CC BY
33УДК 591.463.1; 575.174.015.3; 616.69 - 008.6 - 07; 614.7; 612.616.31
ПРОЛИФЕРАЦИЯ И АПОПТОЗ МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК В СПЕРМАТОГЕННОМ ЭПИТЕЛИИ В НОРМЕ И ПРИ НЕОБСТРУКТИВНОЙ
АЗООСПЕРМИИ
Г. А. Демяшкин
Научный клинический центр ОАО «РЖД»
Патологоанатомическое отделение с цитологической лабораторией
Кафедра морфологии
Медицинский университет «Реавиз»
Адрес переписки: г. Москва, ул. Краснобогатырская д.2, кор.2.
E-mail: dr.dga@mail.ru
РЕЗЮМЕ
Изучена количественная картина иммунореактивности белков ki-67, p-53, Bcl-2, caspasa-9 в тканях яичка человека в норме и при идиопатической азооспермии. В контрольной группе экспрессия ki-67 в ядрах сперматогониев составила 42.0±0.34% (р<0.05), в то время как маркёр апоптоза caspasa-9 - 25.2±0.44 (р<0.05). Показатели экспрессии ki-67 (12.0±0.34% (р<0.05)), р-53 (40.0±0.44% (р<0.05)), Bcl-2 (1.0±0.1% (р<0.05)) и индекса апоптоза у мужчин с идиопатической азооспермией (13.0±0.22% (р<0.05)) свидетельствуют о преобладании процессов гибели половых клеток над их пролиферацией. Снижение количества иммунореактивных сперматогониев не соответствует уровню сывороточного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Эти данные показывают, что снижение мейотической активности сперматогониев у мужчин, страдающих бесплодием, не связано с уровнем сывороточного ФСГ.
PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF MALE GERM CELLS IN THE SEMINIFEROUS EPITHELIUM IN NORMAL AND NONOBSTRUCTIVE AZOOSPERMIA
G. A. Demyashkin.
SUMMARY
The quantitative picture of immunoreactive protein ki-67, p-53, Bcl-2, caspasa-9 in the tissues of the human testis in normal and idiopathic azoospermia. In the control group, ki-67 expression in spermatogonia nuclei was 42.0 ± 0.34% (p <0.05), while apoptosis marker caspasa-9 - 25.2 ± 0.44 (p <0.05). ki-67 expression figures (12.0 ± 0.34% (p <0.05)), p-53 (40.0 ± 0.44% (p <0.05)) of Bcl-2 (1.0 ± 0.1% (p <0.05)) and apoptosis index in men with idiopathic azoospermia (13.0 ± 0.22% (p <0.05)) indicate a predominance of death processes of gametes over their proliferation. Reducing the amount of immunoreactive spermatogonia does not correspond to the level of serum follicle stimulating hormone (FSH). These data show that the reduction of spermatogonia meiotic activity in infertile men is not associated with serum FSH levels.
Ключевые слова: сперматогенез, иммуногистохимия, ki-67, p-53, Bcl-2,caspasa-9, пролиферация сперматогониев, апоптоз.
Введение. Проведенный нами анализ научных работ по проблеме мужского бесплодия показал малое их количество, и что они выполнены, в основном, на экспериментальных животных. «Естественно, опубликованные данные следует учитывать, но клинические исследования механизмов сперматогенеза более ценны с точки зрения их возможного практического использования».
Оценивая роль факторов, учитываемых при постановке диагноза идиопатического бесплодия, следует добавить целую группу причин, которые также влияют на развитие данного заболевания. Более того, целесообразно отметить, что число их увеличивается практически ежедневно (как и заболеваний с ними связанных), что обусловлено развитием технологического процесса технологическому развитию стран.
К числу таких факторов относятся: возрастающее число рождения недоношенных детей и их дальнейшее доращивание, обилие перенесенных болезней, прежде всего, инфекционных, сопровождающихся применением фармакологических препаратов, особенно, химического производства; рентгенологические и ультразвуковые исследования в ЛПУ; проживание в экологически неблагоприятных условиях.
Длительный исторический эволюционный этап развития человечества в этиологии развития заболеваний ключевая роль принадлежала алиментарному фактору.
Наконец, к числу новых патогенных факторов следует отнести радиационные поражения (мирный атом), которые возникают после аварий на АЭС и влияют на генетический фонд миллионов людей. Радиация же всегда в первую очередь угрожает кроветвор-
ным и половым клеткам (их стволовости), обладающим интенсивной пролиферацией.
Все перечисленные факторы влияют на весь организм опосредованно, и, возможно, на сперматогенез.
Нет также единогласия в отношении этиологии, патогенеза, диагностики и лечения мужского бесплодия [2, 4].
По данным ВОЗ (Руководство ВОЗ, 5-ое изд., 2010 г.) проблема мужского бесплодия и нарушение сперматогенеза обусловлены высокой частотой заболеваний яичек, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном возрасте дисфункциональных состояний (и др.) [14]. По данным Брагиной Е.Е., Абдумаликова Р.А. (2002) в г. Москве подвижными сперматозоидами, согласно нормативам ВОЗ (WHO, 1992, 2000), обладают около 10% из 1000 обследованных мужчин [5]. При этом около 30% всех случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, то есть бесплодию с невыясненной этиологией.
В последние десятилетия зафиксирован рост числа заболеваний репродуктивной системы как у женщин фертильно-го возраста [15], так и у мужчин [3, 10, 12].
Целесообразно выделить два основных направления в изучении мужского иди-опатического бесплодия, которые могут иметь как этапный, так и схожий характер.
Тем не менее, без осознания всех закономерностей течения нормального сперматогенеза и биологической роли гамет, а именно, пролиферации, дифференцировки и апоптоза, невозможно понимание патогенеза мужского бесплодия, а также постановки определенных целей и задач и поиска путей лечения данного заболевания.
