Профиль посттрансляционных модификаций гистона Н1 в хроматине эмбриональных стволовых клеток мыши Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 577.2

Профиль посттрансляционных модификаций гистона Н1 в хроматине эмбриональных стволовых клеток мыши

Т. Ю. Старкова1*, Т. О. Артамонова2, В. В. Ермакова1, Е. В. Чихиржина1, М. А. Ходорковский3, А. Н. Томилин1,3*

Институт цитологии РАН, лаборатория молекулярной биологии стволовых клеток, 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4, Россия

2Санкт-Петербургский государственный политехнический университет имени Петра Великого, Аналитический центр нано- и биотехнологий СПбГПУ, 195251, Санкт-Петербург, ул. Политехническая, 29, Россия

3Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург,

Университетская наб., 7-9, Россия

*E-mail: t.starkova@incras.ru, a.tomilin@incras.ru

Поступила в редакцию 01.03.2019

Принята к печати 29.04.2019

DOI: 10.32607/20758251-2019-11-2-82-91

РЕФЕРАТ Линкерный гистон Н1 - один из основных ядерных белков, принимающих участие в структурно-регуляторной организации хроматина. Ряд данных указывает на то, что посттрансляционные модификации Н1 способны модулировать активность хроматина. С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения (MALDI-FT-ICR-MS) мы обнаружили существенные различия в природе и положениях посттрансляционных модификаций в некоторых вариантах гистона Н1 (Н1.3—Н1.5) из эмбриональных стволовых клеток и дифференцированных клеток - иммортализованных фибробластов линии ШН/3Т3 и эмбриональных фибробластов (МЭФ). Так, метилирование К75 в вариантах Н1.2-1.4, метилирование К108, К148, К151, К152 К154, К155, К160, К161, К179 и К185 в Н1.1, а также К168 в Н1.2, фосфорилирование S129, Т146, Т149, S159, S163 и S180 в Н1.1, Т180 в Н1.2 и Т155 в Н1.3 идентифицированы исключительно в эмбриональных стволовых клетках. Большинство сайтов ацетилирования вариантов Н1.0 и Н1.2 в эмбриональных стволовых клетках расположены в С-концевых доменах, известных своим участием в стабилизации конденсированного хроматина. Полученные данные могут послужить основой для дальнейших исследований, направленных на анализ функциональной значимости посттрансляционной модификации гистона Н1 для процессов самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА двумерный электрофорез, линкерный гистон Н1, масс-спектрометрия, посттрансляционные модификации, эмбриональные стволовые клетки мыши.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ MALDI-FT-ICR-MS - масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием; ПТМ - посттрансляционные модификации; ЭСК - эмбриональные стволовые клетки; МЭФ - эмбриональные фибробласты мыши; Аи-РАОЕ - полиакриламидный гель, содержащий мочевину; SDS-PAGE - полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия; теК - метилирование лизина; асК - ацетилирование лизина; pS/T - фосфорилирование серина/треонина; МеЮ - метио-нинсульфоксид.

ВВЕДЕНИЕ

Архитектурные белки хроматина, такие, как гистон Н1, взаимодействуют с нуклеосомами без явной специфичности к последовательности ДНК, способствуя формированию локально и/или глобально измененной архитектуры хроматина [1-8]. Белки семейства гистонов Н1 человека и мыши представлены

семью соматическими подтипами (от Н1.0 до Н1.5 и Н1Х) и четырьмя уникальными вариантами (НИ, Н1Т2т, HILS1 и Н1оо), характерными для половых клеток [9-13]. Несмотря на высокую структурную консервативность, подтипы Н1 различаются эволюционной стабильностью, распределением в эухрома-тине/гетерохроматине и аффинностью связывания

хроматина, что может быть результатом посттрансляционных модификаций (ПТМ) [14-17].

Хроматин эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных клеток активно изучается в течение последних нескольких десятилетий в связи с огромным потенциалом использования ЭСК в биомедицине. За это время показано, что гетерохроматин ЭСК более «открыт», чем в дифференцированных клетках [18], и это свойство, приводящее к глобально повышенной транскрипции, может быть результатом снижения экспрессии белков Н1 [19] и ПТМ ядерных белков [18-20].

В рамках нашего исследования с помощью сочетания физико-химических и биологических подходов выявлены новые ПТМ гистона Н1, специфически присутствующие в хроматине ЭСК, но не в дифференцированных клетках мыши. Обсуждается возможная роль выявленных модификаций в струк-турно-регуляторной организации хроматина этих клеток.

