CC BY
25
УДК: 612.4.05; 612.33;612.018.2
ПРОДУКЦІЯ СУПЕРОКСИДУ В ТОНКІЙ КИШЦІ ЩУРІВ ПРИ ГІПО- ТА ППЕРМЕЛАТОНШЕМШХ
У тонкій кишці щурів 30-добова (цілодобове освітлення 1000-1500 лк) гіпомелатонінемія сприяє збільшенню продукції супероксиданіонрадикалу від фагоцитарних електронно-транспортних ланцюгів, а 30-добова (утримання щурів у темряві та пероральне введення мелатоніну у щоденній дозі 1 мг/кг маси тіла) гіпермелатонінемія - від мітохондріального окиснення, що відповідає антиоксидантним властивостям мелатоніну. Витік супероксиду з мікросомального електронно-транспортного ланцюга окиснення в обох випадках не змінювався.
Ключові слова: тонкий кишечник, супероксиданіонрадикал, гіпомелатонінемія, гіпермелатонінемія.
Біологічне значення мелатоніну зараз дуже активно досліджується («мелатоніновий бум», навіть створено журнал «Journal of Pineal Research»). Мелатонін має антистресову, антиканцерогенну, антигеріатричну, антиоксидантну дії. Мелатонін синтезується для усього організму в епіфізі та для локальної дії в клітинах APUD-системи. В епіфізі синтез проходить тільки тоді, коли на очі не потрапляє світло. Мелатонін є нейромедіатором, імуностимулятором, гормоном, який має майже на всіх клітинах організму три типи мембранних рецепторів, що діють крізь аденілатциклазну або кальцієву месенджерні системи, та ядерні рецептори, що впливають на експресію більш ніж 250 генів. Як нейромедіатор, він має сомногенні властивості, сприяє секреції Г АМК, активує проведення нервових імпульсів. Як імуностимулятор, він активує поділ стовбурових клітин червоного кісткового мозку, стимулююче регулює тимус та лімфоцити. Як гормон, він впливає на секрецію рілізингів гіпоталамусу та блокує тропіни гіпофізу, особливо гонадотропінів, інгібує проліферацію більшості стовбурових клітин [1; 9], проявляє властивості непрямого антиоксиданту шляхом активації експресії генів антиоксидантних ферментів. Мелатонін сам є також прямим антоксидантом, який діє ароматичним ядром та воднем аміногрупи [3; 14].
Прооксидантно-антиоксидантна система складається з генерації активних форм кисню, які ініціюють неферментативне вільно-радикальне пероксидне окиснення біополімерів, що лімітується антиоксидантним захистом. Найбільш слабка активна форма кисню - супероксиданіонрадикал (супероксид), але з нього утворюються більш сильніші (пероксиди водню, сінглетний кисень, гідроксилрадикал). Утворюється супероксид: 1) реакцією катіонів металів змінної валентності з відновниками та О2, 2) при функціонуванні флавінових та гемових оксидаз, 3) витіком з мітохондріальної та мікросомальної електронно-транспортних ланцюгів, 4) цілеспрямовано при неспецифічному імунному захисті з фагоцитів (дихальний вибух). У крові нейтрофіли (а також моноцити) мають НАДФН-оксидазу (електронно-транспортний ланцюг НАДФН ^ ФАДН2 ^ цитохром 558 нм за довжиною хвилі світопоглинання або -245 мв за потенціалом), яка з О2 утворює одноелектронним переносом супероксид. Активується ланцюг через кальцієву месенджерну систему. У тканинах при запаленнях діють нейтрофіли, яких на другій фазі запалення замінюють макрофаги, що в нормі містяться в тканинах, як нащадки моноцитів.
Макрофаги містять ксантиноксидазу. Ксантиноксидаза - димер, містить 2 або 3 субодиниці, в кожній з яких є ФАД, залізо-сірчаний кластер Fe2-S2, птерин, багато цистеїнів для дисульфидних містків між субодиницями, молібден, причому Мо+5 має зв'язки - два з ФАД, два з птерином, один з сіркою цистеїну, можливо одну з групою -S-SH. Ксантиноксидаза формується з ксантиндегідрогенази лімітованим протеолізом кальційзалежною протеїназою або окисненням дисульфідних містків, переважно при гіпоксії. Окиснення заліза у FeS-центрі дає супероксид; ФАД дегідрує субстрат, даючи активний семіхінон. ФАД дегідрує навіть воду, утворюючи гідроксилрадикал і ФАДН2; останній відновлює супероксид у Н2О2. Електрон ФАД може відновлювати залізо, а два гідроксилрадикали сполучаються у Н2О2. Мо+5 віддає електрон на Н2О2 з розщепленням її на •ОН і ОН-, Мо+6 зв'язує ОН- та гідроксилює субстрат, віддаючи •ОН та окислюючись до Мо+5. Оскільки (молярно) на 2 FeS приходиться 1 ФАД і 1 Мо, то супероксиду генерується в надлишку [12].