Так, по мнению Райциной С.С., Кагана С.А., Астраханцева А.Ф. и др. совокупность нейроэндокринных и локальных механизмов составляет репродуктивную стратегию, направленную на защиту генома развивающихся половых клеток [1, 8, 13, 32].
К первому направлению изучения мужского бесплодия следует отнести центральный механизм регуляции сперматогенеза.
Второе направление локальной регуляции включает в себя два пути. Первый можно обозначить как сперматогенный, а второй - как опосредованный экстрасперматогенный путь.
В основе сперматогенного пути изучения патогенеза бесплодия лежат сами половые клетки. При этом, в качестве основных характеристик гамет следует учитывать их морфологию, белково-гормональную регуляцию (ауто- и паракринные функции) и наследственно-генетические риски.
Изменения количества и строения половых клеток, несомненно, является одним их критерием оценки сперматогенеза.
В научных работах Волкова О.В. и Боровая Т.Г. отметили, что мужские половые железы относятся к динамичным системам организма, характеризующиеся не только сложностью происходящих в них морфогенетических преобразований [7], но также подчёркивается многообразие механизмов регуляций их функций. Сперматогенез протекает под контролем специфических генов развивающихся гамет и регулируется совокупностью гормонов, цито-кинов и факторов роста [6, 9, 18]. До 20% случаев нарушения мужской репродуктивной системы связаны с числовыми или структурными аномалиями хромосом (Курило Л.Ф. и соавт., 2000, 1998, 1997) [11]. Однако, и здесь, не совсем понятен момент появления хромосомных аберраций: то ли это происходит после образования зиготы, либо в сперматозоидах отца.
К экстрасперматогенному пути развития бесплодия можно отнести морфо-функциональные нарушения со стороны клеток Сертоли и Лейдига, миоидных клеток, а также нейроваскулярного фактора.
В ответ на внешние регуляторные сигналы развивающиеся половые клетки экспрес-сируют биологически активные вещества (белки клеточной пролиферации и апоп-тоза, факторы роста и дифференцировки и др.), которые являются финальным звеном регуляции сперматогенеза, опосредующим весь каскад воздействий на сперматогенез.
Большое значение в настоящее время придаётся показателям баланса между пролифера-тивной активностью мужских половых клеток и апоптозом. Наиболее информативные маркёры (белками) пролиферации и апоптоза клеток (в онтогенезе): р53, ю-67, Вс1-2, каспазы [16, 31, 33].
Клеточная пролиферация является одним из факторов, обеспечивающих сперматогенез, которая проходит непрерывно на всех его стадиях. Белок Ы-67 обнаружен во всех фазах митоза (С1, 8, С2), поэтому может быть использован для изучения развития половых клеток в норме и при азооспермии. Контроль нормальной пролиферации клеток сперматогенеза имеет принципиальное значение, предполагая, что ключевая роль принадлежит высоко скоординированным механизмам между клетками Сертоли и половыми клетками, вступающими в митоз, а затем и митоз.
Каспазы представляют собой семейство белков, необходимые в апоптических механизмах, запускающих каскад биохимических реакций, приводящих к гибели клеток. Инициаторами
внешнего и внутреннего пути апоптоза выступают соответственно каспазы-8 и -9, активация которых приводит к индуцированию каспазы-3 («точка невозврата апоптоза»). В течение сперматогенеза, апоптоз обеспечивает подержание определённого количества половых клеток и, соответственно, нормальной спермы [22]. Во время этого процесса, повреждённые половые клетки и/или их чрезмерное количество фагоцитируют клетки Сертоли (реутилизация) через Fas/ FasL-систему [19, 28]. Тем не менее, темпы апоп-тоза половых клеток, а также уровень активации апоптотических механизмов, участвующих в развитии обструктивной и необструктивной азооспермии являются до сих пор мало изучены.
Целью настоящего исследования, используя иммуногистохимический метод, было определить, показатели пролиферации и апопто-за половых и соматических клеток при необ-структивной азооспермии. Кроме того, оценить возможную роль клеток Сертоли в активации апоптотических процессов гамет при Сертоли-клеточном синдроме и его вариантах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Протокол настоящего исследования был одобрен комитетом по биоэтике в Российском национальном исследовательском медицинском университете им. Н.И. Пирогова (РНИМУ, бывший РГМУ). Исследование проводилось на кафедре гистологии и эмбриологии педиатрического факультета РГМУ и в Научном клиническом центре ОАО «РЖД», Москва, Россия.
Пациенты и материал. Научная работа проводилась в два этапа: на первом (в период с октября 2006 по март 2010 года) - определяли концепцию исследования и отрабатывали иммуногистохимический метод на лабораторных животных. Затем, с октября 2014 по ноябрь 2015 года, обследовали мужчин (n=50), обратившихся на приём к урологам-андро-логам с проблемами фертильности (возраст 22 - 35 лет). Из дальнейшего исследования были исключены 20 пациентов: по отягощён-ному лекарственному анамнезу (n=4; андроге-ны или анти-эстрогены), гипогонадотропный гипогонадизм (n= 6), системное заболевание (n=9), или хромосомные транслокации (n=1).
В качестве материала для исследования в работе использовались ткани яичек здоровых (контрольная группа) мужчин и биопсийный материал у лиц с патологией - идиопатическое бесплодие (клинически обоснованная азооспермия).
Работа выполнена в двух группах (возрастная выборка по Г. Г. Автандилову): I. - группа с условным контролем физиологического течения сперматогенеза, в семейном анамнезе - одно и более
деторождений: А - мужчины 22-35 лет (28.5±6.5, n=10); Б. - мужчины 64-75 лет (69.5±5.5, n=10); II. - мужчины 22 - 35 лет с идиопатической азооспермией (28.5±6.5, n=30), бесплодие в браке более двух лет. Все пациенты подписали протокол стандартного информированного согласия. Исследования были одобрены локальным этическим комитетом, а также соответствуют Хельсинкской декларации (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principies for Medical Research Involving Human Subjects, 64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013).
