. et al. Role of Activated Protein C in the Pathophysiology of Severe Sepsis // Am. J. Crit. Care. — 2003. — V. 12, N.6. — P. 518-526.
25. Sakata Y., Loskutoff D., Gladson C. et al. Mechanism of protein C-dependent clot lysis: role of plasminogen activator inhibitor // Blood. — 1986. — V. 68, N6. — P. 1218-1223.
26. Sakamoto T., Ogawa H., Takazoe K. et al. Effect of activated protein C on plasma plasminogen activator inhibitor activity in patients with acute myocardial infarction treated with alteplase. Comparison with
unfractionated heparin // J. Am. Coll. Cardiol. — 2003. — V. 42, N8. — Р. 1389-94.
27. Cheng T., Liu D., Grifin J. et al. Activated protein C blocks p53-mediated apoptosis in ischemic human brain endothelium and is neuroprotective // Nat. Med. — 2003. — V. 9. — Р. 338-342.
28. Cheng T, Petraglia A., Li Z. Activated protein C inhibits tissue plasminogen activator-induced brain hemorrhage // Ibid. —
2006. — V. 12, N11. — P. 1278-1285.
29. Kleijin E. de, Groot R. de, Hack E. et al. Activation of protein C following infusion of protein C concentrate in children with severe meningococcal sepsis and pupura fulminans: a randomized, double-blinded, placebo-controlled, dose-finding study // Crit. Care Med. — 2003. — V. 31, N6. — Р. 1839-184.
30. Emmerich J., Vossen C., Callas P. et al. Chronic venous abnormalities in symptomatic and asymptomatic protein C deficiency // J. Thromb. Haemost. — 2005. — V. 3, N7. — Р. 1428-1431.
31. Bucciarelli P., Rosendaal F., Tripodi A. et al. Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance: a multicenter collaborative family study // Arte-rioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 1999. — V. 19, N4. — Р. 1026-33.
32. Velander W., Johnson I., Page R. et al. High-Level Expression of a Heterologous Protein in the Milk of Transgenic Swine Using the cDNA Encoding Human Protein C // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1992. — V. 89, N24. — Р. 12003-12007.
33. Drohan W., Wilkins D., Latimer E. et al. A scalable method for the purification of recombinant human protein C from the milk of transgenic swine in Advances in bioprocess engineering. — Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1994. — Р. 501-507.
34. Wu H., Bruley D. Chelator, metal ion and buffer studies for protein C separation // Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Molecular & Integrative Physiology. — 2002. — V. 132, N1. — P. 213-220.
35. Шевель М. В., Веревка С. В. Автоповреждения белковых препаратов: молекулярные механизмы и пути их предотвращения // Совр. пробл. токсикол. — 2006. — №3. —
C. 41-45.
36. Ortner C., Ralston A., Gee D. et al. Large-scale production and properties of immuno-
affinity-purified human activated protein C concentrate // Vox Sang. — 1995. — V. 69, N4. — P. 309-318.
37. Bruley D., Droxan W. Protein C and related anticoagylants advances in applied biotechnology series: Culf Publishing Company: Houston,TX. — 1990. — V. 11. — Р. 11-27.
38. Wu H., Bruley D. F. Homologous human blood protein separation using immobilized metal affinity cromatography: Protein C separation from prothrombin with application to the separation of factor IX and prothrombin // Biothechnol.Prog. — 1999. — V. 15, N5. — P. 928-931.
39. Bertina R.M. Protein C and related proteins, biochemical and clinical aspects. — Churchill Livingstone: New York, 1998. — Р. 1-54.
40. Волков Г. Л., Платонова Т. Н., Савчук А. Н. и др. Современные представления о системе гемостаза. — К.: Наук. думка, 2005. — 296 с.
41. Качаровский Б. В., Криворучко Р. А., Мин-дюк М. В. Типовой регламент производства полибиолина. — К.: Мин-во здравоохранения УССР, 1975.
42. Wu H., Bruley D. Process scale-up studies for protein C separation using IMAC // Adv. Exp. Med.Biol. — 2005. — V. 599. — P. 61-66.
43. Nadel S. et al. Drotrecogin alfa (activated) in children with severe sepsis: a multicentre phase III randomised controlled trial // Lancet. — 2007. — V. 369, N10. — Р. 836-43.
44. Dreyfus M., Ladouzi A., Chambost H. et al. Treatment of inherited protein C deficiency by replacement therapy with the French purified plasma-derived protein C concentrate (PROTEXEL®) //Vox Sanguinis. —
2007. — V. 93, N3. — P. 233-240.
45. Hajime T. Human activated protein C. Anact C. // Clinics & Drug Therapy. — 2001. — V. 20, N4. — Р.426-427.
46. Genc K. The rationale for activated protein C treatment in perinatal white matter injury // Medical Hypotheses. — 2007. — V. 68, N6. — P. 1418-1419
47. Genc K. Activated protein C: Possible therapeutic implications for multiple sclerosis // Ibid. — 2007. — V. 68, N3. — P. 710.
48. Genc K. Activated protein C: Therapeutic implications for Alzheimer’s disease // Ibid. — 2007. — V. 69, N3. — P. 701-702.
ПРОТЕИН С:
МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ
Д. Д. Жерносеков1, Т. В. Куркина1, 2
1Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украини, Киев
2Киевский национальний университет имени Тараса Шевченко
E-mail: chemikdd@mail.ru, kurkina_tanya@ukr.net
Система протеина С составляет важное звено многих физиологических и патофизиологических процессов организма. Рассмотрены особенности структуры протеина С и механизмы его активации. Особое внимание уделено функционированию активного протеина С, его антикоагулянтным, противовоспалительным и профибринолитическим свойствам. Рассматривается возможное терапевтическое применение препарата протеина С для лечения многочисленных патологий, характеризующихся дефицитом этого белка. Описаны существующие источники и подходы для получения препарата протеина С.
Ключевые слова: протеин С, гемостаз, антикоагулянт, воспаление.
PROTEIN C:
MECHANISMS OF FUNCTIONING AND PRODUCTION METHODS
D. D. Zhernosekov1, T. V. Kurkina1, 2
1Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Taras Schevchenko Kyiv National University
E-mail: chemikdd@mail.ru, kurkina_tanya@ukr.net
Protein C pathway is an important link in numerous physiological and pathophysiological processes of organism. The particular features of protein C structure and mechanisms of its activation are considered. Special attention is given to functioning of activated protein C, to its anticoagulant, anti-inflammatory and profib-rinolytical properties. Possible therapeutic application of protein C for the treatment of large number of pathologies characterized by protein C deficiency is observed. Current sources and approaches for protein C preparation are described.
Key words: protein C, hemostasis, anticoagulant, inflammation.
