CC BY
33
УДК 616.314.18-002
Е.М. СПЕРАНСКАЯ1-3, Л.Р. МУХАМЕДЖАНОВА12, Н.Н. ГОЛУБЦОВА1, Р.Г. КУЗНЕЦОВА4
1Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова, 428015, г. Чебоксары, пр. Московский, д. 15 2Учебно-методический центр «Эксклюзив-Дент», 420061, г. Казань, ул. Космонавтов, д. 42 Республиканская стоматологическая поликлиника МЗ ЧР, 428015, г. Чебоксары, пр. Московский, д. 15 "Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, Оренбургский тракт, д. 138
Пролиферативная активность тканей пародонта при воспалительно-деструктивных поражениях
Сперанская Екатерина Михайловна - ординатор кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий, тел. +7-917-662-93-53, e-mail: katerina_dumspirospero@mail.ru
Мухамеджанова Любовь Рустемовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий, научный консультант Учебно-методического центра «Эксклюзив-Дент», тел. +7-965-597-11-64, e-mail: lr71@bk.ru Голубцова Наталья Николаевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины, тел. +7-905-340-77-99, e-mail: golubnata@list.ru
Кузнецова Роза Гилевна - старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела, тел. (843) 231-16-20, e-mail: rkb_nauka@rambler.ru
Изучено содержание маркера Ki-67, активность эксфолиативных процессов, количество дегранулированных тучных клеток в соединительнотканных структурах пародонта пациентов, отягощенных хроническим генерализованным па-родонтитом. Установлено угнетение процессов пролиферации в структурах многослойного плоского эпителия десны, увеличение содержания дегранулированных тучных клеток, усиление процессов эксфолиации кератинизированного эпителия у пациентов исследуемой группы, что указывает на глубину воспалительно-деструктивных процессов. Полученные сведения актуализируют поиск методов регуляции пролиферативных процессов в эпителии десны.
Ключевые слова: хронический генерализованный пародонтит, маркер пролиферации Ki-67, тучные клетки, эксфолиация эпителиоцитов.
E.M. SPERANSKAYA13, L.R. MUKHAMEDZHANOVA12, N.N. GOLUBTSOVA1, R.G. KUZNETSOVA4
1Chuvash State University named after I.N. Ulyanov, 15 Moskovskiy Pr., Cheboksary, Russian Federation, 428015 2Training and methodological center «Eksklyuziv-dent», 42 Kosmonavtov Str., Kazan, Russian Federation, 420061 3Republican Dental Clinic of the Ministry of Health of the Chuvash Republic, 15 Moskovskiy Pr., Cheboksary, Russian Federation, 428015
4Republican Clinical Hospital of the MH of RT, 138 Orenburgskiy Trakt, Kazan, Russian Federation, 420064
Proliferative activity in periodontal tissues in cases of inflamatory-destructive lesions
Speranskaya E.M. - resident physician of the Department of propaedeutics of dental diseases and new technologies, tel. +7-917-662-93-53, e-mail: katerina_dumspirospero@mail.ru
Mukhamedzhanova L.R. - D. Med. Sc., Professor of the Department of propaedeutics of dental diseases and new technologies, scientific consultant of the Training and methodological center «Eksklyuziv-dent», tel. +7-965-597-11-64, e-mail: lr71@bk.ru
Golubtsova N.N. - Cand. Biol. Sc., Professor of the Department of general and clinical morphology and forensic medicine, tel. +7-905-340-77-99, e-mail: golubnata@list.ru
Kuznetsova R.G. - senior researcher of the Scientific and Research Department, tel. (843) 231-16-20, e-mail: rkb_nauka@rambler.ru
' № 4(96) август 2016 г. / том 2
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА ^ 107
In this article is studied the content of the marker Ki-67, the activity of the exfoliative processes, the number of degranulated mast cells in the connective tissue structures of the periodontium of patients burdened with chronic generalized periodontitis. Also, has been established the oppression of proliferation processes in the structures of the stratified squamous epithelium of the gums, the increase in the content of degranulated mast cells, the reinforcement of the exfoliation processes in the keratinized epithelium in the patients of the study group. The findings make actual search of methods of proliferative processes regulation in the epithelium of the gingiva.