Объект исследования: во всех группах
- правые семенники (яички) - биоптаты.
Гормональный анализ мужчин, страдающих бесплодием.
За сутки до исследования исключались физическая нагрузка и приём алкоголя. Анализ крови забирался строго натощак между 700 и 1000 часами из локтевой вены (10,0 мл). Сыворотку крови до использования хранили при -20°C. Количественное содержание фоллику-лостимулирующего гормона (ФСГ, FSH), люте-инизирующего гормона (ЛГ, LH), В-ингибина (Inhibin-B) и свободного тестостерона (F-Testo) определяли в образцах сыворотки крови мужчин методом иммуноферментного анализа (ELISA). Определение концентрации ЛГ, ФСГ производили на автоматическом имму-нохимическом анализаторе Beckman Coulter Access-2 (США) с использованием оригинальных реактивов Beckman Coulter, В-ингибина и свободного тестостерона - наборами фирмы LifeSpan BioSciences (США). Чувствительность метода, коэффициент вариации (CV) и диапазон определения (DR) составили: для ЛГ
- 0,2 мЕд/мл, CV <10 %, DR - 0.2 - 250 мЕд/ мл; для ФСГ - 0,2 мЕд/мл, CV <10 %, DR - 0.2
- 200 мЕд/мл; для свободного тестостерона -0,188 нг/мл, CV <10 %, DR - 0.313 - 20 нг/мл; для ингибина-В - 5,5 пг/мл, CV <10 %, DR -15.63 - 1000 пг/мл. У всех исследуемых мужчин уровни гормонов ЛГ (10.22±0.4 мЕд/мл) и тестостерона (12.7±2.1 нмоль/мл) в сыворотке крови в пределах возрастной физиологической нормы; количество ФСГ - 26.58±0.37 мЕд/ мл (норма для мужчин 20 - 50 лет составляет 2.0 - 11.0 мЕд/мл); содержание ингибина-В
- 94.3±2.2 пг/мл (понижено в 1,2 раза).
Спермограмма. Значения эякулята оценивались согласно протоколу Всемирной организации здравоохранения («WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen», 5th edition, Geneva, 2010). Семенную жидкость каждый пациент сдавал дважды, с интервалом в 22 дня (половое воздержание 3 - 5 дней до сдачи). При этом учитывали ре-
зультаты близкие к дате сдачи крови на гормоны. У всех (30-ти) исследуемых, по заключению спермограммы - идиопатическая необструк-тивная азооспермия (табл. 1). Таким образом,
была сформирована группа мужчин, учитывая следующие критерии: азооспермия и ФСГ <11 мЕд/мл. Также рассматривалась ассоциация показателей ФСГ и ингибина-В в этой группе.
Таблица 1
Результаты спермограммы во 11-й группе
Показатель Значение
Объем эякулята, мл < 1,5
pH 7,2
Общее количество сперматозоидов, млн не обнаружены
Концентрация сперматозоидов, млн в 1 мл -
Общая подвижность сперматозоидов,% -
Сперматозоидов с прогрессивным движением, % -
Жизнеспособность, % -
Концентрация лейкоцитов <1 млн/мл
Антиспермальные антитела (для сперматозоидов, ассоциированных с АСАТ, выявленных методами MAR, либо ImunnoBeat) исследование не проводилось
Лабораторная цитогенетическая и моле-кулярно-генетическая диагностика (исследование кариотипа, анализ крови на наличие микроделеций Л7Б локуса У-хромосомы).
Кариотип: 46, Х У ;
У-ми кроделеци и отсутствуют.
Физикальные данные. Все пациенты, страдающие бесплодием, являются молодыми людьми в возрасте 22 - 35-ти лет; соматически здоровы, без вредных привычек; инфекционные заболевания, влияющие на сперматогенез (в том числе, эпидемический паротит), а также врожденные аномалии развития яичек у пациентов отсутствовали. Обследованные молодые люди имели нормальное либидо и были сексуально активны. Аллергический и наследственный анамнезы не отягощены.
Физическая экспертиза показала: оволосение на лобке по мужскому типу; мужской голос взрослого; высота 175 - 182 см и вес 68 - 84 кг. Локальное исследование (объём оценивали при помощи орхидометра Prader): оба яичка в мошонке, обычных размеров (средний объем органа: справа - 18 мм3, слева - 20 мм3), мягкие по консистенции и безболезненные; варикоце-ле не обнаружено; семейный анамнез по поводу варикозного расширения вен не отягощён.
Тестикулярная оценка (биопсия).
Биопсия яичка была выполнена с целью выявления причины азооспермии, определения степени поражения сперматогенеза и исключения обструкции выводных семенных протоков. Критериями для биопсии яичка были: азооспермия, сопровождающаяся нормальным
или повышенным уровнем ФСГ или количество сперматозоидов <5 млн/мл эякулята. Открытая биопсия яичка проводилась в амбулаторных условиях с соблюдением всех правил асептики. Биоптаты оценивали с использованием метода, описанного S. Johnsen [20], с изменениями, внесенными J. Aafjes и соавт. [21]. Поперечные срезы семенных канальцев были оценены со счетом от 1 до 10, на основе наиболее продвинутых стадий сперматогенеза. Средний балл рассчитывали в 10-ти полях зрения микроскопа, при увеличении х400. Шкала S. Johnsen (MJS): 10 баллов - сперматогенез полностью сохранён; 9 - незначительные нарушения сперматогенеза - дезорганизация сперматогенного эпителия, много поздних сперматид; 8 - меньше пяти сперматозоидов в канальце, немного поздних сперматид; 7 - отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, много ранних сперматид; 6 - отсутствие сперматозоидов и поздних сперматид, мало ранних сперматид; 5 - отсутствие сперматозоидов и сперматид, много сперматоцитов; 4 -отсутствие сперматозоидов и сперматид, мало сперматоцитов; 3 - только сперматогонии; 2 -отсутствие половых клеток, только клетки Сер-толи; 1 - отсутствие элементов сперматогенного эпителия (тубулярная атрофия). Ранее было показано, что спонтанная беременность возможна при оценке биоптата не ниже 8 баллов [21].