Там, де існує можливість бактеріального забруднення з негативними наслідками, багато макрофагів та підвищена активність ксантиноксидази (молоко, сироватка крові, печінка та особливо тонкий кишечник). Але не досліджені джерела та кількість генерованого у тонкому кишечнику супероксиду при гіпомелатонінемії та гіпермелатонінемії [2; 6].
Метою роботи було визначення джерел та кількості супероксиданіонрадикалу в тонкій кишці при гіпо-та гіпермелатонінеміях.
Матеріал та методи дослідження. Дослідження проводились на щурах-самцях Вістар (3 групи по 5 тварин, середня маса 160 г), які утримувались у стандартних умовах віварію при сталій температурі і вологості повітря, вільному доступі до води і їжі. Перша група - інтактна, що витримувалася при світловому режимі: 12 годин темнота - 12 годин світло терміном 30 діб. У другої групи для моделювання гіпомелатонінемії тварини утримувались в режимі постійного освітлення (1000-1500 люкс) 30 діб. У третьої групи гіпермелатонінемія
моделювалася введенням мелатоніну в харчовий раціон дозою 1 мг/кг маси тіла/добу та цілодобовою темрявою 30 діб [7]. Сезон дослідження - піздня весна, коли секреція мелатоніну середня між максимумом взимку та мінімумом у літку [11]. Тварин виводили з експерименту здійснюючи одномоментну декапітацію під кетаміновим наркозом (40,0 мг/кг маси тіла).
Джерела та кількість супероксиду визначали за НСТ-тестом [13]. Принцип методу полягає у відновленні водорозчинного жовтого нітросинього тетразолію (НСТ) супероксидом у гранули синього формазану який елююється сумішшю диметилсульфоксиду з хлороформом. Інтенсивність забарвлення оцінюється при 540 нм на фотоелектроколориметрі. Результат виражали у нмоль •О2-1/г/хв. Для визначення джерел проводили стимуляцію: НАДН - для мітохондріального окиснення, НАДФН - для мікросомального окиснення, пірогеналом (або продігіозаном, зимозаном) - для фагоцитарного окиснення. Визначалася також відностна маса тонкої кишки [8]. Отримані цифрові дані обробляли методами варіаційної статистики для малих виборок з використанням для оцінки ймовірності різниць середных для окремих груп даних за критерієм Стьюдента. За статистично достовірні вважали зміни при р<0,05, а значення р в межах 0,1 - 0,05 вважали тенденцією до достовірності [5. По [4], якщо обсяг сукупності менший за 20 варіант, то слід використовувати розподіл Стьюдента.
Результати дослідження та їх обговорення. Отримані дані в результаті дослідження наведені в таблиці. При порівнянні однакових за терміном дії гіпомелатонінемії та гіпермелатонінемії виявилось, що при гіпомелатонінемії відносна маса тонкої кишки у 1,8 рази менше чим при гіпермелатонінемії (р2 < 0,001). Майже у двічі відносна маса тонкої кишки при 30-денній гіпомелатонінемії менша за умовну норму. На 10% з тенденцією до достовірності коефіцієнт маси тонкої кишки при гіпомелатоніемії менше за умовну норму, що можливо оцінити, як наслідок дисбалансу продукції мелатоніну.
