CC BY
90
© КУЛИКОВ В.Ю., СОРОКИН О.В., ОРУМБАЕВА С.К., КОЗЯЕВА Е.А., АБРАМЦОВА А.В.
УДК 616.153.915:612.1 - 014.426
ПРООКСИДАНТНЫЙ И АНТИОКСИДАНТНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МОНОНУКЛЕАРОВ В УСЛОВИЯХ ОСЛАБЛЕННОГО ГЕОМАГНИТНОГО ПОЛЯ
В.Ю. Куликов, О.В. Сорокин, С.К. Орумбаева, Е.А. Козяева, А.В. Абрамцова
Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н.,
проф. И.О. Маринкин; кафедра нормальной физиологии, зав. - д.м.н., проф.
В.Ю. Куликов.
Резюме. В работе приведены оригинальные данные по влиянию гипомагнитной депривации на прооксидантный и антиоксидантный потенциал и характер фото-электронной эмиссии мононуклеаров крови человека и мышей линии (CBA*C57BL/6)F1.
Ключевые слова: мононуклеары, прооксиданты, антиоксиданты,
гипомагнитная депривация, фото-электронная эмиссия.
Куликов Вячеслав Юрьевич - д.м.н., проф., зав. каф. нормальной физиологии НГМУ; e-mail: kuliko v_42 @mail. ru.
Сорокин Олег Викторович - к.м.н., доцент каф. нормальной физиологии НГМУ; e-mail: biokvant@mail.ru.
Орумбаева Сауле Кокимжановна - аспирант каф. нормальной физиологии НГМУ; тел.: 8(383)2926709.
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что некоторые показатели системы крови являются очень чувствительными индикаторами космофизических воздействий, что определяет их участие в реализации типовых патологических процессов в различных регионах в целом и регионах Крайнего Севера в частности [3]. Имеют место систематические изменения год от года числа форменных элементов крови, в основном сопряжённые с 11летним циклом активности. В годы максимума солнечной активности число лейкоцитов снижается в 1,5-1,7 раза по сравнению с годами минимума, одновременно лейкоцитарное равновесие сдвигается в сторону лимфоцитов. Магнитные поля, едва отличающиеся от нормального геомагнитного поля (ГМП), демонстрируют биологическую активность, даже более высокую, чем магнитные поля высоких напряженностей [6]. Подтверждением этому являются данные о том, что ослабленное ГМП, регистрируемое в экранированных сооружениях, является серьезным фактором риска, потенцирующим течение хронических заболеваний внутренних органов воспалительной и не воспалительной природы. В зависимости от степени ослабления ГМП и длительности пребывания в этой среде могут развиваться адаптационные, стрессорные и компенсаторные реакции или необратимые патологические изменения. Критическими системами при воздействии ГМП являются нервная и иммунная системы.
Поскольку мононуклеары являются основой антимикробной защиты организма, в своих исследованиях мы изучали их реактивность в условиях ослабленного геомагнитного поля. Оценивалась интенсивность реакций свободнорадикального окисления, в основе которой лежит наработка активных форм кислорода, обладающих микробицидными свойствами. Активные формы кислорода токсичны как для микроорганизма, так и для самой клетки. Но благодаря тому, что они локализованы в фагоцитарной вакуоли, поражение других компартментов клетки незначительно. Усиление процессов свободнорадикального окисления и накопление их токсических продуктов в тканях и
органах приводит к нарушению функционально-структурной целостности мембран. В норме процессы свободно-радикального окисления уравновешены противодействием антиоксидантной системы организма. Система антиоксидантной защиты организма противостоит процессу запуска и развития свободнорадикальных реакций, предотвращая свободнорадикальную деградацию липопротеинов плазмы крови и липидной составляющей клеточных мембран [5]. При нарушении баланса реакций свободнорадикального окисления и активности антиоксидантной системы в сторону преобладания окислительных реакций, происходит повреждение внутриклеточных структур за счёт реакций перекисного окисления липидов
(ПОЛ), разрыва цепей ДНК, снижения интенсивности гликолиза, уменьшения
2+
пула АТФ, увеличение концентрационного содержания внутриклеточного Са , деполимеризации актина, морфологические изменения клеточной мембраны [2]. Поскольку эти процессы становятся необратимыми при дефиците антиоксидантной системы, то гибель клетки в большинстве случаев неминуема
[1,4].
Есть основания считать, что одним из важных механизмов влияния электромагнитных полей на биологические системы является их воздействие на реактивность мононуклеаров крови, что реализуется в изменении баланса между «оксидантным - прооксидантным потенциалом» клетки.
Цель исследования - изучение прооксидантногго и антиоксидантного потенциала мононуклеаров крови человека и мышей линии (CBA*C57BL/6)F1 в условиях ослабленного гипогеомагнитного поля.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали мононуклеары периферической крови 18 здоровых лиц в возрасте 19 лет, а также перитонеальные макрофаги и клетки костного мозга мышей. Исследование регламентировано письменным информированным согласием доноров и одобрено комитетом по биоэтике ГУ НЦ КЭМ СО РАМН, Новосибирск.