Морфологическое исследование
Фрагменты ткани и биоптаты яичек фиксировали в забуференном нейтральном 10% формалине (рН=7,2; от 5 до 24 часов); дегидратировали в батарее спиртов восходящей кон-
центрации, заливали в парафин. Срезы тканей яичка, толщиной 4 - 6 х10-6м (4 цш), помещали на обычные, а для ИГХ - на специальные адгезивные предметные стёкла Super Frost Plus (хх), депарафинировали согласно принятой стандартной методике. Впоследствии, срезы (=5 цш) либо окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для гистологического исследования или использовали для иммуногистохимии (ИГХ). Кроме того, препараты окрашивали пикрофук-сином по методам Van Gieson и Mallori для выявления компонентов соединительной ткани и по Weigert для оценки эластических структур интерстициальной ткани и стенки сосудов.
Иммуногистохимический метод (ИГХ). После депарафинизации и повторной гидратации парафиновых срезов проводили ИГХ-исследование.
Для восстановления антигенных свойств ткани яичка после фиксации в формалине проводили тепловую индукцию эпитопного (ангтигенного) восстановления (HIER - heat induction of epitope retrieval). Для этого, стёкла нагревали в цитратном буфере (рН=6,0) в автоклаве (t°+121°C; время - 8 минут) с симметричным их расположением в кювете.
В качестве первичных использовали мышиные моноклональные антитела к ki-67 - маркёр пролиферации клеток, которые вошли в клеточный цикл; к р-53 - ядерный антиген - показатель готовности к апоптозу; к Bcl-2 - цитоплазмати-ческий антиапоптотический антиген; к caspasa-9 - ядерный апоптотический антиген. Дистрибьютором всех используемых первичных и вторичных антител была NovocastraTM компании «Leica Biosystems Newcastle Ltd», United Kingdom.
Для каждого маркёра выполнялись контрольные исследования с целью исключения псевдопозитивных и псевдонегативных результатов. Титр антител подбирали отдельно для каждого маркёра с использованием раствора antibody diluents. Разведение 1:100; срезов на стекле - по два.
Вторичные антитела, которые содержали большое количество молекул пероксидазы хрена, наносили на срезы и инкубировали во влажных камерах на протяжении 30' с промыванием в растворе Tris-buffer между каждым этапом на протяжении 10'.
После аппликации каждого реактива стекла со срезами отмывали в 0,1 М растворе фосфатного буфера в сосуде с мешалкой. Для детекции и визуализации реакции добавляли на каждый срез 1 - 3 капли DAB Substrate Chromogen. Инкубировали от 30 секунд до 20' под контролем микроскопа до появления темно-коричневого окрашивания специфических структур в зависимости от маркёра (ядерная, цитоплазматическая, мембранная реакция). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Mayer, подвергали деградации; срезы заключали в «Aquatex».
Оценка иммуногистохимических реакций базировалась на интенсивности окрашивания и разделении иммунопозитивных (положительных) клеток согласно рекомендациям D.J. Dabbs «Diagnostic immunohistochemistry» (3rd Edition, 2010) в модификации.
Степень экспрессии оценивали визуально в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза (сперматогонии, первичные сперматоциты, вторичные сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды). Также определяли степень экспрессии в соматических и эндокринных клетках яичка (табл. 2).
Шкала интенсивности окрашивания (качественная оценка)
Таблица 2
Знаковая система оценки (+/ -)
Комментарий
Цветная шкала детекции :
«+»
«++»
нет экспрессии
Слабая экспрессия
Умеренная экспрессия
«+++»
Выраженная экспрессия
Комментарий. Цветовая гамма составлена по степени насыщенности и соотношения чёрного или белого цветов и адаптирована для оценки интенсивности экспрессии маркёров в структурах (клетках).
Индекс экспрессии (ИЭ) оценивали в 100 клетках в 10 полях зрения светового микроскопа при увеличении в 400 раз. Его рассчитывали по формуле:
ИЭ = S P(i)xi, где
i - интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (нулевая, слабая, умеренная и максимальная); P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью; 100 - количество клеток.
Индекс пролиферации, готовности к апоп-тозу, индекс апоптоза, антиапоптотический индекс определяли путём подсчета количества ki-67, каспаза-9, p53 и Bcl-2-позитивных клеток на 100 клеток соответствующих структур (половые клетки, клетки Сертоли, клетки Лейдига) во всех группах при увеличении x400 с последующим вычислением показателя в процентах.
Статистический анализ.
Полученные в результате подсчёта данные статистически обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 7.5 for Windows statistical software package. При этом определяли вариационные ряды, среднюю арифметическую, среднеквадратическое отклонения, среднюю ошибку и вероятность различия. Затем оценивали соответствие/ несоответствие полученных результатов нормальному распределению с применением критерия Колмагорова-Смир-нова. Если цифровой массив соответствовал нормальному распределению данных, то для сравнения двух выборок применяли параметрический t-критерий Student (по W. S. Gosset) при независимых результатах, с уровнем значимости p<0.05. При отсутствии нормального распределения данных использовали непараметрический критерий F. Wilcoxon (Statistical
Methods for Research Workers) с уровнем значимости p<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гистология яичек мужчин II группы (n=30). У 25-ти мужчин в биоптатах визуализируется морфологическая картина субтотальной аплазии мужских половых клеток (GCA), или фокального Сертоли-клеточного синдрома; оценка сперматогенеза по шкале Johnson в модификации De Kretser и Holstein - 3 бала. У 4-х мужчин в семенных канальцах отмечаются признаки Сертоли-клеточного синдрома (MJS = 2 балла) и у одного пациента обнаружена тубулярная атрофия канальцев (MJS = 1 балл). Кроме того, во всех исследуемых случаях - выраженная гиперплазия клеток Лейдига.