Таблиця
Величини показників відносної маси тонкої кишки і кількості продукції з супероксиданіонрадикалу від
різних джерел
Показники, М±т Норма Гіпомелатонінемія Гіпермелатонінемія
Відносна маса тонкої кишки,% 4,83 ± 0,20 2,36 ± 0,14 рі < 0,001 4,31 ± 0,22 р1 < 0,1, р2 < 0,001
НАДН - стимульований (мітохондріальне окиснення) вихід супероксиду нмоль •О2"і/г*хв 21,67 ± 12,50 27,59 ± 4,74 19,40 ± 2,31 р2 < 0,1
НАДФН - стимульований (мікросомальне окиснення) вихід супероксиду нмоль •О2"і/г*хв 26,47 ± 2,30 24,92 ± 5,97 27,60 ± 3,38
Пірогенал - стимульований (фагоцитарне окиснення) вихід супероксиду нмоль •О2"і/г*хв 6,47 ± 0,71 8,13 ± 0,59 рі < 0,1 6,49 ± 0,37 р2 < 0,05
Примітка: рі відноситься до значень норми, р2 - порівняння гіпо- та гіпермелатонінемії
Як видно з результатів дослідження, тонка кишка виявилась відносно стійкою за генерацією супероксиду до дії гіпо- та гіпермелатонінемії. Але в умовах гіпомелатонінемії пірогенал стимулює збільшення на 26% викиду супероксиданіонрадикалу з макрофагів лімфатичних вузлів тонкого кишечника та нейтрофілів капілярної крові з тенденцією до достовірності. Враховуючи, що в макрофагах джерелом супероксиду являється ксантиноксидаза, можна припустити Са-залежну активацію переходу ксантиндегідрогенази в активну ксантиноксидазу при зниженні продукції мелатоніну епіфізом. Не виключена можливість дії мелатоніну місцевої продукції. При гіпермелатонінемії продукція супероксиду з мітохондріального окислення в 1,4 рази менше, ніж при гіпомелатонінемії, але з тенденцією до достовірності. Це вказує на суттєву антиоксидантну активність мелатоніну та можливе зниження рівня мітохондріального окиснення. Генерація супероксиду з мікросомального окислення практично однакова в нормі, гіпо- та гіпермелатонінемії. Стимульований пірогеналом дихальний вибух фагоцитів фактично проявився при гіпомелатонінемії, де продукція супероксиду в 1,3 рази більше (р2<0,05). Тому фагоцитарна продукція супероксиду в тонкій кишці при гіпермелатонінемії, хоча і відповідає нормі, але на 20% (р2<0,05) менше значенню аналогічного показника при гіпомелатонінемії. Мабуть в нормі і при гіпермелатонінемії мелатоніну досить для пригноблення не стимульованої активності фагоцитів. Можна передбачити, що при гіпермелатонінемії можливе блокування якихось ланок регуляції прооксидантно-антиоксидантної системи. Враховуючи, що надлишок та нестача біологічно активної речовини може давати суттєві порушення регуляції метаболізму, можливо солідаризуватися з думкою [10], що зміни величин показника при високій біологічній значущості його, тенденція до достовірності (р<0,1), слід розглядатися як достовірність.
У////Пудс(/?^//////////////////////////////////////////////////
У тонкій кишці хронічні гіпомелатонінемія сприяє збільшенню продукції від фагоцитарних електронно-транспортних ланцюгів, а гіпермелатонінемія - від мітохондріального окиснення, що відповідає антиоксидантним властивостям мелатоніну.
1. Анисимов В.Н. Мелатонин: роль в организме и применение в клинике. -СПб: Система, 2007. -40 с.
2. Анисимов В.Н., Кветной И.М., Комаров Ф.И., Малиновская Н.К., Рапопорт С.И. Мелатонин в физиологии и патологии желудочно-кишечного тракта. -М.: Советский спорт, 2000. -184 с.
3. Барабой В.А. Антиокислительная и биологическая активность мелатонина // Укр. біохім. журн. -2000. -Т.72, N3. -С.5-11.
4. Деркач М.П., Гумецький Р.Я., Чабан М.Є. Курс варіаційної статистики. -Київ: Вища школа, 1977. -208 с.
5. Г.Ф.Лакин. Биометрия. - Москва: Высшая школа, 1968. -293 с.
6. Малиновская Н.К. Мелатонин в лечении язвенной болезни двнеадцатиперстной кишки //Мелатонин в норме и патологии / Под ред. Ф.И.Комарова, С.И.Рапопорта, Н.К.Малиновской, В.Н.Анисимова. -М.: ИД МЕДПРАКТИКА, 2003. - Гл. 9., С. 147-162.
7. Пішак В.П. Шишкоподібне тіло і біохімічні основи адаптації. -Чернівці: Медакадемія, 2003. -152 с.