Экстракция и разделение вариантов гистона Н1

Для сохранения интактных ПТМ белки Н1 выделяли из клеток напрямую (минуя стадию выделения ядер) с помощью 5% хлорной кислоты с последующим осаждением подкисленным ацетоном [7]. Варианты Н1 разделяли методом двухмерного гель-электрофореза в полиакриламидном геле [7, 8].

Ферментативный гидролиз и анализ MALDI-FT-ICR-MS

После проведения 2D-электрофореза фрагменты геля, содержащие ядерные белки, вырезали, измельчали и обрабатывали 40% ацетонитрилом в 0.1 М бикарбонате аммония при 37°С в течение 15 мин как описано ранее [7]. Биологические образцы анализировали в двух биологических и двух-

А

1 •

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Все процедуры на животных выполняли в соответствии с принципами гуманного использования лабораторных животных по стандартам, предписанным Американским физиологическим обществом. Работа с мышами выполнялась строго в соответствии с законодательными актами Российской Федерации о защите животных и была одобрена Советом по этике Института как гуманное использование лабораторных животных.

Эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) выделены из 13.5-дневных зародышей мыши после естественного спаривания животных. ЭСК мыши линии E14Tg2A приобретены в BayGenomics. Клеточная линия NIH/3T3 получена из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия).

Культивирование клеточных линий

Клетки NIH/3T3 и МЭФ культивировали в DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина/ стрептомицина [21, 22]. ЭСК культивировали в DMEM/F12 с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, L-глутамина, незаменимых аминокислот и лейкозингибирующего фактора (LIF) на обработанных желатином культуральных чашках. Клетки промывали PBS (pH 7.5), обрабатывали 0.05% трипсином (10 мин при 37°C) и собирали центрифугированием при 2000 g в течение 5 мин. Клеточный осадок с 6-8 чашек (d = 10 см) замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

2 3

г*'/

ЭТг и- у-

О" ,. • Ш

• 16 |Я

•17 . »

■а

23* 24.

i

• 21

.15 33

HI-

"32 " ji

и .. Ji

Рис. 1. 2D-электрофорез обогащенных Н1 экстрактов клеток NIH/3T3 (А), МЭФ (Б) и ЭСК (В). Варианты Н1 идентифицированы в пяти фракциях (обозначены 2-4, 6-7 в А), семи фракциях (4-10 в Б) и восьми фракциях (15-18, 20-21, 30-31 в В) клеток МН/3Т3, МЭФ и ЭСК соответственно. Остальные белковые фракции описаны в табл. S1 [25]

Б

B

50 <Ù 45 ^ 40

Í 35

и

0 зо

S 25

и

1 20 ф

!Е 15 * 10

5 0

1578.7849 № 2

"М

800

1548.7896 1520.7594 I 1476.7940 1340.7764 1326.7661

<U 25 ^

¡5 20

и О

1/0 .I

2299.1802 946.0246

1 j Ji, L

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

m/z

№ 3

1578.7885 2299.1800

1639.9377

1340.7776 1326.7654

1228.6787 1212.6851 1198.6688

ill

i

1706.8848 llll.llljl

35

<и 30

25

.û

I—

и О 20

I

m

x 15

и

i

<u 10

I—

I

X 5

1520.7597 1340.7754

228.6790 355

35

<u 30

-Û 25

I—

и

0 I 20

CQ

X

и 15

I

<u

I—

I 10

X

5

0

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

m/z

№ 6

1212.685

7746 7746

1706.8813

576.8415

1692.8682

J..

994.0780 2074.1246

8.78951639.9 1706.8

Juju

2012.1345 2042.0401 1857.9687

80

70

<u

60

-Û I— 50

и

0

I 40

CQ

X

и 30

I

<u

I— I 20

X

10

0

1454.7196 1438.7230

1346.7070 1013.5729 1343.6776 986.6350 1301.6682

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

m/z

i Lili_L_L-Lt ' If >

1400 1600

m/z № 7

1800 2000 2200

75.7 575.7

2104.0426 839.0335

■lili h Ы 1

1400 1

m/z

1800 2000 2200

Рис. 2. Масс-спектры подтипов гистона Н1 хроматина клеток МН/3Т3. Номер спектров соответствует номеру пятна на 2D-электрофореграмме. Подробное описание содержания белков в каждом пятне приведено в табл. ^ [25]