После выделения клеток производилась их сепарация на градиенте плотности фиколл-верографина (плотностью 1760), для получения мононуклеаров. Кроме того, данная процедура позволяла отделить живые клетки от нежизнеспособных и повреждённых клеток, что позволило в дальнейшем связать особенности оптико-электронной эмиссии именно с наличием в среде жизнеспособного клеточного материала.
Оценка прооксидантной и антиоксидантной активности проводилась в условиях контроля и опыта (гипогеомагнитное экранирование).
Оценку прооксидантной и антиоксидантной активности проводили с помощью биохемилюминесцентного анализатора (БЛМ 360 бМ). Для этого к
0,7 мл. раствора Хенкса без фенолового красного, добавлялся 0,1 мл. гепаринизированной крови и 0,1 мл. 10 М люминола. После
термостатирования в течение 5 минут в кювету вносился 0,1 мл. зимозана и сразу регистрировалась хемилюминесценцию при 37° С.
Геомагнитное поле низкой напряженности было получено в ферромагнитной камере. Гипомагнитные экраны описанной конструкции позволяют экранировать геомагнитное поле в 105 раз [6].
Для регистрации параметров фото-электронной эмиссии клеток мышей использована технология оценки характеристик газового разряда вокруг капли [10] заданного объёма (10 мкл), находящейся на капилляре одноразового инсулинового шприца с насадкой, получаемой путём её нанесения вариационной пипеткой. Производилась запись 10 капель из различных проб (клетки до и после экспозиции в гипомагнитной камере) с частотой 20 кадров в секунду и продолжительностью воздействия электромагнитного поля 5 секунд. Дефектные видеозаписи сигнала подвергались визуальной выбраковке [7].
Результаты и обсуждение
Показано, что после нахождения клеток в условиях ферромагнитного экрана наблюдается достоверное снижение антиоксидантной активности, по сравнению с контролем (р=0,001). В то же время их прооксидантная активность практически не изменялась. Aнтиоксидантная активность супернатанта
снижалась, а его прооксидантная активность повышалась. Антиоксидантная активность супернатанта, по сравнению с антиоксидантной активностью клеток в экранируемом пространстве (минус поле) достоверно снижалась (р =0,01) (табл. 1).
Таким образом, данные табл. 1 свидетельствуют о сдвиге системы
антиоксиданты/прооксиданты в сторону прооксидантов. С использованием методов регрессионного анализа графически оценивалась взаимосвязь между антиоксидантной активностью мононуклеаров крови и их прооксидантной активностью. Полученные данные представлены на рис. 1 и 2.
Как видно из рис. 1, в условиях ослабленного геомагнитного поля
наблюдается практически линейная зависимость между про- и антиоксидантным потенциалом клеток в достаточно большом диапазоне показателей, то есть, чем больше в клетках генерируется активных форм кислорода, тем больше величина антиокислительной активности. В контроле, что видно из рис. 2, зависимость носит иной характер. В условиях повышенной наработки активных кислородных метаболитов величина антиокислительной активности начинает резко снижаться, свидетельствуя о развитии неконтролируемого окислительного стресса. На основании полученных данных делается вывод о том, что в условиях ослабленного геомагнитного поля в мононуклеарах создаются условия, (очевидно за счет дестабилизации генома), для ускорения процессов индукции супероксиддисмутазы, как фермента, являющегося основным звеном регуляции содержания активных кислородных метаболитов в клетке.
Известно, что генерация активных кислородных метаболитов в мононуклеарах осуществляется оксидазным комплексом (НАДФН-оксидаза), локализованном на мембране [8]. Изменение конформации мембраны или её заряда способствует генерации активных форм кислорода. В этих реакциях используется восстанавливающий агент НАДФН, стимуляторами их являются глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и другие ферменты гексозомонофосфатного
шунта. В результате, клетка генерирует супероксид (О") и перекись водорода (Н2О2), которые выделяются в фагосому для уничтожения бактерий [9]. С учетом того, что НAДФН-оксидаза является мембранолокализованным ферментом, мы изучали изменение мембранного потенциала мононуклеаров в условиях ослабленного геомагнитного поля с целью выявления его мембранотропных свойств.
Изменения мембранного потенциала оценивали методом проточной цитофлуориметрии, по характеру эмиссии потенциалзависимого зонда ДСМ до и после нахождения клеток в условиях ферромагнитного экрана с коэффициентом экранирования 10" . Накопление зонда в премембранном пространстве зависит от величины электрического заряда.