Key words: chronic generalized periodontitis, a marker of proliferation Ki-67, mast cells, exfoliation of epithelial cells.
Сложность прогнозирования течения воспалительно-деструктивных поражений пародонта, особенно на ранних стадиях развития процесса, побуждают к поиску диагностичесwких критериев, позволяющих оценить глубину вовлечения различных структур пародонта. Эта ситуация свидетельствует об актуальности совершенствования комплекса диагностических мероприятий для пациентов, отягощенных хроническим генерализованным пародонтитом [1-3].
Деструкция тканей пародонта при тяжелой степени воспалительного процесса обусловлена глубокими нарушениями клеточного гомеостаза — активацией апоптоза на фоне резкого угнетения пролиферативной активности эпителия [4]. Многослойный плоский ороговевающий эпителий десны выполняет функцию барьерной защиты для комплекса пародонтальных тканей; его пролифератив-ной активностью обеспечивается состоятельность этого барьера. Важная роль в прогрессировании нарушений клеточного гомеостаза эпителиоцитов слизистой оболочки десны при воспалительных заболеваниях пародонта принадлежит маркеру Ю-67, тучным клеткам [5-9]. По уровню экспрессии Ю-б7 можно судить о пролиферативной активности клеток [10]. Изменения данного маркера, количества и степени дегрануляции тучных клеток в тканях пародонта при воспалительно-деструктивных поражениях недостаточно изучены [11-13]. В свою очередь, умение интерпретировать результаты исследований клеточной пролиферации эпителиоци-тов десны позволят улучшить раннюю диагностику воспалительно-деструктивных процессов в тканях пародонта [4, 14].
Цель исследования заключалась в определении влияния хронического воспалительно-деструктивного процесса в тканях пародонта на пролиферацию эпителия и фибробластов соединительнотканного слоя десны.
Материал и методы исследования
Обследованы 25 пациентов (10 мужчин и 15 женщин в возрасте 20-36 лет) с интактным пародонтом, обратившиеся в Республиканскую стоматологическую поликлинику (г. Чебоксары) с целью оказания плановой санационной помощи (группа сравнения). Исследуемая группа представлена 30 пациентами сопоставимого гендерно-возрастного состава; пациенты исследуемой группы были отягощены хроническим генерализованным пародонтитом легкой/ средней степени тяжести. Критериями включения в исследуемую группу явились: отягощенность хроническим генерализованным пародонтитом, согласие на участие в проведении исследований. Критериями исключения явились: отягощенность соматической патологией (для исключения влияния заболеваний желудочно-кишечного тракта и эндокринной системы на пролиферативную активность мукозальных эпителиоцитов), прием витаминных и минеральных комплексов, оральных контрацепти-
вов, алкогольная и табачная зависимость. Верификация пародонтологического диагноза проводилась с использованием пародонтологических индексов и трехмерной конусно-лучевой дентальной рентгеновской компьютерной томографии.
Пациентам, участвующим в исследовании, проводился забор тканей десневого сосочка (в области седла) в процессе проведения закрытого кюретажа. Выполнялась инфильтрационная анестезия 2% раствором лидокаина. Полученный биоматериал фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали в парафин. Из блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Для изучения распределения тучных клеток срезы десны окрашивали полихромным толуи-диновым синим по методике Унна. Метод основан на использовании спиртового раствора двух красителей — метиленового синего и полихромного толу-идинового синего. Сочетание этих двух красителей позволяет одномоментно оценить количественное распределение тучных клеток в тканях десны, и получить представление о степени сульфатированно-сти кислых мукополисахаридов в гранулах тучных клеток.
По состоянию мукополисахаридов тучные клетки оценивали следующим образом [15]:
а-ортохромные тучные клетки с голубой окраской цитоплазмы и гранул;
Р1-метахроматичные тучные клетки с гранулами темно-синего цвета;
в2-метахроматичные тучные клетки, имеющие фиолетовую окраску гранул;
Р3-метахроматичные тучные клетки с красно-фиолетовыми гранулами.
