CC BY
10УДК 612.438+614.876+539.16.04+636.028+616.832.9-008.8
ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ТИМУСА В ПОСТЛУЧЕВОМ ПЕРИОДЕ ПРИ ВВЕДЕНИИ КСЕНОГЕННОЙ СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ
М.А. Кривенцов, В.С.Пикалюк, Н.В.Девятова
Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», 295006, бул. Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Кривенцов Максим Андреевич, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского; 295000, г. Симферополь, Республика Крым, РФ
ORCID 0000-0001-5193-4311
E-mail: [email protected];
РЕЗЮМЕ
Цель проведенного исследования - изучение уровня экспрессии пролиферативного маркера Ki-67 в различных зонах тимуса крыс после однократного тотального облучения при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости. Эксперимент был проведен на крысах, которые были разделены на 5 серий: интактную, две контрольные (облучение с последующим введением физиологического раствора в различных дозах и с различной кратностью) и две экспериментальные серии (облучение с последующим введением спинномозговой жидкости в различных дозах и с различной кратностью). Установлено, что динамика пролиферативной активности после облучения носит двухволновой характер с увеличением к 7-м и 30-м суткам эксперимента. Парентеральное введение спинномозговой жидкости стимулирует пролиферативную активность тимоцитов, что проявляется в наибольшей степени, начиная с 7-х суток после облучения. Схема многократного применения ксеногенной спинномозговой жидкости в малой дозе оказалась более эффективной с позиции сохранения повышенной пролиферативной активности вплоть до 30-х суток эксперимента.
Ключевые слова: облучение, крысы, тимус, пролиферация, спинномозговая жидкость.
PROLIFERATIVE POTENTIAL OF THE THYMUS AT POSTRADIATION PERIOD WITH ADMINISTRATION OF XENOGENIC CEREBROSPINAL FLUID
M.A. Kriventsov, V.S. Pikaluk, N.V.Devyatova
Medical academy named after S.I. Georgievsky of V.I. Vemadsky Crimea federal university
ABSTRACT
The aim of the study was to assess changes in the level of expression of the proliferative marker Ki-67 in a variety of structural and functional areas of the rats' thymus under a single total irradiation after parenteral administration of the xenogenic cerebrospinal fluid. The experiment was carried out on rats, which were divided into five series: intact (I) [without radiation exposure], two control (C1 and C2) [irradiation + saline at different doses and with different frequency of administration] and two experimental series (E1 and E2) [irradiation + cerebrospinal fluid in different doses and with different frequency of administration]. It was found that the dynamics of proliferative activity after irradiation has two-wave character with the decay on the 14th day after radiation exposure. Parenteral administration of xenogenic cerebrospinal fluid results into a stimulating effect on the proliferative activity of thymo-cytes, which manifests to the greatest extent starting from the 7th day after irradiation. Repeated administration of the xenogenic cerebrospinal fluid at a dose of 2 ml/kg was more effective in terms of maintaining an increased proliferative activity until the 30th day of the experiment.
Keywords: irradiation, rats, thymus, proliferation, cerebrospinal fluid.
Структурные изменения тимуса в условиях воздействия ионизирующего излучения достаточно широко освещены в литературе, с подробным описанием этапов развития гистопато-логических преобразований при использовании различных видов и доз облучения [1, 2, 3]. Вместе с тем, доступные в литературе данные разнородны и не позволяют определить динамику преобразований в тимусе при использовании определенной дозы облучения. Помимо этого, одним из наименее изученных вопросов в дан-
ной области следует считать динамику изменения экспрессии различных иммуногистохими-ческих маркеров (в частности, маркера Кь67). С другой стороны, актуальным и требующим пристального внимания вопросом является поиск высокоэффективных и безопасных средств коррекции негативных последствий радиационного поражения, а также обоснование, в том числе и морфологическое, возможности их применения. В этой связи, перспективным направлением является изучение биологических
эффектов парентерального введения ксеноген-ной спинномозговой жидкости (СМЖ) [4, 5]. Предпосылками к проведению данного экспериментального исследования являются работы проф. С.Н. Куприянова и проф. В.В. Ткача, в которых было продемонстрировано положительное влияние инъекций ксеногенного ликво-ра при остром лучевом поражении [6].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить уровни экспрессии пролифератив-ного маркера Кь67 в различных структурно-функциональных зонах тимуса крыс после однократного тотального облучения при паренте-
ральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В экспериментальной работе задействовали самцов белых крыс линии Вистар ювениль-ного возраста (возраст 3 - 3,5 месяцев, масса тела 150 - 170 г). Было выделено 5 серий: ин-тактная серия (И), две контрольные серии (К1 и К2) и две экспериментальные серии (Э1 и Э2) (см. таблицу 1).