Данные иммуногистохимического исследования.
Во всех исследуемых группах отмечается им-муномечение каспазы-9 в цитоплазме клеток Сертоли и в ядрах и цитоплазме половых клеток. Проведенный полуколичественный анализ уровня апоптоза в контрольной группе у мужчин 22 - 35 лет показал стабильно умеренно выраженную («++») экспрессию маркёра апоптоза caspasa-9 в сперматогониях, в единичных сперматоцитах и сперматидах, а также в клетках Лейдига («+») (рис. 1).
Одновременно с этим определялась выраженная («+++») экспрессия интрануклеарной реакции с ki-67 в сперматогониях на II-III этапах сперматогенеза и в ядрах некоторых первичных («+») и вторичных («+») сперматоцитов, а также в единичных клетках Лейдига («+») (табл. 3) и (рис. 2, 3).
Рис. 1. Яичко (группа 1.Б.), положительная интрануклеарная реакция в ядрах некоторых половых клеток; ИГХ метод с caspasa-9, докрашивание гематоксилином, х400. мерный отрезок - 10 мкм
Сравнительная качественная оценка про- валируют над последними (рис. 1, 2, 3). При цессов пролиферации и апоптоза демонстри- этом эти значения более выражены в клетках рует, что в контрольной группе первые пре- Лейдига по сравнению с клетками Сертоли.
Таблица 3
Экспрессия И-67 в половых клетках в нормальном сперматогенезе и при азооспермии
Клетки НОРМАЛЬНЫЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗ (%) АЗООСПЕРМИЯ (%)
22 - 35 лет 61 - 74 года
Сперматогонии 42.0±0.34 34.1±0.6 * 12,0±0.1 **
Примечания. * - статистически достоверные различия (при p<0.05) между I.A. 1.Б. контрольными подгруппами. ** - статистически достоверные различия (при p<0.05) между контрольной группой I.A. и группой лиц, страдающих бесплодием.
Рис. 2. Яичко (группа I.A.), интрануклеарная реакция с ki-67 высокой интенсивности в отдельных клетках сперматогенного эпителия (ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином, х400). Сперматогония (О), сперматоцит I (•), сперматоцит II (•); клетка Сертоли (ядро) (Д); клетка
Лейдига мерный отрезок - 10 мкм
Рис. 3. Яичко (группа I.A.), интрануклеарная реакция с ki-67 высокой интенсивности в отдельных клетках сперматогенного эпителия (ИГХ метод, дополнительное окрашивание гематоксилином, х1000). Обозначения см. рис. 1. ' * мерный отрезок - 10 мкм
Экспрессия белка готовности к апоптозу р-53 в контрольной 1.А группе в сперматогониях («++»), в первичных сперматоцитах («+») и слабая во вторичных сперматоцитах («±»). Тогда как маркер антиапоптотической активности (Вс1-2) демонстрирует выраженное иммуномечение в вторичных сперматоцитах («+++») и сперма-тидах («++»), а также обнаружена в единичных сперматогониях («±») и первичных спермато-цитах («+»). Кроме того выявлена экспрессия Вс1-2 в цитоплазме некоторых клеток Лейдига, расположенных ближе к семенным канальцам.
При изучении пролиферации в семенных извитых канальцах у мужчин, страдающих азооспермией, отмечалось снижение экспрессии маркёра к1-67 как в сперматогониях («++»), так и в клетках Лейдига («+») в виде ослабленного интрануклеарного окрашивания по сравнению с контрольной группой (рис. 4). В то же время при исследовании процесса апоптоза также отмечалось снижение экспрессии caspasa-9 («±») в единичных сперматогониях в зависимости от фенотипа сперматогенного эпителия.
Рис. 4. Яичко (группа II), умеренная иммунопозитивная интрануклеарная реакция с Ы-67 в единичных сперматогониях; ИГХ метод, докрашивание гематоксилином, х1000.
* * мерный отрезок - 10 мкм
При сравнении контрольных подгрупп у лиц пожилого возраста визуализируется следующая пролиферативно-апоптотическая активность: белки Ы-67, р-53 в единичных сперматогониях («+»); Вс1-2 помимо мечения в единичных сперматогониях («+»), обнаружен во вторичных сперматогониях («++»); caspasa-9 визуализируется в сперматогониях («++») и первичных сперматоцитах («+») (табл. 4, 5).
Уровень экспрессии р-53 распределяется в структурах извитого семенного канальца следующим образом: в половине (50%) клеток Сертоли из общего их числа, среди них - среди 25% зрелых и 10% незрелых, а также в половых клетках («++»). В клетках Лейди-га, а также в миоидных клетках экспрессии р-53 не обнаружено («-»). Экспрессии цито-плазматического белка Вс1-2 в половых клетках не определяется. В половине от общего числа клеток Сертоли экспрессия белка распределилась следующим образом: среди 25% зрелых («+») и 10% незрелых («+») клетках.
Статистические данные.
Индекс пролиферации (к1-67) половых клеток указывает на выраженную митотиче-скую активность сперматогониев у мужчин 22 - 35 лет (42.0±0.34) в контрольной группе
и снижение данного показателя на 3,5% при азооспермии (12,0±0.1) (табл 3) и (рис. 5).