По степени дегрануляции, согласно классификации Линднер Д.П. (1989) и Стручко Г.Ю. (1999), выделяли следующие формы тучных клеток [15]:
Т0 формы — гранулы расположены плотно в цитоплазме, ядро клетки визуально не определяется;
Т1 формы — ядро просматривается хорошо, гранулы располагаются внутри клетки, за пределы ци-топлазматической мембраны не выходят;
Т2 формы — гранулы частично выходят за пределы неповрежденной цитоплазматической мембраны;
Т3 формы — полностью дегранулированные, опустошенные клетки, либо с разорванной цитоплаз-матической мембраной.
Ю-67 выявляли непрямым иммуногистохимиче-ским методом [16]. В качестве первых антител использовали моноклональные мышиные антитела к Ю-67 в разведении 1:100 (Novocastra, Великобритания) на 0,05 М трис-буфере с рН 7,4 с добавлением 0,15 М натрия хлорида. Визуализацию антигенов проводили с помощью системы EnVision, конъюги-рованной с пероксидазой (К 4002, DakoCytomation, Дания). Выявление пероксидазы проводили с использованием 3,3-диаминобензидина [16]. Продукт реакции окрашивался в коричневый цвет. В качестве контроля специфичности окрашивания применяли такую же процедуру обработки срезов, но вместо первых антител использовали нормальную
Таблица.
Индекс дегрануляции, формы степени дегрануляции тучных клеток и характер метахромазии тучных клеток у пациентов исследуемой группы и группы сравнен
Группа Индекс дегрануляции Слои собственной пластинки Формы степени дегрануляции (показатель числа тучных клеток в одном поле зрения при ув. 1000) Характер метахромазии ТК, %
То Т1 Т2 Т3 а 31 р2 р3
Группа сравнения 0,57±0,1* сосочко-вый 1,6±0,5 1,5±0,6** 1,3±0,5* 1,1±0,2** 29,3 38,7 32
0,32±0,05 сетчатый 2,2±0,8 1,7±0,4** 1,6±0,5* 1,2±0,3** 49,5 15,4 35,1 -
ХГП 0,64±0,1* сосочко-вый 2,0±1,1 2,4±0,7** 2,3±0,5* 2,0±0,6** 37 22,6 40,4 -
0,44±0,2 сетчатый 1,4±0,4 1,9±0,5** 1,9±0,9* 2,0±0,7** 40,6 24,2 26,6 8,6
Примечание: * — p<0,01, ** — p<0,05
сыворотку в конечной концентрации — 1%. Далее проводили докрашивание ядер гематоксилином.
На первом этапе исследования в эпителии десны подсчитывали число Ki-67-позитивных эпите-лиоцитов на 100 клеток базального и шиповатого слоев. В результате определяли процент иммуно-позитивных к Ki-67 эпителиоцитов. На втором этапе исследования подсчитывали общее число фи-бробластов в сосочковом слое десны на одно поле зрения микроскопа при 1000-кратном увеличении и количество Ki-67-позитивных фибробластов в этом же поле зрения. Для каждого случая оценивали количество клеток в 10 полях зрения. В результате рассчитывали процент положительно окрашенных фибробластов сосочкового слоя на одно поле зрения. На третьем этапе подсчитывали общее число фибробластов в сетчатом слое на одно поле зрения микроскопа при 1000-кратном увеличении и количество Ki-67-позитивных фибробластов в этом же поле зрения. Для каждого случая оценивали количество клеток в 10 полях зрения. В результате рассчитывали процент положительно окрашенных фибробластов сетчатого слоя на одно поле зрения.
Особенности эксфолиативных процессов определяли методом цитоморфометрии. Забор цитологического материала у пациентов исследуемой группы и группы сравнения проводили из десневой борозды / пародонтального кармана с помощью мишени (силиконовый клинышек), переносили на стерильное обезжиренное предметное стекло (помещали несколько нативных проб десневой жидкости или содержимого пародонтальных карманов) и высушивали. Мазки-перепечатки окрашивали по Романовскому — Гимзе; в цитограммах под микроскопом марки «AXIO Scope A1» фирмы ZEISS с объективом х 20, иммерсионным объективом х 90 и окуляром х 10, изучались популяции эпителиальных клеток (поверхностные, парабазальные, базальные).
Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке. По каждой группе данных рассчитывали средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (±m). При значениях переменных, соответствующих требованиям нормальности распределения, сравнение проводили с использованием критерия Стьюдента, не соответствующих обозначенным требованиям — с использованием критерия Манна — Уитни.
Результаты и их обсуждение
В тканях десны тучные клетки были выявлены в сосочковом и сетчатых слоях. В группе сравнения в данных слоях преобладали тучные клетки Т0 формы (см. табл.). Среди них в сосочковом слое выявлялись преимущественно р1-метахроматичные
тучные клетки с гранулами темно-синего цвета, а в сетчатом слое а-ортохромные тучные клетки с голубой окраской цитоплазмы и гранул (см. табл., рис. 1А).
Преобладающей формой тучных клеток в группе пациентов с хроническим генерализованным паро-донтитом в сосочковом слое были Т1 тучные клетки, в сетчатом — Т3 (см. табл., рис. 1Б). Тучные клетки в сосочковом слое имели фиолетовую окраску гранул, в сетчатом слое преобладали клетки с голубой окраской цитоплазмы и гранул, выявлялись тучные клетки с красно-фиолетовыми гранулами (см. табл.).
Рисунок 1.
Тучные клетки собственной пластинки многослойного плоского эпителия десны. Группа сравнения (А), группа с хроническим генерализованным пародонтитом (Б). 1 — тучные клетки. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна. Микроскоп МИКМЕД-5. Увеличение х 90
Рисунок 2.
Иммуногистохимический метод Ю-67. Многослойный плоский эпителий десны. Группа сравнения (А), группа с хроническим генерализованным пародонтитом (Б). 1 — Ю-67 позитивные эпителиоциты. Микроскоп МИКМЕД-5. Увеличение х 90
V«.'?« ' • 0*1 ' •' ""' т *** "
А Б
Рисунок 3.
Процент Ю-67 положительно окрашенных клеток в тканях межзубного сосочка десны у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом и в группе сравнения. Многослойный плоский эпителий (А), сосочковый слой (Б), сетчатый слой (В)
А
Многослойный плоский эпителий
iгруппа сравнения
3 группа с ХГП
В
4,8±1 J
Сетчатый слой
сс = »
g i
(П *
1 I t-
Î
2 о
ta группа ера н ней н н
Е группа с ХГП
р<0.05
Сосочковый слои
s группа сравнения
] группа с ХГП
р<0,05
Индекс дегрануляции тучных клеток при хроническом генерализованном пародонтите был достоверно выше (см. табл.), чем в группе сравнения (Р<0,01).
В многослойном плоском эпителии десны Ki-67-позитивные клетки располагались в базальном и шиповатом слоях (рис. 2). В группе сравнения процент Ki-67 положительно окрашенных эпителиоцитов составил 18,5±2,9 (рис. 1А, рис. 2А). При хроническом генерализованном пародонтите процентное содержание положительно окрашенных клеток уменьшилось до 13,6±1,5 (рис. 2Б, рис. 3А).
В сосочковом слое собственной пластинки в группе сравнения процент Ki-67 положительно окрашенных фибробластов составил 10,9±2,7 (p<0,05).
У пациентов с пародонтитом процентное содержание положительно окрашенных клеток уменьшилось до 4,4±0,86 (р<0,05) (рис. 3Б).
В сетчатом слое собственной пластинки в группе сравнения процент Ю-67 положительно окрашенных фибробластов составил 4,8±1,3 (р<0,05). При пародонтите процентное содержание положительно окрашенных клеток уменьшилось до 2,2±0,4 (р<0,05) (рис. 3В).
Результаты цитоморфометрического исследования свидетельствуют об активности процессов эксфолиации эпителия у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом: число поверхностных клеток составило 16,8±3,0, парабазаль-ных — 47,8±6,2, базальных — 28,4±2,5 на 100 клеток в поле зрения. В группе сравнения результаты цитоморфометрии оказались следующими: число поверхностных клеток — 88,1±9,6, базальных — 10,7±2,3, парабазальных — 1,2±0,2 на 100 клеток в поле зрения. По каждой позиции показано отличие, укладывающееся в диапазон статистической достоверности (р<0,01).