30

0

800

800

800

трех аналитических повторностях. Масс-спектры регистрировали в режиме положительных ионов в диапазоне 500-3000 м/z с использованием масс-спектрометра MALDI-FT-ICR (Varían 902-MS), оснащенного сверхпроводящим магнитом 9.4 Тл и УФ-лазером (Nd: YAG) [7]. Спектры анализировали с использованием программных пакетов Mascot (www.matrixscience.com; Matrix Science, Лондон, Великобритания) и Protein Prospector MS-Fit (http://prospector.ucsf.edu) как описано ранее [7].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Целью нашей работы было сравнение ПТМ лин-керных гистонов H1 из дифференцированных и эмбриональных стволовых клеток мыши. Варианты гистона H1 мы разделяли с использованием сочетания AU-PAGE с SDS-PAGE, что особенно оправдано в случае идентификации заряженных кислотно-растворимых белков, включая гистоны [7, 8, 23, 24]. На рис. 1 представлены результаты 2D-электрофоретического разделения вариантов H1 хроматина из двух типов дифференцированных клеток, иммортализованных

фибробластов мыши линии NIH/3T3 и первичных эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), а также плюрипотентных клеток мыши (ЭСК линии E14Tg2A). В результате анализа электрофоре-грамм мы идентифицировали в клетках NIH/3T3 пять фракций, содержащих варианты Н1 (рис. 1A), семь фракций в МЭФ (рис. 1Б) и восемь в ЭСК (рис. 1В). Оставшиеся фракции включают белки семейства HMG (High Mobility Group) и другие ядерные белки (табл. S1 [25]). Результаты MS-анализа H1 представлены в табл. S2 [25] и на рис. 2-4. Обнаружены и проанализированы шесть изоформ H1 (H1.0—H1.5). Идентифицированные ПТМ подтипов H1 из NIH/3T3, МЭФ и ЭСК представлены в таблице и на рис. 5. На рис. 5 дополнительно представлены ранее идентифицированные ПТМ гистона H1 из тимуса мыши [7].

Метилирование

Гистоны H1 - одна из основных групп ядерных белков хроматина, которые участвуют в продольном уплотнении реплицирующейся хромосомы [24]. В хроматине ЭСК на одну нуклеосому приходится

1578.7853 1548.7863

1356.7741 1340.7762 1228.678; 1212.6839 811.3948

^ 853.4485 ! 969.6082

, «4

№ 5

85

[..Л;!

0 1500 17

т^

692.8687 706.8820

857.9710 857.9710

100 дЗ 90 80 70

о 60

0

1 50

2012.1326 № 6

2042.042^

750 2000 2250

1520.7590 1490.7490 1340.7771 1326.7666

1212.68 858.46581198.669 811.3948 ■ Г1-V-11-

1706.8854 1986.0705

Ь ,

^80 .0 70

о 60

0

1 50

2170.1388

л!

5 30

!Е 20 * 10 0

1500 1750 2000 2250

т^

1228.6793 1198.6701 973.6037

■ их I

548.7907

1986.0656 974.0549 946.0233

012.1389 26| , 2170.1379

2299.1827

|

11

1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500

т^

90

40

750

750

750

100

<и 90

80

.0 ь 70

и

О 60

I

т 50

х

и I 40

<и

ь 30

I

X 20

10

0

№ 8

1454.7199 1438.7233

837.4214

1057.5642

1326.7650 198.6697

»-V

750

98.6697 5642

578.7889

2299.1928 1857.9708

m/z

100

<и 90

80

.0 70

ь

и О 60

I

ш 50

X

и 40

I

<и ь 30

I

X 20

10

0

1457.719 1438.7232 1235.6643 107.5672

6,17;!26.774^ I706.88 8

ЦЩ,!,^

№ 9

1500 1750

т^

.к,, у

1 00

<и 90

^80

д 70

ь

и п 60

50

т

\

и 40

±

(и 30

± X 20

10

0

2000 2250 2500

1490.7474 1326.7636 1198.6691 1166.6177 1057.5640 973.6036 837.4211

750

№

1500 1750

m/z

750 2000

750

2000 2250

Рис. 3. Масс-спектры подтипов гистона Н1 хроматина клеток МЭФ. Номер спектров соответствует номеру пятна на 2D-электрофореграмме. Подробное описание содержания белков в каждом пятне приведено в табл. S1 [25]

0.5 молекулы Н1 (суммарно всех подтипов), что примерно в 2 раза ниже, чем в хроматине дифференцированных клеток [26]. Истощение линкерного гистона Н1 приводит к снижению степени компактизации хроматина, уменьшению глобального расстояния между нуклеосомами и снижению степени ПТМ некоторых гистонов, таких, как метилирование [26].

Сравнительный анализ ПТМ вариантов Н1 из клеток ШН/3Т3, МЭФ и ЭСК выявил снижение степени метилирования вариантов Н1.4 и Н1.5 в ЭСК по сравнению с дифференцированными клетками (рис. 5). Идентифицированные сайты метилирования белков Н1 расположены, в основном, в области глобулярного домена в положениях К34/К35, К63/65 и К73/75 в зависимости от варианта Н1 (таблица).