Индекс готовности к апоптозу (p-53) у сперматогониев в контрольной I.A. группе выше чему у сперматоцитов первого порядка в 2.0 раза и в 3.9 раза у сперматоцитов второго порядка. При этом индекс экспрессия р53 в сперматогониях при азооспермии в 2.6 раза выше, чем в контроле у мужчин 22 - 35 лет (табл. 4) и (рис. 6, 7).
Антиапоптотический индекс (Bcl-2) половых клеток во всех группах отображён в табл. 5 и на рис. 8, а распределение его среди гамет в контрольной группе 22 - 35 лет на рис. 9. Анализ экспрессии Bcl-2 показывает, что антиапоптотическая активность превалирует в половых клетках у мужчин 22 - 35 лет (43.2±0.44), снижается в пожилом возрасте (14.1±0) и практически исчезает при азооспермии (1,0±0.1). При этом наибольшей антиапоптотической активностью обладают спермато-циты первого порядка (46.0±0.55) - клетки, вступившие в редукционное деление мейоза.
Показатели индекса апоптоза (каспаза-9) половых клеток во всех группах приведены в табл. 6 на рис. 10, а распределение его сре-
ди гамет в контрольной группе 22 - 35 лет на рис. 11. Показатели запрограммированной гибели (апоптоза) половых клеток в контрольных подгруппах находятся примерно на од-
ном уровне (25.2±0.44 и 18.1±0.33) и снижены при азооспермии (13,0±0.22). Среди половых клеток наибольшей апоптотической активностью обладают сперматогонии (39.5±0.33).
■ rpy^ßgjii ■ Группа 1Б ■ Группа II
Рис. 5. Экспрессия ki-67 в сперматогониях
Рис. 6. Экспрессия р53 в половых клетках
Таблица 4
Экспрессия p53 в половых клетках в нормальном сперматогенезе и при азооспермии
Клетки НОРМАЛЬНЫЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗ (%) АЗООСПЕРМИЯ (%)
22 - 35 лет 61 - 74 года
Половые клетки 17.2±0.33 8.1±0.22 * 40,0±0.44 **
Сперматогонии 57.2±0.66 - нет
Сперматоциты I 28.5±0.5 - нет
Сперматоциты II 14.5±0.33 - нет
Примечания. * - статистически достоверные различия (при p<0.05) между I.A. ГБ. контрольными подгруппами. ** - статистически достоверные различия (при p<0.05) между контрольной группой I.A. и группой лиц, страдающих бесплодием.
Рис. 7. Уровень экспрессии p53 в половых клетках в IA группе
Таблица 5
Экспрессия Bcl-2 в половых клетках в нормальном сперматогенезе и при азооспермии
Клетки НОРМАЛЬНЫЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗ (%) АЗООСПЕРМИЯ (%)
22 - 35 лет 61 - 74 года
Половые клетки 43.2±0.44 14.1±0.2 * 1,0±0.1 **
Сперматогонии 7.5±0.3 нет
Сперматоциты I 46.0±0.55 нет
Сперматоциты II 15.5±0.4 нет
Сперматиды 31.5±0.22 нет
Примечания. * - статистически достоверные различия (при p<0.05) между I.A. 1.Б. контрольными подгруппами. ** - статистически достоверные различия (при p<0.05) между контрольной группой I.A. и группой лиц, страдающих бесплодием.
Экспрессия Bei 2 в половых клетках
50% 40% 30% 20% 10% 0%
^_
0
Группа IA ■ Группа |Б Ж Группа II
Рис. 8. Экспрессия Bcl-2 в половых клетках
50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%
Уровень экспрессии Bel 2 в половых клетках в IА группе
15,50%
йнм
I Сперматогонии ■ Сперматоциты 1 порядка
1 Сперматоциты 2 порядка ■ Сперматады
Рис. 9. Уровень экспрессии Bcl-2 в половых клетках в IA группе
Показатели индекса апоптоза (каспаза -9) половых клеток во всех группах приведены в табл.6, а распределение его среди гамет в контрольной группе 22 - 35 лет на рис. 10. Показатели запрограммированной гибели (апоптоза) половых кле-
ток в контрольных подгруппах находятся примерно на одном уровне (25.2±0.44 и 18.1±0.33) и снижены при азооспермии (13,0±0.22). Среди половых клеток наибольшей апоптотической активностью обладают сперматогонии (39.5±0.33).
Таблица 6
Экспрессия каспазы 9 в половых клетках в нормальном сперматогенезе и при азооспермии
Клетки НОРМАЛЬНЫЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗ (%) АЗООСПЕРМИЯ (%)
22 - 35 лет 61 - 74 года
Половые клетки 25.2±0.44 18.1±0.33 * 13,0±0.22 **
Сперматогонии 39.5±0.33 нет
Сперматоциты I 22.0±0.3 нет
Сперматоциты II 17.1±0.22 нет
Сперматиды 22.0±0.44 нет
Примечания. * - статистически достоверные различия (при p<0.05) между I.A. ГБ. контрольными подгруппами. ** - статистически достоверные различия (при p<0.05) между контрольной группой I.A. и группой лиц, страдающих бесплодием.
Рис. 10. Экспрессия Caspase-9 в половых клетках 29
ОБСУЖДЕНИЕ
Нормальное развитие организма обеспечивается балансом между клеточной пролиферацией и апоптозом клеток. Тем не менее, при действии определённых раздражителей, этот баланс нарушается, запуская патогенез ряда пролифератив-ных и дегенеративных заболеваний [22, 27, 30, 33].
Митотическая активность клеток может быть оценена различными методами (подсчёт мито-тических фигур, применение меченых нуклео-тидов, например, тимидина). Однако, для изучения S-фазы половых клеток, особенно в биоп-сийном материале, а также по этическим соображениям, целесообразным по-прежнему остаётся использование иммуногистохимического метода с антителами ki-67 (Gerdes et al., 1984).