Гепаринизированную кровь смешивали в соотношении 1:10 с 10% желатином, инкубировали 40 минут при 370 С. Полученную лейковзвесь отмывали с помощью отмывающего раствора, затем производили подсчет абсолютного числа лейкоцитов в камере Горяева. Из расчёта цитоза на 1000 мононуклеаров в 1 мкл, добавляли 1 мл. раствора RPMI и 2,5 мкл зонда ДСМ. После 20 мин. экспозиции при 37° С проводили оценку характера и степень эмиссии флюоресцирующего зонда на проточном цитофлуориметре. Показано, что после нахождения клеток крови в условиях ферромагнитного экрана наблюдается достоверное снижение, по сравнению с контролем, заряда, как на митохондриальной, так и цитоплазматической мембранах.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях экранируемого пространства (минус поле) наблюдается снижение мембранного потенциала мононуклеаров крови человека, запускающего каскад внутриклеточных процессов, сопровождающихся повышенной наработкой активных кислородных метаболитов и изменением баланса между системами генерации и ингибиции активных форм кислорода.
Задачей следующего этапа было фиксация с помощью метода газо-разрядной визуализации особенностей фото-электронной эмиссии клеток костного мозга и
перитонеальных макрофагов крыс в условиях экспозиции в гипомагнитной камере [7].
Показано, что площадь фото-электронной эмиссии суспензии клеток костного мозга, находящихся в гипомагнитной среде в течение 1 часа, достоверно уменьшается в сравнении контролем (рис. 3).
Причём, данная зависимость имеет дозозависимый характер от времени экспозиции. В частности, при двухчасовой экспозиции различия между контрольным и опытным образцами становятся более значимыми (рис. 4).
При этом интенсивность газового разряда также достоверно уменьшается в образце после гипомагнитной экспозиции в сравнении с контролем, что отражено на графике (рис. 5). Площадь эмиссии и интенсивность свечения прямо связаны с наличием в суспензии мононуклеаров свободных электронновозбуждённых электронных плотностей, инициирующих стимулированный газовый разряд.
Аналогичные изменения наблюдались и в эксперименте с перитонеальными макрофагами, в частности при экспозиции в гипомагнитной камере уменьшалась площадь эмиссии (рис.6), а также снижалась её интенсивность (рис.7).
Обнаруженные различия позволяют предположить, что в условиях гипомагнитной депривации изменяется характер электронно-возбуждённых состояний в клеточной суспензии, в результате чего мы наблюдали достоверное снижение площади и интенсивности оптико-электронной эмиссии, напрямую зависящих от количественных характеристик фото-электронных процессов, возникающих при помещении образца в поле высокой напряжённости.
Учитывая важную роль мононуклеаров крови в регуляции широкого спектра защитных реакций организма [11], можно полагать, что выявленная нами закономерность открывает новые перспективы как в понимании молекулярно -клеточных механизмов магниточувствительности и магнитореактивности, так и
в построении дифференцированных методов их коррекции в условиях нормы и патологии.
V.J.Kulikov, O.V.Sorokin, S.K.Orumbaeva, E.A.Kozjaeva, A.V.Abramtsova
Novosibirsk State Medical University
Литература
1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах // Биофизика. - 1991. - Т. 29. - С. 211.
2. Гуляева Н.В. Перекисное окисление липидов в мозге при адаптации к стрессу: дис. ... д-ра биол. наук. - М. - 1989. - 450 с.
3. Казначеев В.П. Биоинформационная функция естественных электромагнитных полей. - Новосибирск: Наука, 1985. - 180 с.
4. Клебанов Г.И. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестн. РАМН. - 1999. - № 2. - С. 15-22.
5. Куликов В.Ю. Биологические антиоксидантные и адаптогенные свойства жирорастворимых витаминов // Международный симпозиум «Медицина и охрана здоровья». - Тюмень 1997. - С. 59-60.
6. Куликов В.Ю., Воронин А.Ю., Гайдуль К.В. и др. Биотропные свойства ослабленного геомагнитного поля. - Новосибирск, 2005. - 140 с.
7. Сорокин О.В., Коротков К.Г. Применение метода газоразрядной визуализации в изучении оптико-электронных свойств мононуклеаров мышей. // Тез. V Междунар. конгресса по биоэлектрографии. - СПб., 2006. - С. 68-71.
8. Fidelius R.K. The generation of oxygen radicals: A positive signal for lymphocyte activation // Cell. Immunol. - 1988. - Vol. 113. - P. 175-182.
9. Frank J., Biesalski H.K., Dominici S. et al. The vizualization of oxidative stress in tissue and isolated cells // Histol. Histopathol. - 2000. - Vol.15, № 1. - P. 173-184.
10. Korotkov K., Korotkin D. Concentration dependence of gas discharge around drops of inorganic electrolytes // J. of Applied Physics. - 2001. - Vol. 89, № 9. - Р. 4732-4737.
11. Rubanyi C.M. Vascular effects of oxygen - derived free radicals // Free Radic. Biol. Med. - 1988. - Vol. 4. - P. 107-121.