Таблица 1.
Схема эксперимента_
Серия опытов Сроки выведения из эксперимента, сутки Кол-во животных Примечание
И - 6 Без облучения
К1 3, 7, 14, 30 24 Облучение + СМЖ 10 мл/кг (однократно)
Э1 3, 7, 14, 30 24 Облучение + физиологический раствор 10 мл/кг (однократно)
К2 7, 14, 30 18 Облучение + СМЖ 2 мл/кг (многократно)
Э2 7, 14, 30 18 Облучение + физиологический раствор 2 мл/кг (многократно)
Всех животных, за исключением крыс ин-тактной серии, подвергали однократному облучению в дозе 5 Гр с использованием линейного ускорителя СНпас 2100 (производства компании Varian, США) на базе Крымского республиканского учреждения "Онкологический клинический диспансер". Применялись следующие параметры ионизирующего излучения: рабочая энергия линейного ускорителя - 6 МэВ, время экспозиции - 50 сек, разовая доза - 500 рад (5 Грей), размер поля - 40 см2, глубина проникновения - 2,5 см.
После облучения животным экспериментальных серий вводили ксеногенную спинномозговую жидкость (СМЖ), которую получали прижизненно путем субокципитальной пункции у крупного рогатого скота (коров) с последующим сверхбыстрым замораживанием в жидком азоте. СМЖ вводили внутримышечно спустя 24 часа после облучения: однократно в дозе 10 мл/кг (экспериментальная серия Э1) или многократно (1 раз в 3 дня) в дозе 2 мл/кг. Крысам контрольных серий опытов (К1 и К2) аналогичным образом, с аналогичной кратностью и дозой вводили физиологический раствор.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 3-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки после облучения (серии К1 и Э1) или на 7-е, 14-е и 30-е сутки после об-
лучения (серии К2 и Э2) с соблюдением всех требований и биоэтических норм.
После выделения тимуса его фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, проводили через батарею спиртов восходящей концентрации и заливали в парафин. Иммуно-гистохимическое окрашивание проводили на срезах толщиной 3-4 мкм в соответствии с протоколами компании TermoScientific (США), используя систему визуализации Quanto и DAB Chromogen. После проведения всех этапов реакции с использованием программного обеспечения ImageJ [7] оценивали коричневое ядерное окрашивание (маркер Ki-67 (клон sp6, TermoScientific)). Количественный уровень экспрессии изучаемого маркера выражали в виде процентного соотношения площади иммунопо-зитивных ядер и площади иммунонегативного окрашивания (IKi67). На основании полученных данных в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США) строили вариационные ряды, оценивали нормальность распределения по критерию Колмогорова-Смирнова [8], рассчитывали среднее значение и ошибку среднего, после чего определяли достоверность отклонений от показателей интактных крыс с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Иммуногистохимический индекс К1-67 в корковом и мозговом веществе тимуса интакт-ных крыс составлял 38,83±2,48 и 25,16±1,22, соответственно. В субкапсулярной зоне коркового вещества уровень экспрессии составлял 36,59±1,42. Полученные результаты в серии интактных крыс свидетельствуют о закономерных активных процессах внутритимической пролиферации, локализованных, преимущественно, в корковом веществе тимуса и, в частности, в субкапсулярной зоне.