Пролиферативно-ассоциированный антиген ki-67 определяется в ядрах клеток во время поздней G1-, S-, G2- и M фазах с максимальными значениями в G2- и ранней М фазах (Gerdes et al., 1984; Sasaki et al., 1987) [30]. Его период биологического полураспада в среднем составляет 1 час (Duchrow et al., 1994).
В целом, полученные результаты показывают, что белок ki-67 был локализован в основном во всех имеющихся половых клетках как в нормальном, так и патологическом сперматогенеза. С другой стороны, соматические клетки яичек (Сертоли и Лейдига, ми-оидные) оставались иммунонегативными, не проявляя пролиферативной активности.
Отмечено, что низкая эффективность сперматогенеза при азооспермии коррелирует с высоким содержанием сывороточного ФСГ, включая понижение количества сперматого-ниев. Наши результаты также подтверждаются данными многолетних исследований (A. Amaral et al., 2013; R.J. Aitken, G.N. de Luliis, 2010; K. Steger et al., 1998; Bergmann и Kliesch, 1994; Kula, 1991; Francavilla et al., 1990; Johnson et al., 1990; Baker et al., 1976; de Kretser et al., 1974). Более чем вероятно, что это связано с нарушением дифференциации клеток Сертоли.
N. Oldereid et al. [26, 28] показали важную роль белка семейства Bcl-2 в поддержании нормального сперматогенеза. В своём прошлогоднем исследовании D. Jaiswal и соавт. [23] показали, что в биоптате яичка при азооспермии уровни проапоптотических белков (BAX, BAD, и BAK) значительно выше по сравнительно с антиапоптотическими (Bcl-2 и BCLW), что более всего связано с дисбалансом в экспрессии генов (BAX, BAK, BCL2 и BCLW), который и приводит к апоптозу половых клеток. Причина же нарушения экспрессии вышеуказанных генов остаётся неизвестна.
При фокальном варианте Сертоли-клеточно-го синдрома отмечается выраженная экспрессия каспаза-9, что свидетельствует о запуске внутреннего механизма апоптоза, описанного также в единичных научных работах [19, 20, 21, 29]
Результаты проведённого настоящего исследования показали значительно повышенную экспрессию белка-подготовки к апоптозу (р-53) при гипосперматогенезе на фоне сравнительно пониженной экспрессии анти-апоптического Вс1-2, что указывает на явно высоко активный (увеличенный) апоптоз на ряду с другими регулирующими факторами.
Изучение экспрессии белков-регуляторов в биологически значимых процессах половых клеток у мужчин 22 - 35 лет, выявило, что спер-матогонии относятся к самой обновляющейся клеточной популяции, обеспечивающие баланс между митотической и апоптотической активностями, необходимый для последующих клеток сперматогенеза: индекс пролиферации/ индекс апоптоза - 42.0±0.34/25.2±0.44. Подобный баланс отмечается и у пожилых мужчин: индекс пролиферации/ индекс апоптоза - 34.1±0.6/18.1±0.33. У лиц, страдающих идиопатической азооспермией, обнаружено снижение пролифератив-ной активности сперматогониев (12,0±0.1). Учитывая данные про- и антиапоптотической активности сперматогониев при бесплодии можно констатировать дисбаланс - преобладание процесса апоптоза над пролиферацией.
Анализ апоптотической активности показывает, что в случаях гипосперматогенеза или фокального варианта Сертоли-клеточ-ного синдрома нарушение стадии мейоза, похоже, являются первичными. Следовательно, изменение регуляции апоптоза может носить первичный характер и зависит от нарушения течения самого сперматогенеза, что приводит в конечном итоге к развитию мужского бесплодия. При этом причина инициирования апоптоза в половых клетках вероятнее всего связана с аутокринными нарушениями либо митохондриальными повреждениями.
ВЫВОДЫ
1. Зарегистрированное существенное (практически вдвое) снижение активности им-муномечения сперматогоний на Ы-67 в группе идиопатического бесплодия по сравнению с первой контрольной подгруппой (зрелый возраст), а также отсутствие экспрессии Ы-67 в сперма-тоцитах свидетельствуют о низкой пролифера-тивной активности сперматогенного пласта у пациентов с бесплодием, в то время, как в норме необходимая величина популяции спермато-
зоидов, в первую очередь, зависима именно от интенсивности размножения половых клеток.
2. Падение уровня экспрессии р-53 (белка-хранителя генома) при отсутствии экспрессии Bcl-2 - одного из наиболее важных противоапоп-тотических факторов,- совместно указывают на доминирование процесса апоптоза в семенных канальцах при идиопатическом бесплодии.
3. Проведенный иммуногистохимический анализ семенных канальцев человека в норме позволил заключить, что снижение активности иммуномечения клеток сперматогенного пласта на ki-67, p53, Bcl-2, каспазу-9 - является закономерным на этапах онтогенеза и указывает, что при старении яичка отсутствует обратно пропорциональная связь между активностью процессов пролиферации и апоп-тоза, как это можно было бы предполагать.
БЛАГОДАРНОСТИ/ACKNOWLEDGMENTS
Академику РАН д.м.н., профессору О.В. Волковой;! д.б.н., профессору Г.Г. Кругликову; д.м.н., профессору А.Ю. Цибулевскому; Andrey Bychkov, M.D., Ph.D. - Faculty of Medicine, Department of Pathology, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand; аспиранту кафедры эндоскопической урологии ФПКМР ФГБОУ ВПО РУДН, урологу-андрологу Д. В. Москвичёву.
ЛИТЕРАТУРА
1. Астраханцев А.Ф. Структура мужских половых желез в постнатальном онтогенезе. Автореф. дис. д.м.н: Рязань; 1996.
