CC BY
55
Генетика сахарного диабета
Прогнозирование СД 1 типа в группах высокого риска
Т.В.Никонова, И.И. Дедов, JI.П. Алексеев, М.Н. Болдырева, О.М. Смирнова, И.В. Дубинкин*.
Эндокринологический научный центр I (дир. — акад. РАМН И. И.Дедов) РАМН, I *ГНЦ “Институт иммунологии” I (дир. - акад. РАМН P.M. Хаитов) М3 РФ, Москва. Я
В настоящее время наблюдается рост заболеваемости СД 1 типа во всем мире. Это обусловлено рядом факторов, в том числе увеличением продолжительности жизни больных диабетом вследствие улучшения диагностической и лечебной помощи, повышением фертильности и ухудшением экологических ситуаций. Уменьшить заболеваемость СД можно проведением профилактических мероприятий, прогнозированием и предупреждением развития болезни.
Предрасположенность к СД 1 типа генетически детерминирована [1, 12, 23, 32]. Заболеваемость СД 1 типа контролируется рядом генов: геном инсулина на хромосоме 11р15.5 (ЮОМ2), генами на хромосоме \\ц (ЮОМ4), 6ц (ЮОМ5) [12, 22, 23, 32]. Наибольшее значение из известных генетических маркеров СД 1 типа имеют гены области НЬА на хромосоме 6р 21.3 (ШОМ1); с ними связано до 40% генетической предрасположенности к СД 1 типа [8, 9, 20, 31]. Ни одна другая генетическая область не определяет риск развития заболевания, сравнимый с НЬА.
Высокий риск развития СД 1 типа определяют аллельные варианты генов НЬА: ОЯВ1*03,*04; ООА1 *0501 ,*0301, ООВ1*0201, *0302 [9, 20, 24]. 95% пациентов с 1 типом СД имеют ОЯ*3 или 011*4 антигены, а от 55 до 60% имеют оба антигена [21, 28, 35]. Аллель ООВ1*0602 редко встречается при СД 1 типа и считается протективным [25].
Клиническим проявлениям СД предшествует латентный период, характеризующийся присутствием маркеров островкового клеточного иммунитета [29]; эти маркеры ассоциированы с прогрессирующей деструкцией [3-клеток. Наличие генетических и иммунологических маркеров делает возможным проведение плановых исследований по доклинической диагностике СД 1 типа.
Наибольшее значение из известных типов аутоантител, являющихся иммунологическими маркерами
[5] СД 1 типа, имеют антитела к глутаматдекарбок-силазе (ГДК) и цитоплазме островковых клеток (АЦОК). Эти антитела высоко специфичны по отношению к р-клеткам, выявляются за несколько лет до появления первых симптомов СД. Антитела к ГДК обнаруживаются в эксперименте одновременно с развитием инсулита. АЦОК присутствуют в сыворот-
ке крови у 69-90% пациентов с впервые выявленным СД. У лиц без диабета с высоким титром АЦОК ежегодный риск развития заболевания составляет 9-10% [37] и даже 45% [27]. В общей популяции положительные титры АЦОК обнаруживаются редко; в Германии они выявлялись лишь у 1,05% школьников
[6], в Швеции - у 3% детей до 14 лет [15].
В 1990 г. ГДК (белок 64кс1) идентифицирована как один из основных антигенов при СД 1 типа [18]. По данным ряда авторов [2], у 5 из 7 детей, имеющих положительный титр антител к ГДК, развивается СД; 75% пациентов с СД 1 типа имеют антитела к ГДК; наличие аутоантител на предиабетической стадии достаточно стабильно (80%). Возможно, определение антител к ГДК является методом выбора при прогнозировании СД 1 типа (специфичность тестов достигает 100%) [3].
Риск развития СД взаимосвязан с количеством вариантов присутствующих маркерных антител. В исследованиях [10] показано, что комбинация двух и более видов антител представляет более эффективный уровень прогнозирования, чем наличие только одного вида антител.
В настоящее время рассматриваются два подхода к прогнозированию СД 1 типа [10] - прогнозирование в популяции с определением антител и прогнозирование в семьях с учетом генетической предрасположенности.