Таким образом, у пациентов, отягощенных хроническим генерализованным пародонтитом, выявлены признаки активности воспалительного процесса практически во всех соединительнотканных и эпителиальных слоях. Анализируя полученные цифровые данные, можно заключить, что наиболее важной «ареной» действия является сосочковый,
Б
базальный и шиповатый слои. Именно здесь оказалась наименьшей активность пролиферативных процессов, наибольшее сосредоточение дегранули-рованных форм тучных клеток. Полученные нами сведения согласуются с результатами исследований Арташан О.С., 2006; Григорович Э.Ш., Городилов Р.В., Заблоцкая Е.А., 2011; Климин В.Г., 2004 [5-7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Грудянов А.И., Дмитриева Л.А., Максимовский Ю.М. Пародон-тология. Современное состояние вопроса и направление научных разработок // Стоматология. — 1999. — №1.— С. 16-21.
2. Максимовский Ю.М., Митронин А.В. Основные направления профилактики и лечения хронического воспаления в области пе-риодонта // Российский стоматологический журнал. — 2004. — №1. — С. 16-19.
3. Kaner D., Bemimoulin J.P., Kleber В.М., Friedmann A. Minimally invasive flap surgery and enamel matrix derivative in the treatment of localized aggressive Periodontitis: case report // Int. J. Periodontics Restorative Dent. - 2009. - №29 (1). - P. 89-97.
4. Осипова Ю.Л., Булкина Н.В., Кропотина А.Ю. Воспалительные заболевания пародонта при неэрозивной форме гастроэзофагеаль-ной рефлюксной болезни: клинические и иммуноморфологические аспекты // Фундаментальные исследования. — 2012. — №2-2. — С. 325-327.
5. Арташян О.С. Система тучных клеток при действии на организм экстремальных факторов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — 2006. — 28 с.
6. Григорович Э.Ш., Городилов Р.В., Заблоцкая Е.А. Клеточное обновление эпителия десны у больных хроническим генерализованным пародонтитом под влиянием начального пародонтологического лечения // Институт стоматологии. — 2011. — №2 (51). — С. 62-65.
7. Климин В.Г. Тучные клетки и гипоксия // Вестник Уральской медицинской академической науки. — 2006. — №1. — С. 45-48.
Вывод
Степень дегрануляции тучных клеток увеличивается при хроническом воспалительно-деструктивном поражении тканей пародонта. При хроническом генерализованном пародонтите в эпителии десны угнетаются пролиферативные процессы, что обусловлено компенсаторным замедлением гибели эпителиоцитов.
8. Кондрашевская М.В. Тучные клетки и гепарин — ключевые звенья в адаптивных и патологических процессах // Вестник Российской академии медицинских наук. — 2010. — №6. — С. 49-54.
9. Яглова Н.В., Яглов В.В. Биология секреции тучных клеток // Клиническая и экспериментальная морфология. —2012. — №4. — С. 4-10.
10. Камышников В.С. Онкомаркеры: методы определения, референтные значения, интерпретация тестов. — М.: МЕДпресс-информ, 2001. — 128 с.
11 Осипова Ю.Л., Булкина Н.В., Кропотина А.Ю. и соавт. Роль тучных клеток слизистой оболочки десны в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта // Фундаментальные исследования. — 2009. — №7. — С. 55.
12. Amin K. The role of mast cells in allergic inflammation // Respir. Med. — 2012. — Vol. 106. — P. 9-14.
13. Preethi P.L., Rao S.R., Madapusi B.T., Narasimhan M. Immunolocalization of Ki-67 in different periodontal conditions // J. Indian Soc. Periodontol. — 2014. — Mar. — 18 (2). — P. 161-5.
14. Осипова Ю.Л. Воспалительные заболевания пародонта при гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: прогнозирование течения и тактика ведения: дис. ... док. мед. наук. — 2015. — 260 с.
15. Шатских О.А. Морфологическая характеристика тимуса в условиях поступления мелатонина // О.А. Шатских: дис...канд. мед. наук. — 2015. — 172с.
16. Gunin A.G., Petrov V.V., Golubtzova N.N. et al. Age-related changes in angiogenesis in human dermis // Exp. Gerontol. — 2014. — Vol. 55. — P. 143-151.