2. Гамидов С., Авакян А. Идиопатическое бесплодие у мужчин: эпидемиология, этиология, патогенез, лечение. Врач: научно-практический и публицистический журнал. М.: ИД «Русский врач». 2013; 7: 2-4.
3. Боронихина Т.В. Морфофункциональные изменения бульбоуретральных желез человека в постнатальном онтогенезе. Дис. д.м.н: Москва; 2007.
4. Бочарова Е.Н. Морфологическая и молекуляр-но-биологическая характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии. Дис. д.м.н: Москва; 2008.
5. Брагина Е..Е., Курило Л.Ф., Абдумаликов Р. .А., Бочарова Е.Н., Михайлова Е.М., Гришина Е.М., Шилей-ко Л.В., Сорокина Т.М. Множественные дефекты ультраструктурной организации жгутика сперматозоида у пациента с абсолютной астенозооспермией. Проблемы репродукции. 2004; 10 (№ 1): 66 - 69.
6. Быков В.Л. Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2000; 1:10 - 21.
7. Волкова О.В., Боровая Т.Г. Морфогенетические основы развития и функции яичников. М. Медицина; 1999.
8. Каган С.А. Патология сперматогенеза. М. Медицина; 1969.
9. Калашникова П.А. Антигены сперматозоидов и антиспермальные антитела ассоциированные с бесплодием (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2004; 4: 55-60.
10. Кулаков В.И., Серов В.Н., Адамян Л.В. и др.. Руководство по охране репродуктивного здоровья. М.: Триада-Х; 2001.
11. Курило Л.Ф. Развитие эмбриона человека и некоторые морально-этические проблемы методов вспомогательной репродукции. Проблемы репродукции. 1998; 3:39-49.
12. Мирский В.Е., Михайличенко В.В., Заезжал-кин В.В. Детская и подростковая андрология СПб.: Питер; 2003.
13. Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции. Москва, «Наука»; 1985.
14. Руководство ВОЗ по стандартизованному обследованию и диагностике бесплодных супружеских пар. Пер. с англ. Р. А. Нерсеяна; 1997.
15. Униговская М.В., Медведев Б.И., Теплова С.Н. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток с бесплодием с разными уровнями антиспермальных антител в крови. Вестн. ЮУрГУ. 2010;6:116 - 118.
16. Шаповалова Е. Ю., Бойко Т. А., Барановский Ю. Г., Каракулькина О. А., Барановский А. Г. Сравнительный анализ пролиферации и гибели клеток органов производных разных зародышевых листков у человека в процессе раннего эмбрионального гистогенеза. Гистогенез и регенерация тканей. СПб: 212 - 217.
17. Aafjes J.H., van der Vijver J.C., Schenck P.E. Value of a testicular biopsy rating for prognosis in oligozoospermia. Br Med J. 1978; 1:289 -290.
18. Alasmari W., Barratt C.L., Publicover S.J., Whalley K.M., Foster E., Kay V., Martins da Silva S., Oxenham S.K. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 2013; 28: 866-876.
19. Almeida C., Correia S., Rocha E., Alves A., Ferraz L., Silva J., Sousa M., Barros A. Caspase signalling pathways in human spermatogenesis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2013; 30: 487-495.
20. Amaral A., Lourengo B., Marques M., Ramalho-Santos J. Mitochondria functionality and sperm quality. Reproduction. 2013; 146(5): 163-74.
21. Condorelli R.A., La Vignera S., Bellanca S., Vicari E., Calogero A.E. Myoinositol: does it improve sperm mitochondrial function and sperm motility? Urology. 2012; 79; 1290-1295.
22. Hikim A.P.S., Swerdloff R.S. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis. Rev Reprod. 1999; 4: 38-47.
23. Jacobson M.D., Weil M., RaffM.C. Programmed cell death in animal development. Cell. 1997; 88(3): 347-354.
24. Jaiswal D., Trivedi S., K. Agrawal N., Singh K. Dysregulation of apoptotic pathway candidate genes and
proteins in infertile azoospermia patients. Fertility and Sterility. 2015; 104 (3):736-743.
25. Johnsen .SG. Testicular biopsy score count -a method for registration of spermatogenesis in human testes: normal values and results in 335 hypogonadal males. Hormones. 1970; 1:2-25.
26. Kim H.H., Funaro M., Mazel S., Goldstein M., Schlegel P.N., Paduch D.A. Flow cytometric characterization of apoptosis and chromatin damage in spermatozoa. Reproductive BioMedicine Online. 2012; 26: 393-395.
27. Lu C., Thompson C.B. Metabolic regulation of epigenetics. Cell Metabolism, 2012; 16: 9-17.
28. Oldereid N.B., Angelis P.D., Wiger R., Clausen O.P. Expression of Bcl-2 family proteins and spontaneous apoptosis in normal human testis. Mol Hum Reprod. 2001; 7: 403-408.
29. Pentikainen V., Erkkila K., Dunkel L. Fas regulates
germ cell apoptosis in the human testis in vitro. Am J Physiol. 1999; 276(2Pt1): 310-316.
30. Schon E.A., Di Mauro S., Hirano M. Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations. Nature Reviews. Genetics, 2012; 13: 878-890.
31. Tavalaee M., Deemeh M.R., Arbabian M., Nasr-Esfahani M.H. Density gradient centrifugation before or after magnetic-activated cell sorting: which technique is more useful for clinical sperm selection? Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2012; 29:31-38.
32. Thompson C. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science. 1995; 267(5203): 1456-1462.
33. Wang G.G., Guo Y.S., Zhou T., Shi X.D., Yu J., Yang Y., Wu Y.B., Wang J., Liu M.X., Chen X. et al. In-depth proteomic analysis of the human sperm reveals complex protein compositions. Journal of Proteomicsro 2013; 79: 114-122.