Во Франции кумулятивный риск заболевания СД 1 типа в общей популяции в возрасте до 20 лет составляет 0,1%, а у родственников больных СД I степени родства в возрасте до 20 лет -6.1%, т.е. в 60 раз превышает риск заболевания в популяции в целом [17]. В Дании кумулятивный риск для сибсов в возрасте до 30 лет составляет 6.4%, для потомков в возрасте до 34 лет- 6.3% [18]. В ряде других исследований заболевание родственников I степени родства колеблется от 5 до 19% [7, 30].
Таким образом, для членов семей с предшествующими случаями заболевания СД 1 типа прогнозирование болезни является особенно важным.
Целью настоящей работы явилось формирование групп высокого риска развития СД 1 типа в русской популяции жителей Москвы на основе изучения генетических, иммунологических и метаболических маркеров диабета с использованием семейного подхода.
Материалы и методы исследования
Обследовано 26 семей, в которых один из родителей болен СД 1 типа, из них 5 - “ядерных” семей (всего 101 человек). Количество обследованных членов семей колебалось от 3 до 10 человек. Больных СД 1 типа отцов - 13, больных СД 1 типа матерей также 13. Семей, в которых оба родителя были бы больны СД 1 типа, не было.
Обследовано 37 потомков больных СД 1 типа без клинических проявлений заболевания, из них 16 -женского пола, 21 - мужского. Возраст обследованных потомков колебался от 5 до 30 лет. Распределение обследованных потомков по возрасту представлено в табл. 1.
Таблица 1
Возраст обследованных детей (потомков)
Возраст (лет) Количество
0-4 0
5-9 12
10-15 17
16-19 5
20-24 1
25-30 2
В семьях с больными СД матерями обследовано 17 детей (8 девочек, 9 мальчиков), в семьях с больными диабетом отцами - 20 детей (8 девочек, 12 мальчиков).
Аутоантитела к (3-клеткам (ICA) определяли двумя способами: 1) на криосрезах поджелудочной железы человека I (0) группы крови в реакции непрямой иммунофлуоресценции; 2) в им-муноферментном тесте “ISLETTEST” фирмы “Biomerica”. Аутоантитела к инсулину (IAA) определяли в иммуноферментном тесте “ISLETTEST” фирмы “Biomerica”. Определение антител к ГДК проводилось с помощью стандартных наборов “Diaplets anti-GAD” фирмы “Boehringer Mannheim”.
Определение С-пептида проведено с помощью стандартных наборов фирмы “Sorrin” (Франция).
HLA-типирование больных СД и членов их семей выполнялось по трем генам: DRB1, DQA1 и DQB1 методом сиквенс-спе-''цифических праймеров с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили по методу R. Higuchi Н. Erlich (1989) с некоторыми модификациями: 0,5 мл крови, взятой с EDTA, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизи-рующего раствора, состоящего из 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис - НС1 pH 7,5, 5мМ MgC12, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер 2 раза промывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCI, 10 мМ Трис-НС1 pH 8,3, 2,5 мМ MgCI2, 0,45% NP-40, 0,45% Твина- 20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37“С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95“С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования либо хранили при -20"С. Концентрация ДНК, определенная по
флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла в среднем 50-100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин.
ПЦР проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 67мМ Трис-HCl рН=8,8, 2,5 мМ MgC12, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл желатина, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 ед термостабильной ДНК-полимеразы. Для предотвращения изменения концентраций компонентов реакционной смеси из-за образования конденсата реакционную смесь покрывали 20 мкл минерального масла (Sigma, USA).
Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (АО “ДНК-Технология”, Москва).
Типирование локуса DRB1 проводили в 2 этапа. Во время 1го раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках [11]; в 1-й пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1, во 2-й - пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8. В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера “МС2” с активным регулированием) был следующим: 1) 94°С - 1 мин.; 2) 94°С - 20 с (7 циклов), 67“С - 2 с; 92“С - 1 с (28 циклов); 65°С - 2 с.
Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на 2-м раунде при следующем температурном режиме: 92"С - 1 с (15 циклов); 64°С - 1 с.
Типирование локуса DQA1 проводилось в 2 этапа. На 1-м этапе использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, на 2-м - пары праймеров, ампли-фицирующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601.
Первый этап проводили по программе: 94“С - 1 мин.; 94°С - 20 с (7 циклов), 58"С - 5 с; 92“С - 1 с, 5 с (28 циклов), 56“С - 2 с.
Продукты амплификации 1-го этапа разводили в 10 раз и использовали на 2-м этапе: 93“С - 1 с (12 циклов), 62“С - 2 с.