8. Посібник з експериментальних клінічних досліджень в біології та медицині / Беркало Л.В., Бобович О.В., Гейко О.О., [та інш.]. -Полтава, 1997. -271 с.
9. Смирнов А.Н. Ядерные рецепторы мелатонина // Биохимия. -2001. -Т.66, N1. -С. 28-36.
10. Проблема нормы в токсикологии / И.М.Трахтенберг, Сова Р.Е., Шефтель В.О. [та інш.]. -М.: Медицина, 1991. -208 c. -C.42-43.
11. Турчина С.И., Шляхова Н.В. Сезонные ритмы продукции мелатонина и иммунореактивности у здоровых детей. -Всероссийская научно-практическая конференция 50 лет мелатонину: итоги и перспективы исследований, Тезисы докладов, СПб, 2008.- С. 41].
12. Цебржинский О.И. Некоторые аспекты антиоксидантного статуса // Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза. -Полтава, 1992. -С. 120-155.
13. Цебржинский О.И. Количественное определение супероксида НСТ-тестом в тканях // Тези доповідей науково-практичної конференції "Організація токсикологічної допомоги в Україні". -Київ, 2002. - С. 65-66.
14. Reiter R.J. Melatonin: Lowering the High Price of Free Radicals // News Physiol. Sci. -2000. -Vol. 15. -P.246-250.
ПРОДУКЦИЯ СУПЕРОКСИДА В ТОНКОЙ PRODUCTS OF SUPEROXIDE IN THE THIN
КИШКЕ КРЫС ПРИ ГИПО- И BOWEL OF RATS AT HYPO- AND
ГИПЕРМЕЛАТОНИНЕМИЯХ HYPERMELATONINEMIYA
Анасевич Я.М., Цебржинський О.И. Anasevich Ya.M., Cebrzhins’kiy O.I.
В тонкой кишке крыс 30-суточная гипомелато- In a small intestine of rats each 30 days
нинемия способствует увеличению продукции hypomelatoninemiya conducted production of increasment супероксиданионрадикала от фагоцитарных электоронно- of superoxidanion radical from chains of powered and транспортных цепей, а 30-суточная (содержание крыс в transported fagocyte, and each 30 days (the maintenance of темноте и пероральное введение мелатонина в ежедневной rats in the dark and perorals melatonin introducted in a дозе 1 мг/кг массы тела) гипермелатонинемия - от daily dose of weight of 1 mg/kg) hypermelatoninnemiya is митохондриального окисления, которая отвечает from mitochondrial oxidation which is answers antioxidant антиоксидантным способностям мелатонина. Выход to abilities of melatonin. Exit of superoxid from супероксида из микросомальной электронно-транспортной microsoming and power-transport chain of oxidation was цепи окисления в обоих случаях не изменялся. not changed in both cases.
Ключевые слова: тонкий кишечник, Keywords: small intestines, super-
супероксиданионрадикал, гипомелатонинемия, гипер- oxidanionradical, hypomelatoninnemiya, hypermela-мелатонинемия. toninnemiya.
Стаття надійшла 16.11.10 р.
УДК: 611.018.5.013.8:611-018.53:615.014.41
ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ КОРДОВОЙ КРОВИ НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ, ПОДВЕРГНУТЫХ ГИПОТЕРМИЧЕСКОМУ ХРАНЕНИЮ
Полученные результаты обосновывают перспективу включения низкомолекулярной фракции кордовой крови и Актовегина в состав восстанавливающих сред после гипотермического хранения лейкоцитов для повышения их фагоцитарной активности.
Ключевые слова: кордовая кровь, актовегин, лейкоциты.
Работа выполнена согласно плану НИР ИПКиК НАН Украины в отделе биохимии холодовой адаптации по теме № 21 "Використання низьких температур для виділення біологічно активних низькомолекулярних компонентів (менше 5 кДа) з кордової крові тварин з метою отримання ранозагоюючих препаратів" (№ДР 0105и003917).
Совершенствование технологии хранения лейкоконцентрата до трансфузии представляет большой интерес для медицинской практики [14, 7]. Хранение лейкоцитов в условиях гипотермии (+4°С) является одним из доступных и простых методов для широкого применения в трансфузиологии [6]. Накопленный опыт свидетельствует о том, что жизнеспособность лейкоцитов в условиях положительных температур (при +4°С)