Большинство выявленных нами таких ПТМ, как теК63/64, в вариантах Н1.2-Н1.4, теК47 в Н1.3, теК97 в Н1.2, теК117 в Н1.2 и теК27 в Н1.5 уже описаны ранее [7, 8, 10-12]. Считается, что метилирование в этих положениях защищает аминогруппы лизинов, вызывая увеличение сродства гистона к ДНК и облегчение перехода хроматина в локально репрессированное состояние [7, 8]. Помимо описанных выше ПТМ, мы идентифицировали метилиро-

вание К75 вариантов Н1.2-1.4 исключительно в ЭСК (рис. 5, табл. S2 [25]), расположенное в глобулярном домене Н1, которое также может приводить к защите аминогруппы лизина в этих клетках.

Потенциальные сайты метилирования К108, К148, К151, К152, К154, К155, К160, К161, К179 и К185 в Н1.1, К168 в Н1.2 также идентифицированы исключительно в клетках ЭСК, тогда как метилирование К202 и К204 в Н1.4 - только в дифференцированных клетках ШН/3Т3 и МЭФ. Большинство из этих ПТМ расположены в мотивах ^/Т)РХК или ^/Т) PXZ (где Х - любой аминокислотный остаток) вблизи фосфорилированных серинов и треонинов Н1. Потенциальная роль этих модификаций рассмотрена в разделе «Фосфорилирование».

Ацетилирование

Согласно нашим данным, общий уровень ацетили-рования Н1 в ЭСК оказался выше, чем в дифференцированных клетках (рис. 5). Как и ожидалось, мы идентифицировали несколько сайтов ацети-лирования в ^концевом и глобулярном доменах Н1 (таблица). В большинстве случаев точная биологическая роль этих модификаций не установ-

ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | АСТА ЫАТиИАЕ | 85

00

90

<и 80

70

.0

ь и 60

0

I 50

т

х и 40

I

<и 30

ь

I

X 20

10

0

2042.0395 1993.9763

2012 1791.7287

1707.7747 1475.7719 1383.6899

" 1235.5308

1033.5153 '493.7?61

Ш! [

. ди

№ 15

40

. 35

ф

30

0

1 20

№ 16

548.7845 № 17

611.7866

1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000

т^

1707.7709 1610.7906 1475.7706 1383.6902 1340.7767

1500 1750 2000 2250 2500

т^

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750

т^

2012.9761

- 40-

80

2042.0398 № 21

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000

т^

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000

т^

000 1250 1500 1750 2000 2250 2500

т^

2042.0147 2012.1121

1250 1500

т^

80 70 60

^

.0 50 ь

и

° 40 т

¡5 30 I

<и

!Е 2°-х

10 0

№ 31

98.6687

340.778

1093.553 845.5092 811.39

11.3945

1212.6 1212.6

6844

2012.1388

2042.0413

1

1250 1500

m/z

Рис. 4. Масс-спектры подтипов гистона Н1 хроматина ЭСК. Номер спектров соответствует номеру пятна на 2D-электрофореграмме. Подробное описание содержания белков в каждом пятне приведено в табл. Б1 [25]

25

750

2000

лена. Ацетилирование одного из наиболее изученных сайтов - асК34-Н1.4, является отличительным признаком промоторов транскрипционно активных генов и помогает привлекать к промоторам комплекс инициации транскрипции TFIID [27]. Однако мы не обнаружили асК34-Н1.4 ни в одном из исследованных типах клеток. В то же время мы наблю-

дали метилирование в этой позиции варианта Н1.4 в ШН/3Т3 и МЭФ, но не в ЭСК. Мы предполагаем, что деметилирование К34-Н1.4 ЭСК может способствовать ацетилированию в этом сайте и облегчать рекрутирование транскрипционного фактора TFIID к промоторным областям. Кроме того, согласно нашим данным, Н1 ЭСК характеризуется наличием

Потенциальные ПТМ вариантов гистона Н1 хроматина МН/3Т3, МЭФ и ЭСК. Модификации, выделенные жирным шрифтом, описаны ранее [8]

