CC BY
25
УДК 577.151
ПРОИСХОЖДЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ СЕМЕЙСТВА CYP74 ЦИТОХРОМОВ Р450 ПО РЕЗУЛЬТАТАМ САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
Я.Ю. Топоркова1, Л.Ш. Мухтарова1, Ю.В. Гоголев2, А.Н. Гречкин1
(1лаборатория оксилипинов и 2группа молекулярной биологии Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН; e-mail: yanchens@yandex.ru)
Биоинформационный анализ и сайт-направленный мутагенез позволили идентифицировать детерминанты катализа ферментов CYP74 в центре I-спирали и ERR-триаде. Замены K302S и T366Y в алленоксидсинтазе LeAOS3 томата привели к появлению активности гидро-пероксидлиазы. Мутантные формы F284I, F287V, G288I, N285A и N285T гидропероксидлиа-зы MtHPL люцерны в отличие от фермента дикого типа, образовывавшего С^-альдокисло-ту, синтезировали С13- и Сц-фрагменты. Полученные данные подтверждают эволюционное происхождение разнообразия семейства CYP74 от единого предка, обладавшего активностью гидропероксидлиазы.
Ключевые слова: липоксигеназная сигнальная система, цитохромы Р450 семейства CYP74, рекомбинантные ферменты, сайт-направленный мутагенез.
В онтогенезе растений и в формировании у них ответа на стрессовые факторы важную роль играют ферменты липоксигеназной сигнальной системы, катализирующие образование окисленных производных жирных кислот (оксилипинов) [1—4] — липоксигеназы и цитохромы Р450 семейства CYP74, которое включает три типа ферментов: две дегид-разы — алленоксидсинтаза (АОС) и дивинилэфир-синтаза (ДЭС) и одна изомераза — гидропероксид-лиаза (ГПЛ).
Ранее были описаны три сайта в последовательностях ферментов CYP74, замены в которых приводили к изменению типа катализа: Phe295 и Ser297 у LeAOS3 томата [5] и Phe137 в АОС Ara-bidopsis thaliana (GenBank PDB: 3CLI) [6]. Две детерминанты [5] находятся внутри центрального домена I-спирали ("I-helix central domain", IHCD), соответствующего "кислород-связывающему" домену цитохромов Р450. IHCD ферментов CYP74 является вырожденным. В отличие от "классических" представителей суперсемейства Р450, таких как мо-нооксигеназы, ферменты семейства CYP74 не используют кислород в качестве субстрата, не зависят от систем транспорта электронов и катализируют превращения гидроперекисей жирных кислот. Два описанных сайта, соответствующие остаткам Phe [5, 6], необходимы для формирования типа катализа и консервативны у ферментов, катализирующих соответствующие реакции. Все обнаруженные на данный момент АОС содержат в обоих сайтах Phe, а ДЭС — Leu или Ile. ГПЛ содержат Phe в домене IHCD и Leu или Ile в сайте, описанном в работе [6].
В данной работе на основе сопоставления последовательностей консервативных для всех цитохромов Р450 доменов IHCD и ERR-триады, примыкающих непосредственно к гему, были выбраны дополнительные сайты для сайт-направленного мутагенеза в алленоксидсинтазе LeAOS3 томата (GenBank AF454634.1) и ряд сайтов в гидроперок-сидлиазе MtHPL люцерны (GenBank AJ316562.1). На основании полученных данных о сравнении каталитического действия ферментов дикого типа и их мутантных форм сделано предположение о происхождении всего существующего разнообразия ферментов семейства CYP74 цитохромов Р450.
Материалы и методы
Для наработки рекомбинантных плазмид, содержащих точечные мутации в генах leAOS3 и mtHPL, были сконструированы и синтезированы специфичные праймеры (НПО "Синтол"): в LeAOS3 K302S TCAATTCgTATggCggTTTgA gCgTgTTCTTCCCAT-CTTTgATC, D359R TTATgAAACCCTAAggATgCg-TCCTCCggTTCC ATTCCAA, T366Y gCgTCCTCC ggTTCCATTCCAATACgTTAAgGCTAgg, в MtHPL F284I CTTgTCTTCACgTTAgggaTCAACgCTTTTggTgg, N285T gTCTTCACgTTAgggTTCACCgC TTTTggTgg. Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью набора QukkChange (Invitrogene, США). Полученными плазмидами трансформировали штамм E. coli Rosetta-gami(DE3)pLysS. Рекомбинантные ферменты очищали с помощью металлоаффинной хроматографии, элюируя их 50 мМ раствором гистидина. Гидроперекиси жирных кислот получали инкубацией линолевой и а-линоленовой кислот с сое-
вой и томатной липоксигеназами. Эксперименты по изучению каталитического действия ферментов проводили по следующей схеме: (1) инкубация реком-бинантного фермента с гидроперекисью; (2) быстрая экстракция продуктов холодным гексаном; (3) их этерификация диазометаном; (4) восстановление или №В2Н4; (5) гидрирование над платиной; (6) упаривание растворителя в вакууме; (7) перерастворение в метаноле и выдерживание в течение 30 мин при 23°; (8) триметилсилирование. Продукты очищали с помощью ВЭЖХ и анализировали газовой хромато-масс-спектрометрией (ГХ-МС).