Однократное воздействие ионизирующего излучения в дозе 5 Гр оказало значительное влияние на пролиферативную активность тимо-цитов. Была отмечена общая тенденция, которая отражает активацию адаптационных резервов и стадийность восстановления клеточной популяции тимуса. При этом следует отметить, что во все сроки наблюдения после облучения данные экспрессии К1-67 в двух контрольных сериях опытов (К1 и К2) достоверно не различались между собой. Это связано, вероятно, с незначительным влиянием фактора кратности и дозы введения физиологического раствора по сравнению с сублетальной дозой ионизирующего излучения.
В обеих контрольных сериях различия в уровне экспрессии К1-67 в корковом веществе тимуса от данных интактной серии опытов не достигали уровня статистической достоверности. При этом в субкапсулярной зоне коркового вещества значения 1К167 спустя 3, 7 и 30 суток после облучения составляли 62,69±3,40, 48,09±2,47 и 58,08±4,63, соответственно, что на 71,33 %, 31,43 % и 58,71 % превосходит значения, полученные в интактной серии крыс (р < 0,05). В мозговом веществе тимуса экспрессия маркера К1-67 спустя 7, 14 и 30 суток, наоборот, снижалась по сравнению с интактной серией опытов на 25,04 %, 25,80 % и 16,40 %, соответственно (р < 0,05).
В экспериментальной серии крыс с однократным введением большой дозы СМЖ после облучения (серия Э1) выявленные значения 1К167 в корковом и мозговом веществе на всех сроках
наблюдения статистически достоверно не отличались от данных, полученных в интактной серии опытов. Статистически достоверные отличия были выявлены лишь в отношении 1К167 в субкапсулярной зоне: экспрессия маркера пролиферации превышала соответствующие показатели в интактной серии на 40,49 %, 22,07 % и 20,11 % (во всех случаях р < 0,05) на 3, 7 и 14 сутки после облучения. На 30-е сутки эксперимента выявленное значение, наоборот, на 21,07 % (р < 0,05) было меньше интактного показателя. В сравнении с соответствующей контрольной серией статистически значимые различия были выявлены в отношении 1К167 в мозговом веществе на 7 и 14 сутки, а также в субкапсу-лярной зоне на 3, 14 и 30 сутки эксперимента.
При многократном введении СМЖ на 7-е сутки после облучения (т.е. после двукратного введения ликвора в дозе 2 мл/кг) во всех изученных структурно-функциональных зонах тимуса было отмечено статистически достоверное (р < 0,05) увеличение уровня экспрессии К167 по сравнению с интактной серией крыс: в корковом веществе - на 44,23 %, в мозговом веществе - на 62,77 % и в субкапсулярной зоне коркового вещества - на 99,75 %. При этом по сравнению с интактной серией на 14 сутки эксперимента значение 1К167 в мозговом веществе достоверное снижалось (на 17,59 %; р < 0,05), а на 30 сутки наблюдали увеличение уровня экспрессии маркера в глубокой и субкапсулярной зоне коркового вещества (на 16,27 % и 55,93 %, соответственно; р < 0,05).
Обобщая полученные экспериментальные данные, следует отметить, что уровень проли-феративной активности в корковом веществе тимуса (в глубокой зоне коры) во всех сроках наблюдения после облучения статистически достоверно не отличался от данных, полученных при исследовании необлученных животных (рис. 1). Исключением стала экспериментальная серия Э2, в которой на 7 и 30 сутки эксперимента была выявлена активизация внутритими-ческой пролиферации, затрагивающая глубокую кору тимуса.
|К167
70 60 50 40 30 20 10 0
Корковое вещество
■ И
□ К1
□ Э1
□ К2 1 ВЭ2
3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
Рисунок 1. Индекс иммуногистохимического маркера К167 (1К167) в корковом веществе тимуса в
различные сроки эксперимента (М ± т). Примечания: * - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от интактной серии; ** - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от соответствующей контрольной серии.
