CC BY
17
УДК: 528.287
ПРООКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ
BJERKANDERA ADUSTA BIMF-260 И PLEUROTUS OSTREATUS BIMF-247 ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Т.В. Корнейчик, А.Н. Капич
(Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова,
г. Минск, Республика Беларусь; e-mail: kornejchik@mail.ru)
Установлено, что культуральные фильтраты дереворазрушающих базидиомицетов белой гнили Bjerkandera adusta BIMF-260 и Pleurotus ostreatus BIMF-247, полученные при твердофазном культивировании, обладают прооксидантной активностью, которая выражается в их способности инициировать реакции перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, в частности линолевой кислоты. Прооксидантная активность, обнаруженная в культура-льных фильтратах грибов, зависит от наличия лигнинолитических ферментов, в первую очередь лигнинолитических пероксидаз.
Ключевые слова: дереворазрушающие базидиомицеты, прооксидантная активность, лиг-нинолитические ферменты.
Дереворазрушающие базидиальные грибы, вызывающие белую гниль древесины, обладают уникальной способностью к разрушению одного из наиболее устойчивых природных биополимеров — лигнина [1]. Разрушение лигнина происходит под воздействием лигнинолитических ферментов этих грибов, к которым относятся пероксидазы, лакка-зы, а также некоторые другие оксидоредуктазы [2, 3]. Данные ферменты характеризуются широкой субстратной специфичностью и способны катализировать не только разрушение лигнина, но и разложение широкого круга органических соединений, загрязняющих окружающую среду и обладающих токсическим действием. Это открывает возможность для использования дереворазрушающих базидиомицетов при биоремедиации [4]. Неспецифический характер действия энзиматических систем деревораз-рушающих базидиомицетов связывают с тем, что лигнинолитические ферменты этих грибов катализируют образование низкомолекулярных свободных радикалов, в том числе перекисных радикалов ли-пидов, которые обладают высокой реакционной способностью [5]. Ранее было показано, что культуральные жидкости некоторых базидиомицетов, полученные при глубинном и поверхностном культивировании, проявляют выраженные прооксидантные свойства, которые заключаются в их способности инициировать перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот, в частности линолевой кислоты [6, 7]. Целью данной работы было изучение про-оксидантных свойств дереворазрушающих базидиомицетов белой гнили Bjerkandera adusta BIMF-260 и Pleurotus ostreatus BIMF-247 в условиях твердофазного культивирования на лигноцеллюлозном субстрате — льняной костре.
Материалы и методы исследования
Штаммы грибов B. adusta BIMF-260 и P. ostreatus BIMF-247 хранятся в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (научная коллекция типовых и промышленно ценных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси). Штамм Gloeophyllum sepiarium 0155 был получен из коллекции культур базидиомицетов Ботанического института имени В.Л. Комарова (г. Санкт-Петербург, Россия). Твердофазное культивирование грибов проводили в стационарных условиях при 26° в колбах на лигноцеллюлозном субстрате (льняной костре), увлажненном глюкозопептонной средой (конечная влажность субстрата 80%) [8]. Инокуляцию субстрата осуществляли агаровыми дисками соответствующих культур грибов. Для получения культураль-ных фильтратов (КФ) субстрат, покрытый мицелием, отжимали в шприце, а собранные фильтраты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 6 мин.
Прооксидантную активность КФ дереворазру-шающих базидиомицетов определяли по скорости поглощения кислорода в реакции перекисного окисления линолевой кислоты с помощью оксиграфа (Hansatech, England) [6]. Активность марганец пе-роксидазы (МнП) измеряли спектрофотометриче-ски по скорости окисления Mn2+, а также по скорости окисления модельного фенольного соединения 2,6-диметоксифенола (ДМФ) [9]. Параллельно измеряли активность лакказы с ДМФ аналогичным способом, однако в этом случае в реакционную смесь не добавляли растворы MnSÜ4 и H2O2. Активность широкоспецифичной пероксидазы (ШСП) также измеряли в реакции с ДМФ, однако в этом случае в реакционную смесь не вносили MnSÜ4. За единицу активности ферментов принимали количество фер-
10 ВМУ, биология, № 2
мента, которое катализирует образование 1 мкмоль димера ДМФ в течение 1 мин.
Результаты и их обсуждение
На рис. 1 показаны кривые поглощения кислорода в реакциях перекисного окисления линоле-вой кислоты, инициированных КФ грибов, которые были получены после 28 дней твердофазного культивирования. Как видно, КФ B. adusta BIMF-260 и P. ostreatus BIMF-247 обладали прооксидантной активностью. Данная активность проявляется в том, что КФ инициируют реакции перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот, в частности линолевой кислоты, идущие с поглощением O2. Эти грибы являются типичными возбудителями белой гнили древесины и способны активно разрушать лигнин. КФ гриба Gloeophyllum sepiarium 0155, который является типичным грибом бурой гнили древесины и не способен разрушать лигнин, не проявлял прооксидантную активность в условиях твердофазного культивирования на льняной костре.