Результаты и обсуждение
К настоящему времени все более вероятным становится предположение о том, что предковый фермент СУР74 мог обладать активностью гидроперок-сидлиазы (гипотеза 1) [6]. Дупликация генов привела к возможности появления новых функций и появлению разнообразия ферментов семейства СУР74. Альтернативным является предположение, что пред-
ковый фермент СУР74 обладал некой иной активностью, нежели АОС, ГПЛ или ДЭС (гипотеза 2).
Мы в некоторой степени воспроизводим процесс возникновения точечных мутаций строго в выбранных нами сайтах с помощью сайт-направленного мутагенеза.
При инкубации ЬеЛ083 дикого типа с субстратом — 9-гидроперекисью линолевой кислоты (9-ГПОД) — основным продуктом был характерный для ЛОС а-кетол, выявленный в виде метилового эфира ТМС-производного, и ничтожно малое количество 9-оксононановой кислоты (9-оксо-9:0) в виде метилового эфира — продукта, характерного для ГПЛ, — что означает, что ЬеЛ083 дикого типа продуцирует 9-оксононановую кислоту в качестве минорного продукта (рис. 1, А).
Мутантные формы ЬеЛ083 также инкубировали с 9-ГПОД. Было показано, что все полученные мутантные формы ЬеЛ083 сохранили способность утилизировать 9-ГПОД. Однако наряду с а-кето-лом, появилось значительное количество 9-оксо-9:0 (рис. 1, Б-Д).
Л М1НР1- дикого типа 12-СН-12;0 (Ме/ТМС|
11-ОН-11;0 (М«'ТМС) /1 П-ОН.13:0 (Ме'ТМС)
Время удерживании. мин
Л(НР1_ мутантная форма Р2841
11-ОН-11 |МЛ;ТМС>
1
12-ОН-12:<) (Ме/ТНС)
А
Время удержи вам а л мин
М1НР1_ мутантная форма 62881
В
11 -ОНИ 1-0
|м«;гмс|
12-СН-12:0 (МеЯМС)
13-ОН-13'» |М(ЯМС|
А-
д.
Г» У) (| : ' ' н£а ' ' ;
Врем к удерживания, мин
МШРЬ мутантная форма N285А
"Ж
11ЮН-11:о (Ие.ТМС!
12-ОН-12-0 (Ме'ТМС) не выявляется 1
I
13-ОН-13:0|) (МеЯМС(
тЬ|' ' ' 'Г.' »V " IЪ ' 1 ' ТЙЗ ' ' Ь'и ' "1 1 ' ' ^
Время удгррниания. мим
М1НРЬ мутантная форма №85Т
„ 13-0и-13:0
(ГЛяТМС)
11-ОН-11:0 [Ме'ТМС I
4
12-ОН-120 {МеЯМС |
1
»Ь ' ■«« ' ' '.»Н I»'* ' ■ ' I.^ ' г* :'■;>" ' 1 'и';"
Время удерживания, мин
МШРЬ мутантная форма I Р287У
Е
12-ОН-12-0
(М»ЯМС( 13-ОН-13:0
11-ОН-11;0 \[ if.le.TMC)
|М*ЯМС) п
' ' 12: ' ' »Тэ ' ' ни ': V: 1 «'м ' ' '»'та П'н ' ' 1&1 ИМ и'тз им 1Г23
Время удерживания, мин
Рис. 1. Хроматограмма продуктов инкубации ЬеЛ083 дикого типа и ее мутантных форм с 9-ГПОД
Рис. 2. Хроматограмма продуктов инкубации 13-ГПОТ с МШРЬ дикого типа (А) и ее мутантными формами: Р2841 (Б), 02881 (В), Ш85Л (Г), N2857 (Д) и Р287У (Е)
Все четыре мутанта проявляли активность гид-ропероксидлиазы (изомеразы), тогда как алленок-сидсинтазная (дегидразная) активность была сильно снижена (8297А, К3028 и Т366У) или отсутствовала (Р2951).
Для получения дополнительных данных о зависимости между последовательностью ШСО и определенным типом катализа и поиска фактов в пользу гипотез 1 или 2 мы проверили действие мутант-ных форм гидропероксидлиазы МШРЬ люцерны: Р2841, Ь287У, Ш85А, 02881 и Ш85Т, инкубируя их с 13-гидроперекисью а-линоленовой кислоты (13-ГПОТ). В отличие от ГПЛ дикого типа, образовывавшей преимущественно С^-альдокислоту (рис. 2, А), (92)-12-оксододеценовую кислоту, мутанты МШРЬ синтезировали С13- и Сц-фрагмен-ты — (9^11^)-13-оксо-тридекадиеновую и (92)-11-оксоун-деценовую кислоты (рис. 2, Б—Е), что является результатом спонтанного а или р-разрезания и свидетельствует о нарушениях катализа.