Типирование локуса DQB1 также проводилось в 2 этапа; на 1-м использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1, температурный режим следующий: 94"С - 1 мин.; 94°С - 20 с. (7 циклов); 67“С - 5 с.; 93°С - 1 с (28 циклов); 65ЛС - 2 с.
На 2-м этапе использовали пары праймеров, амплифицирую-щие специфичности: *0201, *0301, *0302, *0303, *0304, *0305, *04, *0501, *0502, *0503, *0601, *0602/08; продукты 1-го этапа разводили в 10 раз и проводили амплификацию в режиме: 93"С - 1 с. (12 циклов); 67“С - 2 с.
Идентификацию продуктов амплификации и их распределение по длинам проводили в ультрафиолетовом свете (310 нм) после электрофореза в течение 15 мин либо в 10% ПААГ, 29:1 при напряжении 500В, либо в 3% агарозном геле при напряжении 300 В ( в обоих случаях пробег составлял 3-4 см) и окрашивания бромистым этидием. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.
Результаты и их обсуждение
Установлено, что в 26 семьях из 26 больных СД 1 типа родителей 23 человека (88,5%) являются носителями ассоциированных с СД 1 типа НLA-генотипов DRB1 *03- DQA1 *0501 - DQB1 *0201; DRB1 *04-DQAl *0301-DQB 1*0302 или их сочетаний (табл. 2). У 2 больных в генотипе присутствует аллель DQB 1*0201, ассоциированный с СД 1 типа; только у 1 больной этой группы обнаружен генотип DRB1 *01 /01, кото-
Таблица
Распределение генотипов среди больных СД 1 типа родителей
Генотипы, ассоциированные с СД 1 типа Число носителей Генотипы, не ассоциированные с СД 1 типа Число носителей
3/3 1 1/7 2
3/4 8 1/1 1
01?В 1 4/4 2 Э1?В 1 - -
3/Х 5 - -
4/Х 7 - -
Всего 23 (88.5%) Всего 3
0І?В1- РОАІ-РОВІ гаплотипы, обнаруженные у обследованных лиц
оігві ООАІ РОВІ
03 0501 0201
04 0301 0302
07 0201 0201
01 0101 0501
11 0501 0301
13 0103 0602-8
15 0102 0602-8
16 0102 0502/4
рый при популяционных исследованиях не был ассоциирован с СД 1 типа, мы не выделяли подтипы О К В1 *04 , хотя полиморфизм этого локуса может влиять на риск развития СД 1 типа [9, 34].
При генотипировании прямых потомков пациентов с СД 1 типа выявлено, что из 37 человек 30 (81%) унаследовали ассоциированные с СД 1 типа генотипы ОЯВ1*03, 011В1*04 и их сочетание, у 3 лиц в генотипе присутствуют ассоциированные с СД 1 типа аллели: у 1 - ООА 1*0501, у 2 пациентов -ООВ 1*0201. Всего 4 из 37 обследованных имеют нейтральный генотип по отношению к СД 1 типа.
Распределение генотипов потомков указаны в табл. 3. В ряде'работ отмечено, что больные СД 1 типа отцы чаще передают генетическую предраспо-
ложенность к диабету (в частности, НЬА-01*4-гено-типы) своим детям, чем матери [7, 19]. Однако исследование в Великобритании не подтвердило существенного влияния пола родителей на НЬА- зависимую предрасположенность у детей [4]. В нашей работе мы также не можем отметить подобной закономерности передачи генетической предрасположенности: от больных матерей ассоцированные с СД 1 типа НЬА-генотипы унаследовали 94% детей и от больных отцов - 85%.
СД, как известно, является мультигенным многофакторным заболеванием. В качестве факторов внешней среды, играющих роль триггера, рассматривается питание - потребление в грудном возрасте и раннем детстве белков коровьего молока [13]. Де-
Таблица 3
Распределение генотипов среди детей, родители которых больны СД 1 типа
Генотипы, ассоциированные с СД 1 типа Число носителей Генотипы, не ассоциированные с СД 1 типа Число носителей
3/3 2 1/7 2
4/3 4 1/13 1
0!*В 1 4/4 4 01*В 1 1/15 1
3/Х 12 1/1 1
4/Х 8 16/16 1
1/11 1
Всего 30 (81%) Всего 7 (19%)
4
2/21
ти с вновь выявленным диабетом имеют повышенные уровни антител к белку коровьего молока, р-лактоглобулину и бычьему сывороточному альбумину [26] по сравнению со здоровыми сибсами, что расценивается как независимый фактор риска развития СД.