Клетки H1 Модификации Положение сайта модификации

ацетилирование K12, К132, К136, К137, К149

H1.0 метилирование K139, K155, K156

фосфорилирование S135, T153

ацетилирование K17

H1.1 метилирование K116, K121, K125

фосфорилирование S2, S115, T120

ацетилирование K17

H1.2 метилирование K46, K63, K90, K97, K117, K121

NIH/3T3 фосфорилирование S2, S41, S89, T96, S113

H1.3 ацетилирование K17

метилирование K47, K64

ацетилирование K17

H1.4 метилирование K34, K46, K63, K195, K197, K200, K202, K205

фосфорилирование T18, S36, S41, T45

ацетилирование K17, K26, K12, K180

H1.5 метилирование K27, K31, K51, K62, K63, K74

фосфорилирование S18, T25, S40, S57, S111, T121, T132

ацетилирование K12, K180, K182, K184, K188

H1.0 метилирование K14, K69, K73

фосфорилирование S66, T84, S185

ацетилирование K17, K22, K23, K29

H1.1 метилирование K35, K116, K121, K125

фосфорилирование T24, S115, T120, S123

ацетилирование K17, K153, K156, K157, K159, K206, K210

H1.2 метилирование K21, K22, K46, K106, K117, K121, K148

МЭФ фосфорилирование S2, S41, T154, T173

ацетилирование K17

H1.3 метилирование K47, K64

фосфорилирование T18

ацетилирование K17

H1.4 метилирование K34, K46, K63, K195, K197, K200, K202, K205

фосфорилирование S36, S41, T45, S204

ацетилирование K17, K26, K143

H1.5 метилирование K27, K31, K45, K62, K74, K134, K144, K147, K191, K193

фосфорилирование S111, T132, T149, S192

H1.0 ацетилирование K12, K17, K20, К121, К122, К125, К127, К136, К137, К147, К148, К149, К155, К184, К188

ацетилирование K17, K83, K87, K133, K134, K136, K137, K144, K167, K168, K183

H1.1 метилирование K108, K116, K148, K151, K152, K154, K155, K160, K161, K179, K185

фосфорилирование T24, S88, S115, T120, S123, S129, T146, T149, S159, S163, S180

ацетилирование K17, K81, K122, K127, K130, K149, K153, К156, К157, K172, K175, K176, K178

H1.2 метилирование K46, K63, K75, K121, K148, K168

ЭСК фосфорилирование T154, S173, T180

ацетилирование K17, K154, K157, K158

H1.3 метилирование K47, K64, K75

фосфорилирование T155

H1.4 ацетилирование K17

метилирование K46, K63, K75

H1.5 ацетилирование K17

метилирование K45, K74

acK83 и acK87 в H1.1 и acK81 в H1.2. Снижение положительного заряда в этой области вследствие ацети-лирования аминогруппы остатков лизина может привести к дестабилизации взаимодействий H1 с ДНК и, в свою очередь, способствовать образованию локально релаксированного состояния хроматина.

Образование «открытого» хроматина также может облегчаться ацетилированием остатков лизина в С-концевых областях вариантов H1.1—H1.3. Более того, большинство из этих C-концевых ЭСК-специфичных сайтов ацетилирования и метилирования вариантов H1.1—H1.3 расположены в мотивах (S/T)PXK или (S/T)PXZ вблизи фосфорилирован-ных остатков серина и треонина. Их потенциальная биологическая роль и механизм регуляции взаимодействия Н1-ДНК, опосредуемый ацетилировани-ем/метилированием лизинов в мотивах (S/T)PXK или (S/T)PXZ, более подробно обсуждаются в разделе «Фосфорилирование».

Фосфорилирование

Нами идентифицирован ряд сайтов фосфорили-рования гистонов H1, таких, как T24, S115, T120 и S123 в H1.1, S2, S41, T154 и T173 в H1.2, характерных как для дифференцированных клеток, так и для ЭСК. В то же время несколько потенциальных сайтов фосфорилирования подтипов Н1 выявлено исключительно в ЭСК: S129, T146, T149, S159, S163 и S180 в H1.1, T180 в H1.2 и T155 в H1.3 (рис. 5, табл. S2 [25]). Идентифицированные сайты фосфо-рилирования расположены в основном в С-концевых доменах H1, в том числе в мотивах (S/T)PXK и (S/T) PXZ (рис. 5), которые фосфорилируются во время митоза и модулируют тем самым состояние хроматина [15, 28-34]. Вопрос о функциональной связи фос-форилирования и/или его отсутствия в ряде сайтов других подтипов H1 с поддержанием плюрипотент-ности ЭСК и способностью дифференцировки этих клеток остается пока открытым.

Известно, что фосфорилирование S173 (H1.2) и S187 (H1.4), происходящее во время интерфазы, необходимо для релаксации хроматина и активации транскрипции [15, 30-32]. Принимая во внимание тот факт, что эти остатки серина лежат в пределах областей, структурно напоминающих так называемые участки с механизмом двоичного метилирования/ фосфорилирования (methyl-phospho switch regions) коровых гистонов, метилирование K172 H1.2 в ЭСК может способствовать фосфорилированию соседнего S173. В свою очередь, pS173 может стимулировать ацетилирование K172, приводящее к активации транскрипции.