Изменения пролиферативной активности в мозговом веществе приобретали статистически значимый характер, начиная с 7-х суток после облучения (рис. 2). При этом показатели в 1-й экспериментальной серии соответствовали серии интактных животных и статистически достоверно превышали показатели в контрольной серии (облучение + физиологический раствор). Во 2-й экспериментальной серии также было выявлено значительное увеличение пролифера-тивной активности на 7-е сутки после облучения, указывая, возможно, на задействование мозгового вещества в восстановлении утрачен-
ной после облучения популяции тимоцитов. Статистически достоверное уменьшение 1к167 в этой серии на 14-е сутки после облучения с последующим повторным увеличением пролифе-ративной активности к 30-м суткам согласуется с двухволновой кинетикой восстановления клеточной популяции тимуса после облучения [10]. Это объясняется истощением внутритимиче-ских механизмов восстановления клеточной популяции с последующим переходом на восстановление за счет костномозговых клеток-предшественников.
45 40 35 30 25
|К167 20
15 10 5 0
* ** X
Мозговое вещество
■ И
□ К1
□ Э1
□ К2 ВЭ2
3 сутки
7 сутки
14 сутки
30 сутки
Рисунок 2. Индекс иммуногистохимического маркера К167 (1К167) в мозговом веществе тимуса в
различные сроки эксперимента (М ± т). Примечания: * - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от интактной серии; ** - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от соответствующей контрольной серии.
Аналогичная двухволновая кинетика с "провалом" пролиферативной активности на 14-е сутки после облучения наблюдалась и в отношении специфической зоны, принимающей на
себя основную задачу пролиферации клеток-предшественников Т-лимфоцитов - субкапсу-лярной зоны (рис. 3).
* **
* **
*
Рисунок 3. Индекс иммуногистохимического маркера К167 (1К167) в субкапсулярной зоне тимуса
в различные сроки эксперимента (М ± т).
Примечания: * - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от интактной серии; ** - статистически достоверное отклонение (р < 0,05) от соответствующей контрольной серии.
Полученные данные являются составной частью комплексного морфологического исследования по изучению структурных преобразований тимуса в различные сроки после облучения при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости и согласуются с полученными ранее результатами в отношении некоторых периферических органов иммунной системы [5, 11].
IKÍ67
80 70 60 50 40 30 20 10 0
Субкапсулярная зона
■ И
□ К1
□ Э1
□ К2 ВЭ2
3 сутки
7 сутки
14 сутки
30 сутки
* **
*
*
ВЫВОДЫ
Динамика экспрессии иммуногистохимического маркера пролиферации (Ki-67) на 3, 7, 14 и 30 сутки после облучения указывает на восстановление клеточной популяции тимуса, утраченной после воздействия ионизирующего излучения. Это происходит, вероятно, за счет активации привлечения предшественников им-мунокомпетентных клеток из красного костного мозга, а также за счет активации внутритимиче-ской пролиферации Т-лимфоцитов, преимущественно, в субкапсулярной зоне тимусе.
Динамика пролиферативной активности по данным экспрессии иммуногистохимического маркера Ki-67 после облучения носит двухвол-новой характер со спадом к 14-м суткам после лучевого воздействия.
Парентеральное введение ксеногенной спинномозговой жидкости, в целом, оказывает стимулирующий эффект на пролиферативную активность тимоцитов, что проявляется в наибольшей степени, начиная с 7-х суток после облучения. Схема многократного применения ксеногенной спинномозговой жидкости в дозе 2 мл/кг оказалась более эффективной с точки зрения сохранения повышенной пролиферативной активности вплоть до 30-х суток эксперимента.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tsuji H, Ishii-Ohba H, Shiomi T, et al. Nature of nontargeted radiation effects observed during frac-
tionated irradiation-induced thymic lymphomagenesis in mice. Journal of Radiation Research. 2013;54(3):453-466. doi:10.1093/jrr/rrs128.