Прооксидантная активность культур деревораз-рушающих базидиомицетов может быть обусловлена лигнинолитическими ферментами, которые продуцируют грибы белой гнили, в частности МнП. Вывод о важности лигнинолитических пероксидаз для проявления прооксидантных свойств КФ грибов подтверждается результатами сопоставления проокси-дантной активности и активности лигнинолитиче-ских пероксидаз в динамике роста B. adusta BIMF-260 и P. ostreatus BIMF-247. Как видно из данных, представленных на рис. 2, изменения значений про-оксидантной активности и активности лигниноли-тических пероксидаз при твердофазном культивировании P. ostreatus BIMF-247 имели согласованный характер. Данные активности появлялись в КФ после 7 сут роста, достигали максимума на 21-е сут, после чего отмечалось их одновременное снижение. Изменения значений прооксидантной активности
Рис. 1. Поглощение кислорода в реакциях перекисного окисления линолевой кислоты, инициированного КФ дереворазруша-ющих базидиомицетов (Bjerkadera adusta BIMF-260 — B.a. BIMF-260, Gloeophyllum sepiarium 0155 — G.s. 0155, Pleurotus ostreatus BIMF-247 — P.o. BIMF-247). Стрелка указывает время добавления КФ
Рис. 2. Динамика прооксидантной активности (ПО) и активности лигнинолитических пероксидаз: марганец пероксидазы по скорости окисления Мп2+ (МнП Мп2+), марганец пероксидазы по скорости окисления ДМФ (МнП ДМФ) и широкоспецифичной пероксидазы (ШСП) при твердофазном культивировании P. ostreatus В1МР-247
и активности лигнинолитических пероксидаз в КФ B. adusta BIMF-260 были менее согласованы и носили более сложный характер (рис. 3). В первые 14 сут культивирования наблюдалось параллельное увеличение прооксидантной активности и активности лигнинолитических пероксидаз. Однако на 21-е сут культивирования отмечалась максимальная активность пероксидаз, в то время как проокси-дантная активность начала снижаться. По-видимому, это связано с тем, что в КФ данного гриба появлялись антиоксидантные соединения, ингибирую-щие инициацию перекисного окисления линолевой кислоты в тесте на прооксидантную активность.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что дереворазрушающие базидиомицеты белой гнили B. adusta BIMF-260 и P. ostreatus BIMF-247 способны проявлять в условиях твердофазного культивирования на лигноцел-
Рис. 3. Динамика прооксидантной активности (ПО) и активности лигнинолитических пероксидаз: марганец пероксидазы по скорости окисления Mn2+ (МнП Mn2+), марганец пероксидазы по скорости окисления ДМФ (МнП ДМФ) и широкоспецифичной пероксидазы (ШСП) при твердофазном культивировании B. adusta BIMF-260
люлозных субстратах прооксидантную активность. Данная активность зависит от наличия в КФ этих грибов лигнинолитических ферментов, в первую очередь лигнинолитических пероксидаз. Обнаружение прооксидантной активности в КФ дереворазруша-
ющих базидиомицетов при твердофазном культивировании позволяет рекомендовать их для дальнейших исследований в качестве потенциальных био-ремедиационных агентов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hatakka A. Biodegradation of lignin // Biopolymers. Vol. 1. Lignin, Humic substances and coal / Eds. M. Hofrichter, A. Steinbüchel. Weinheim: Wiley-VCH, 2001. P. 129-180.
2. Martinez A.T, Speranza M., Ruiz-Duenas F.J. et al. Biodegradation of lignocellulosics: microbial, chemical, and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin // Intern. Microbiol. 2005. Vol. 8. N 1. P. 195-204.
3. Hammel K. E., Cullen D. Role of fungal peroxidases in biological ligninolysis // Current opinion in plant biology. 2008. Vol. 11. N 3. P. 349-355.
4. Рабинович М.Л., Болобова A.B., Василъченко Л.Г. Разложение природных ароматических структур и ксенобиотиков грибами // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т. 40. № 1. С. 5-23.
5. Kapich A.N., Jensen K.A., Ham K.E. Peroxyl radicals are potential agents of lignin biodegradation // FEBS Letters. 1999. Vol. 461. P. 115-119.
6. Kapich A.N., Prior B.A., Lundell T., Hatakka A. A rapid method to quantify pro-oxidant activity in cultures of wood-decaying white-rot fungi // J. of Microbiol. Met. 2005. N 61. P. 261-271.
7. Kapich A.N., Steffen K.T., Hofrichter M., Hatakka A. Involvement of lipid peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla // Bio-chem. and Biophys. Res. Commun. Vol. 330. N 2. P. 371—377.
8. Капич A.H. Биосинтетическая активность дерево-разрушающих базидиомицетов при глубинном культивировании // Микол. и фитопатол. 1990. Т. 24. № 5. С. 377—384.
9. Wariishi H., Valli K., Gold M.H. Manganese (II) oxidation by manganese peroxidase from the basidiomycete Pha-nerochaete chrysosporium. Kinetic mechanism and role of chelators // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 23688—23695.
Поступила в редакцию 02.06.10
PROOXIDANT ACTIVITY OF FUNGI BJERKANDERA ADUSTA BIMF-260
AND PLEUROTUS OSTREATUS BIMF-247 IN SOLID-STATE CULTURE
T.V. Korneichik, A.N. Kapich
Wood-decaying white rot basidiomycetes Bjerkandera adusta BIMF-260 and Pleurotus ost-reatus BIMF-247 were found to show prooxidant activity in solid-state culture on lignocellulose substrate — flax straw. The prooxidant activity in the culture filtrates of the wood-decaying fungi depends on the presence of ligninolytic enzymes and first of all peroxidases.
Key words: wood-decaying basidiomycetes, prooxidant activity, ligninolytic enzymes.
Сведения об авторах
Корнейчик Татьяна Валерьевна — аспирантка, кафедра иммунологии факультета экологической медицины Международного государственного экологического университета имени А.Д. Сахарова, г. Минск, Республика Беларусь. E-mail: kornejchik@mail.ru
Капич Александр Николаевич — проф. кафедры иммунологии факультета экологической медицины Международного государственного экологического университета имени А.Д. Сахарова, г. Минск, Республика Беларусь. E-mail: kapich@wisc.edu
11 BMУ, биология, №2