Мы идентифицировали несколько спаренных ПТМ, таких, как meK148/pT149-H1.1

и meK179/pS180 (H1.1 в ЭСК), meK191/pS192 (H1.5 в МЭФ), которые расположены в основном в C-концевых областях белков (рис. 5). Их структурная организация также напоминает области meth-yl-phospho switch regions основных гистонов. Один из примеров данного типа регуляции - сайт K9/S10 в гистоне H3 [35-38]. Регуляторное состояние сайта K9/S10 характеризуется стабильным meK и динамическим фосфорилированием остатка S/T, который находится вблизи K. Фосфорилирование S10 и S28 в H3 приводит к ацетилированию в K9 и K27 соответственно, что способствует активации транскрипции [39].

Кроме того, мы также идентифицировали ряд сайтов ацетилирования/фосфорилирования, включая acK17/pT18 (H1.4 и H1.5 в клетках NIH/3T3), acK17/pT18 (H1.3 в МЭФ), acK23/pT24 (H1.1 в МЭФ), acK184/pS185 (H1.0 в МЭФ), acK153/pT154 (H1.2 в МЭФ и ЭСК), acK154/pT155 (H1.3 в ЭСК) и acK172/pS173 (H1.2 в ЭСК). Эти области ацетилиро-вания/фосфорилирования характерны как для ЭСК, так и для дифференцированных клеток. Их структурная организация также напоминает области methyl-phospho switch regions за исключением того, что метилирование изменяется на ацетилиро-вание. Возможно, что и в данном случае мы имеем дело с участками methyl-acetyl-phospho switch-регуляции, рассмотренными выше [40, 41], и ацетилирование этих сайтов также может приводить к активации транскрипции. Однако эта гипотеза требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Цитруллирование

Ранее было показано, что цитруллирование H1.2-H1.4 в R54 способствует приобретению и поддержанию состояния плюрипотентности клеток [42]. Фактически это проявляется в нарушении связывания H1 с хроматином, что вызывает формирование «открытого» состояния хроматина. Цитруллирование - это процесс замены аргинина на цитруллин, которое приводит к смещению пика пептида ERSGVSLAALK на 0.9844 м/z в масс-спектрах. Мы наблюдали смещенный пик низкой интенсивности в области 1131.64 м/z, однако вероятность его правильного отнесения составляет 9.8 ppm. При анализе спектров мы не учитывали пики свыше 3.0 ppm. Таким образом, мы не можем точно показать, имеет ли место цитруллирование R54 в наших образцах H1.2-H1.4 из ЭСК.

Формилирование

Известно, что H1.2 в положениях K63-K85 и K97 в тканях мыши, но не в хроматине иммортализо-ванных клеточных линий, может подвергаться фор-

Рис. 5. Потенциальные ПТМ вариантов Н1 из клеток МН/3Т3, МЭФ и Е14

I- ацетилирование лизина

- метилирование лизина/аргинина I - фосфорилирование треонина

s - фосфорилирование серина ¡2 - окисление метионина

- Глобулярный домен белка

- S/PTXK-мотив

милированию [43]. Мы также не идентифицировали сайты формилирования Н1 в изученных нами клеточных линиях. Роль данной ПТМ неизвестна, но предполагается, что формилирование может катализироваться неким специфическим ферментом во время деметилирования остатков лизина аминоксидазой LSD1 [44].

Окисление

Нами идентифицирован сайт окисления метиони-на до метионинсульфоксида МеЮ [45] в положении М31 гистона Н1.0 дифференцированных клеток, но не в ЭСК (табл. 2S [25]). Положение остатков М в белках часто способствует образованию гидрофобных связей между их атомами серы и кольцами ароматических остатков триптофана, фенилаланина или тирозина [46]. Эти гидрофобные серно-кольце-вые связи создают структурную стабильность белков, примерно равную стабильности ионного солевого мостика [46]. Взаимодействие с М устанавливает оптимальное положение, необходимое для обеспечения антиоксидантной защиты ароматических аминокислот. Окисление метионина до МеЮ разрушает эту гидрофобную связь и может влиять на формирование нормальной трехмерной структуры белка. Окисленные белки характеризуются повышенной гидрофобностью поверхности [47], что коррелирует с возрастным увеличением содержания МеЮ [45]. Отсутствие сайтов окисления Н1 в ЭСК согласуется с неограниченным потенциалом самообновления этих клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленном исследовании проведено сравнение потенциальных сайтов ПТМ гистона Н1 в дифференцированных и эмбриональных стволовых клетках мыши. Выявлено сходство общих уровней метилиро-вания/ацетилирования Н1.3-Н1.5, природы и положения посттрансляционных модификаций гистонов Н1.3-Н1.5 в ЭСК и дифференцированных клетках. При этом уровни ацетилирования Н1.0 и Н1.2 в ЭСК (в дополнение к ранее известным фактам о снижении уровня их экспрессии в хроматине ЭСК [20]) в целом выше, чем в гистонах дифференцированных