В группе обследуемых детей из 37 человек только 4 были на грудном вскармливании до 1 года, 26 человек получали грудное молоко до 1,5-3 мес, 4 -до 6 мес, 3 были на молочных смесях с первых недель жизни. Из 5 детей с положительными антителами к р-клеткам 2 были на грудном вскармливании до 6 мес, 3 - до 1,5 - 3 мес; затем получали кефир и молочные смеси. Таким образом, 89% обследованных детей получали белки коровьего молока в грудном возрасте и раннем детстве, что может быть расценено как фактор риска развития СД у генетически предрасположенных лиц.
В обследуемых семьях у клинически здоровых потомков проведено определение цитоплазматических антител, аутоантител к инсулину и ГДК. Из 37 обследованных 5 детей оказались позитивными по наличию антител к р-клеткам, при этом все 5 являются носителями генетической предрасположенности к СД (табл. 4). У 3 из них (8%) обнаружены антитела к ГДК, у 1 — к АЦОК, у 1 - антитела к АЦОК
Таблица 4
Генотипы детей, позитивных по антителам к (3-клеткам
Генотип Число позитивных по антителам
детей
гдк АЦОК
ЭЯ 3/4 2 0
01? 4/Х 1 1
01* 3/Х 0 1
и инсулину. Таким образом, антитела к АЦОК имеют 5,4% детей, 2 ребенка с положительными антителами к ГДК являются потомками «ядерных» семей. Возраст детей на момент выявления антител указан в табл. 5. Для прогнозирования СД большое значение имеют уровни титра АЦОК: чем выше титр антител, тем больше вероятность развития СД, то же касается и антител к инсулину [16]. По данным литературы [11], высокие уровни антител к ГДК ассоциированы с более медленным темпом развития СД (10% в 4 года), чем низкие уровни (50% в 4 года), возможно, потому, что высокие уровни' антител к ГДК указывают на “предпочтительную” активацию гуморального иммунитета и в меньшей степени на активацию клеточно-опосредо-
Таблица 5
Возраст обследованных детей на момент выявления антител
Возраст обследованных детей (лет) Число детей, позитивных по антителам
5-9 1
10-15 3
16-19 1
20-24 0
25-30 0
Всего... 5
ванного иммунитета (СД 1 типа главным образом обусловлен клеточно-опосредованной деструкцией Р-клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами). Комбинация различных антител обеспечивает наиболее оптимальный уровень прогнозирования.
У детей с низкой массой тела при рождении (менее 2,5 кг) диабет развивается значительно раньше, чем у детей, родившихся с нормальной массой [14]. Из данных анамнеза обращает на себя внимание то, что из 5 детей с положительными антителами 2 родились с массой тела более 4 кг, 2 -менее 2,9 кг.
У прямых потомков больных СД 1 типа определен базальный уровень С-пептида, у всех этот показатель был в пределах нормы (в том числе и у детей с положительными антителами к Р-клеткам), исследование уровня стимулированного С—пептида не проводилось.
Выводы
1. Больные СД 1 типа в 88,5% случаев являются носителями генотипов ОЯВРОЗ, ООА1*0501, ВОВ1*0201, ОЯВ1*04, БОА1*0301, ЭОВ1*0302, или их сочетаний.
2. У детей из семей, где один из родителей болен СД 1 типа, в 89% случаев выявляется генетическая предрасположенность к СД (при наличии одного больного родителя), при этом 81% наследует полностью ассоциированные с СД 1 типа генотипы, что позволяет считать их группой очень высокого риска развития диабета.
3. Среди прямых потомков больных СД 1 типа, имеющих генетическую предрасположенность, положительные антитела к ГДК выявлены в 8% случаев, АЦОК - в 5,4% случаев. У этих детей необходимо диагностическое исследование титров антител, гликогемоглобина и изучение секреции инсулина.
«і/їм 5
*1 итература
1. Atkinson M.A., McLaren N.K. // N.Engl.J.Med.-l 994 -331. P.l 4281436.
2. Aanstoot H.J., Sigurdsson E., Jaffe M. et al // Diabetologia-1994-37.
P.917-924.