У мутантной формы МШРЬ Ь2841 сайты, необходимые для формирования типа катализа, описанные ранее [5, 6], соответствуют таковым у ДЭС, поэтому, если верна гипотеза 2, то в качестве продуктов реакции должны были появиться дивиниловые эфиры по аналогии с мутантной формой АОС Ага-Ыйор$1$ ЛаИапа Ь137Ь [6], у которой данные сайты и продукты реакции соответствуют таковым у ГПЛ. Однако среди продуктов реакции дивиниловых эфи-ров обнаружено не было, что подтверждает гипотезу 1. У всех мутантов МШРЬ наблюдалось появление новых продуктов, однако не вследствие приобретения новой специфической активности.
Полученные нами результаты по сайт-направленному мутагенезу ЬеА083 также частично подтверждают эту гипотезу. Четыре мутации привели к появлению активности ГПЛ, но не ДЭС, как можно было ожидать в случае мутантов Ь2951 и В359Я, исходя из сопоставления первичных последовательностей. Видимо, для превращения АОС в ДЭС одной точечной мутации недостаточно. В отличие от этого для превращения АОС в ГПЛ нужна замена в любом каталитически важном сайте.
Мы предполагаем, что гидропероксидлиазная реакция по механизму является базовой, а алле-ноксидсинтазная и дивиниэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения этой базовой реакции из-за дополнительного влияния боковых групп определенных аминокислот. Результатом мутации в любом каталитически важном домене является устранение этого влияния в той или иной степени и, как следствие, возвращение к базовому типу катализа — гидропероксидлиаз.
Авторы выражают благодарность Р. Хьюзу, любезно предоставившему рекомбинантные плазми-ды, содержащие ген т1НРЬ дикого типа и его мутантов.
* * *
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 09-04-01023-а и 09-04-12222-офи_м), грантом по программе фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
CnHCOK nHTEPATyPbl
1. Blee E. Phytooxylipins and plant defense reactions // Prog. Lipid Res. 1998. Vol. 37. P. 33-72.
2. Grechkin A.N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway // Prog. Lipid Res. 1998. Vol. 37. P. 317-352.
3. Grechkin A.N. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. Vol. 68—69. P. 457—470.
4. Stumpe M, Feussner I. Formation of oxylipins by CYP74 enzymes // Phytochem. Rev. 2006. Vol. 5. P. 347—357.
5. Toporkova Y.Y., Gogolev Y.V., Muchtarova L.S., Grechkin A.N. Determinants governing the CYP74 catalysis: conversion of allene oxide synthase into hydroperoxide lyase by site-directed mutagenesis // FEBS Letters. 2008. Vol. 582. P. 3423—3428.
6. Lee D.-S., Nioche P., Hamberg M., Raman C.S. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosyn-thetic enzymes // Nature. 2008. Vol. 455. P. 363—370.
Поступила в редакцию 15.04.10
HYPOTHETICAL OF THE CYP74 FAMILY OF CYTOCHROMES P450 DIVERSITY BASED ON RESULTS OF SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Ya.Yu. Toporkova, L.Sh. Muchtarova, Yu.V. Gogolev, A.N. Grechkin
Bioinformatics analyses and site-directed mutagenesis enabled us to identify determinants of catalysis by CYP74 family enzymes in I-helix central domain and ERR-triad. Substitutions K302S and T366Y in tomato allene oxide synthase LeAOS3 led to hydroperoxide lyase activity appearance. Mutant forms F284I, F287V, G288I, N285A and N285T of alfalfa hydroperoxide lyase MtHPL,
unlike wild-type enzyme produced predominantly 02-aldoacid, synthesized С13- and СП-frag-ments. The data obtained confirm the evolutionary origin of CYP74 family diversity from a common ancestor with hydroperoxide lyase activity.
Key words: lipoxygenase signaling cascade, CYP74 family of cytochromes P450, recombinant enzymes, site-directed mutagenesis.
Сведения об авторах
Топоркова Яна Юрьевна — канд. биол. наук, мл. науч. сотр. лаборатории оксилипинов КИББ КазНЦ РАН. Тел. 8(843)231-90-35; e-mail: yanchens@yandex.ru
Мухтарова Люция Шакировна — науч. сотр. лаборатории оксилипинов КИББ КазНЦ РАН. Тел. 8(843)231-90-44; e-mail: lucia74@yandex.ru
Гоголев Юрий Викторович — канд. биол. наук, руководитель группы молекулярной биологии КИББ КазНЦ РАН. Тел. 8(843)231-90-35; e-mail: gogolev21@mail.ru
Гречкин Александр Николаевич — акад. РАН, зав. лабораторией оксилипинов КИББ КазНЦ РАН. Тел. 8(843)292-75-35; e-mail: grechkin@mail.knc.ru