клеток (pис. 5). Большинство потенциальных сайтов ацетилирования H1.0 и H1.2 в ЭСК расположены в С-концевых доменах белков, а именно в областях 97-121 и 145-169. Эти области локализованы в двух известных субдоменах С-концевого фрагмента, участвующих в стабилизации конденсированного хроматина [20, 48]. Уменьшение положительного заряда N- и C-концевых областей белков H1 может ослабить взаимодействие Н1-ДНК на входе/выходе ДНК из коровой частицы и предотвратить взаимодействие H1 с регуляторными белками хроматина, такими, как HMGN и HMGB1/2 [49, 50]. Известно, что белки HMGB1/2 способны вытеснять гистон H1 из ДНК-белкового комплекса и тем самым облегчать ремо-делирование нуклеосомы, обеспечивая доступность ДНК для факторов транскрипции [51]. Смещение H1 из нуклеосомы должно привести к образованию «открытой» структуры хроматина, что свойственно стволовым клеткам.

Таким образом, открытая структура хроматина плюрипотентных стволовых клеток может формироваться как путем снижения общего уровня экспрессии H1, так и в результате посттрансляционных модификаций вариантов H1.0 и H1.2, приводящих к нарушению их связывания с ДНК и, как следствие, к образованию хроматина с более рыхлой структурой. Биологическая роль наиболее известных в настоящее время модификаций H1 пока не ясна. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить индивидуальные и совокупные роли этих ПТМ. Эти знания помогут нам глубже понять молекулярные процессы, лежащие в основе функционирования хроматина плюрипотентных клеток. •

Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 18-04-01199). MALDI-масс-спектрометрический анализ белков H1 проводили с использованием научного оборудования ЦКП«Аналитический центр нано- и биотехнологий СПбГПУ» на базе ФГАОУ

ВО «СПбПУ» при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. White A.E., Hieb A.R., Luger K. // Sci. Rep. 2016. V. 6. № 19122. P. 1-14.

2. Ausio J. // Bioessays. 2015. V. 37. P. 46-51.

3. Crane-Robinson C. // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1859. № 3. P. 431-435.

4. Song F., Chen P., Sun D., Wang M., Dong L., Liang D., Xu R.M., Zhu P., Li G. // Science. 2014. V. 344. № 6182. P. 376-380.

5. Zhou B.R., Jiang J., Feng H., Ghirlando R., Xiao T.S., Bai Y. //

Mol. Cell. 2015. V. 59. № 4. P. 628-638.

6. Chikhirzhina E., Starkova T., Polyanichko A. // Biophysics. 2018. V. 63. № 6. P. 858-865.

7. Starkova T.Y., Polyanichko A.M., Artamonova T.O., Khodorkovskii M.A., Kostyleva E.I., Chikhirzhina E.V., Tomilin A.N. // Phys. Biol. 2017. V. 14. P. 016005.

8. Kowalski A., Paiyga J. // Gel Electrophoresis - Principles and Basics. 2012. V. 8. P. 117-136.

9. Parseghian M.H., Newcomb R.L., Hamkalo B.A. // J. Cell.

Biochem. 2001. V. 83. P. 643-659.

10. Happel N., Doenecke D. // Gene. 2009. V. 431. P. 1-12.

11. Izzo A., Kamieniarz K., Schneider R. // Biol. Chem. 2008. V. 389. P. 333-343.

12. Fyodorov D.V., Zhou B.R., Skoultchi A.I., Bai Y. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2018. V. 19. P. 192-206.

13. Millan-Arino L., Izquierdo-Bouldstridge A., Jordan A. // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1859. P. 510-519.

14. Khochbin S. // Gene. 2001. V. 271. P. 1-12.

15. Talasz H., Sapojnikova N., Helliger W., Lindner H., Puschen-dorf B. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 32236-32243.

16. Ponte I., Vidal-Taboada J.M., Suau P. // Mol. Biol. Evol. 1998. V. 15. P. 702-708.

17. Th'ng J.P., Sung R., Ye M., Hendzel M.J. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 27809-17814.

18. Serrano L., Vazquez B.N., Tischfield J. // Exp. Biol. Med. 2013. V. 238. P. 259-270.

19. Meshorer E., Yellajoshula D., George E., Scambler P.J., Brown D.T., Misteli T. // Dev. Cell. 2006. V. 10. № 1. P. 105-116.