2. Акоев И.Г., Максимов Г.К., Малышев В.М. Лучевое поражение млекопитающих и статистическое моделирование. М.: Атомиздат; 1972.
3. Бутомо Н.В., Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Основы медицинской радиобиологии. Санкт-Петербург: Фолиант. 2004.
4. Kriventsov M.A. Cerebrospinal fluid review: considerations for immunoregulatory role and current trends. Таврический медико-биологический вестник. 2013;1(2(61)):257-265.
5. Кривенцов М. А., Куцая В.В. Динамика структурных преобразований лимфатических узлов крыс после однократного воздействия ионизирующего фотонного излучения. Морфологiя. 2014;8(1):53-57.
6. Куприянов С.Н., Мамиева М.Ф. Влияние инъекций ликвора на течение острой лучевой болезни. Зравоохранение Туркменистана. 1968;2:21-26.
7. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 2012;28;9(7):671-675. doi: 10.1038/nmeth.2089
8. Justel A, Peña D, Zamar R. A multivariate Kol-mogorov-Smirnov test of goodness of fit. Statistics & Probability Letters. Elsevier BV; 1997 Oct;35(3):251-9. doi: 10.1016/s0167-7152(97)00020-5
9. Васильев А. Н. Научные вычисления в Microsoft Excel. M.: Издательский дом Вильяме; 2004.
10. Митин А. Н., Комогорова В.В., Литвина М. М. Динамика субпопуляций тимоцитов при регенерации тимуса после облучения. Иммунология. 2012;6:297-302.
11. Куница В.Н., Девятова Н.В., Кривенцов М.А. Лимфоидные образования слепой кишки крыс после облучения. Современная медицина: актуальные вопросы. 2015;38-39:99-106.
REFERENCES
1. Tsuji H, Ishii-Ohba H, Shiomi T, et al. Nature of nontargeted radiation effects observed during fractionated irradiation-induced thymic lymphomagenesis in mice. Journal of Radiation Research. 2013;54(3):453-466. doi:10.1093/jrr/rrs128.
2. Akoev I.G., Maksimov G.K., Malyshev V.M. Luchevoe porazhenie mlekopitayushchikh i statis-ticheskoe modelirovanie. M.: Atomizdat; 1972. (In Russian)
3. Butomo N.V., Grebenyuk A.N., Legeza V.I. Osnovy meditsinskoi radiobiologii. Sankt-Peterburg: Foliant. 2004. (In Russian)
4. Kriventsov M.A. Cerebrospinal fluid review: considerations for immunoregulatory role and current trends. Tavricheskii mediko-biologicheskii vestnik. 2013;1(2(61)):257-265.
5. Kriventsov M.A., Kutsaya V.V. Dynamics of structural transformation of lymph nodes in rats after a single exposure to ionizing photon radiation. Morfología. 2014;8(1):53-57. (In Russian)
6. Kupriyanov S.N., Mamieva M.F. Effect of injection of liquor on the course of acute radiation sickness. Zravookhranenie Turkmenistana. 1968;2:21-26. (In Russian)
7. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Meth. 2012;28;9(7):671-675. doi: 10.1038/nmeth.2089
8. Justel A, Peña D, Zamar R. A multivariate Kol-mogorov-Smirnov test of goodness of fit. Statistics & Probability Letters. Elsevier BV; 1997 Oct;35(3):251-9. doi: 10.1016/s0167-7152(97)00020-5
9. Vasil'ev A. N. Nauchnye vychisleniya v Microsoft Excel. M.: Izdatel'skii dom Vil'yame; 2004. (In Russian)
10. Mitin A. N., Komogorova V. V., Litvina M. M. Dynamics of populations thymocytes during the regeneration of the thymus after irradiation. Immu-nologiya. 2012;6:297-302. (In Russian)
11. Kunitsa V.N., Devyatova N.V., Kriventsov M.A. Lymphoid structures of rat's cecum after ir-ratiation. Sovremennaya meditsina: aktual'nye vo-prosy. 2015;38-39:99-106. (In Russian)