3. Baekkeskov S., Aanstoot H.J., Christgan S. et al // Nature-1 990-377.
P. 151-156.
4. Bain S.C., Rowe B.R., Barnett A.H., ToddJ.A. // Diabetes-1994-43(12). P. 1432-1468.
5. B/ng/ey P.J., Christie M.R., Bonifacio E., Bonfanti R., Shattock Mw Fonte M.T., Bottazzo C.F. // Diabetes-1 994-43. P. 1304-1310.
6. Boehn B.O., Manifras B., SeiblerJ. et al // Diabetes-1991-40. P.1435-1439.
7. Chern M.M., Anderson V.E., Barbosa J. // Diabetes-1982-31. P.l 1 151118.
8. Davies J.L., Kawaguchi Y., Bennett S.T. et al. // Nature-1994-371.
P. 130-136.
9. Erlich H.A., Rotter J.I., Chang J. et al. // Nature Gen.-1993-3. P.358-364.
10. Hahl J., Simell T., Ilonen J., Knip M., Simmel O. // Diabetologia-1 99841. P.79-85.
11. Harrison L.C., Honeyman M.C., DeAizpurua H.J. et al // Lancet-1993341. P.l 365-1369.
12. Hashimoto L., Habita C., Beresse J.P. et al. // Nature-1994-371. P.161-164.
1 3. Karjalainen J., Martin J.M., Knip M. et al // N.Engl.J.Med.-l 992-327. P.302-303.
14. Khan N., CouperT.T., // Diabetes Care-1994-17. P. 653-656.
15. Landin-OIsson M., Palmer J.P., Lernmark A. et al // Diabetologia-1992-40. P.l068-1 073.
16. Leslie R.D.C., Atkinson M.A., Notkins A.L. // Diabetologia-1999-42. P.3-14.
17. Levy-Marchal C., Dubois F., Neel M., TichetJ., Czernichow P. // Diabetes-1995-44. P.1029-1032.
1 8. Lorenzen T., Pociot F., Hougaard P., Nerup J. // Diabetologia-1994-37. P.321-321.
19. Lorenzen T„ Pociot F., Stilgren L. et al // Diabetologia-1998-41. P.666-673.
20. Nepom G., Erlich H.A. // Ann.Rev.Immunol.-1 991-9. P.493-525.
21. Nerup J., Mandrup-Poulsen T., Molvig J. // Diabetes Metab. Rev.-1987-3. P.779-802.
22. Owerbach D., Gabbay K.H. // Diabetes-1995-44.p.l 32-136.
23. PociotF. U Dan.Med.Bull.-l996-43. P.216-248.
24. Rewers M., Bugawan T.L., Norris J.M., Blair A. et al. // Diabetologia-1996-39. P.807-812.
25. Rei/onen H., Ilonen J., Knip N., Akerblom H. // Diabetes-1 991-40.
P. 1640-1644.
26. Saukkonen T., Virtanen S.M., Karppinen M. et al // Diabetologia-1998-41. P.72-78.
27. Schatz D., KrischerJ., Horne G. et al // J. Clin. Invest.-1994-93. P.2403-2407.
28. Spielman R.S., Baker L, Zmijewski C.M. // Ann. Hum. Genet.-1980-44. P. 135-150.
29. Thivolet C., Beaufrere B., Gebuhrer Y., Chatelain P., Orgiazzi J. // Diabetologia-1991 -34. P.l86-191.
30. Tillil H., Kobberling J.// Diabetes-1982-36. P.93-99.
31. ToddJ.A. U Proc. Natl. Acad. Sci. USA-1990-377. P.8560-8565.
32. ToddJ.A., Farral M. // Hum.Mol.Gen.-5. P.1443-1448.
33. Tuomilehto J., Zimmet P., Mackay I.R. et al // Lancet-1994-343.
P. 1383-1385.
34. Van der Anvera B., Van Waeyenberge C., Schuit F. et al. // Diabetes-1995-44. P.527-530.
35. Walker A., Gudworth A.G. // Diabetes-1980-29. P.1036-1039.
36. Warram J., Krolewski A.S., Gottlieb M., Kahn C.R. // N.Engl.J.Med.-1984-311. P.149-151.
37. Ziegler A.G., Herskowitz R.D., Jackson R.A. et al // Diabetes Care-1990-13. P.762-775.