20. Terme J.M., Sese B., Millan-Arino L., Mayor R., Izpisua Belmonte J.C., Barrero M.J., Jordan A. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 35347-35357.

21. Liskovykh M., Chuykin I., Ranjan A., Safina D., Popova E., Tolkunova E., Mosienko V., Minina J., Zhdanova N., Mullins J., et al. // PLoS One. 2011. V. 11. P. e27345.

22. Liskovykh M., Ponomartsev S., Popova E., Bader M., Kouprina N., Larionov V., Alenina N., Tomilin A. // Cell Cycle. 2015. V. 4. № 8. P. 1268-1273.

23. Goldknopf I.L., Busch H. // Physiol. Chem. Phys. 1975. V. 7. P. 23-30.

24. Maresca T.J., Heald R. // Cell Cycle. 2006. V. 5. P. 589-591.

25. https://drive.google.com/open?id=15hmp5ku-JHzy3PXW8vAtHk13jYt97Fty

26. Fan Y., Nikitina T., Zhao J., Fleury T.J., Bhattacharyya R., Bouhassira E.E., Stein A., Woodcock C.L., Skoultchi A.I. // Cell. 2005. V. 123. № 7. P. 1199-1212.

27. Kamieniarz K., Izzo A., Dundr M., Tropberger P., Ozretic L., Kirfel J., Scheer E., Tropel P., Wisniewski J.R., Tora L., et. al. // Genes Dev. 2012. V. 26. № 8. P. 797-802.

28. Dou Y., Gorovsky M.A. // Mol. Cell. 2000. V. 6. P. 225-231.

29. Chadee D.N., Taylor W.R., Hurta R.A., Allis D., Wright J., Davie J. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 20098-20105.

30. Sarg B., Helliger W., Talasz H., Forg B., Lindner H. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 6573-6580.

31. Harshman S.W., Young N.L., Parthun M.R., Freitas M.A. //

Nucl. Acids Res. 2013. V. 41. № 21. P. 9593-9609.

32. Liao R., Mizzen C.A. // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1859. P. 476-485.

33. Alexandrow M.G., Hamlin J.L. // J. Cell Biol. 2005. V. 168. P. 875-886.

34. Strunnikov A.V., Hogan E., Koshland D. // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 587-599.

35. Daujat S., Zeissler U., Waldmann T., Happel N., Schneider R. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 38090-38095.

36. Lachner M., Jenuwein T. // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. V. 14. P. 286-298.

37. Li Y., Danzer J.R., Alvarez P., Belmont A.S., Wallrath L.L. // Development. 2003. V. 130. P. 1817-1824.

38. Ayyanathan K., Lechner M.S., Bell P., Maul G.G., Schultz D.C., Yamada Y., Tanaka K., Torigoe K., Rauscher F.J. III // Genes Dev. 2003. V. 17. № 15. P. 1855-1869.

39. Rossetto D., Avvakumov N., Cote J. // Epigenetics. 2012. V. 10. P. 1098-1108.

40. Cheung P., Tanner K.G., Cheung W.L., Sassone-Corsi P., Denu J.M., Allis C.D. // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 6. P. 905-915.

41. Chadee D.N., Hendzel M.J., Tylipski C.P., Allis C.D., Bazett-Jones D.P., Wright J.A., Davie J.R. // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 24914-24920.

42. Christophorou M.A., Castelo-Branco G., Halley-Stott R.P., Oliveira C.S., Loos R., Radzisheuskaya A., Mowen K.A., Ber-tone P., Silva J.C., Zernicka-Goetz M., et al. // Nature. 2014. V. 507. № 7490. P. 104-108.

43. Wisniewski J.R., Zougman A., Krüger S., Mann M. // Mol. Cell. Proteomics. 2007. V. 6. № 1. P. 72-87.

44. Shi Y., Lan F., Matson C., Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., Shi Y. // Cell. 2004. V. 119. P. 941-953.

45. Kim G., Weiss S.J., Levine R.L. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1840. P. 901-905.

46. Valley C.C., Cembran A., Perlmutter J.D., Lewis A.K., Labello N.P., Gao J., Sachs J.N. // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. № 42. P. 34979-34991.

47. Chao C.C., Ma Y.S., Stadtman E.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 2969-2974.

48. Lu X., Hansen J.C. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 8701-8707.

49. Roque A., Ponte I., Suau P. // Chromosoma. 2016. V. 1859. P. 510-519.

50. Murphy K.J., Cutter A.R., Fang H., Postnikov Y.V., Bustin M., Hayes J.J. // Nucl. Acids Res. 2017. V. 45. P. 9917-9930.

51. Stros M. // Biochim. Biophys. Acta. 2010. V. 799. P. 101-113.