CC BY
73
УДК 612 . 017 .11+593. 9
А. Н. Сухачев, И. В. Кудрявцев1, Д. С. Романюк, В. В. Кумейко2,
А. Д. Харазова, А. В. Полевщиков^
продукция активных форм кислорода гемоцитами различных фракций АСЦидии иаьосумтша риврияЕАЕ*
1 ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург;
2 Институт биологии моря им . А . В . Жирмунского ДВО РАН, Дальневосточный государственный университет, Владивосток
Введение. Способность к продукции активных форм кислорода — одно из универсальных свойств фагоцитов позвоночных и беспозвоночных животных . Циркулирующие фагоциты являются основным эффекторным звеном врожденного иммунитета — самой древней системы защитных реакций, характерных для всех групп животных. Наиболее подробно данная система изучена у млекопитающих, среди лейкоцитов которых самыми активными фагоцитами являются нейтрофилы и макрофаги, иногда их еще называют «профессиональными фагоцитами» . Синтез активных форм кислорода протекает исключительно в фагосомах этих клеток, при этом ключевое место в запуске данного каскада реакций занимает фермент NADPH-оксидаза [4]. В результате серии реакций происходит формирование токсичных для микроорганизмов кислородных радикалов, таких, как супероксид-анион О2-, гипохлорит С10-, синглетный кислород Ю2, пероксинитрит-анион ONOO- и перекись водорода Н2О2 . Эти активные формы кислорода взаимодействуют с поверхностью патогена, что приводит к нарушению структуры клеточной мембраны и целостности покровов и вызывает гибель микроорганизмов [6] . Циркулирующие клетки беспозвоночных помимо фагоцитоза принимают участие в весьма широком спектре реакций, к числу которых можно отнести участие в реакциях тромбообразования, инкапсуляции и многих других, что говорит об их многофункциональности. Вместе с тем из всего разнообразия активных форм кислорода, характерных для позвоночных, у беспозвоночных обнаружены только супероксид-анион и пероксид водорода [10, 11, 18]. Исключение составляют лишь морские звезды, целомоциты которых способны синтезировать еще и пероксинитрит [8] . По-видимому, способность фагоцитирующих клеток беспозвоночных к синтезу токсичных для микроорганизмов активных форм кислорода занимает одно из ключевых мест в системе защитных реакций этих животных Исследование общих закономерностей организации защитных реакций различных таксонов животных позволяет с новых позиций подойти к вопросам о причинах возникновения и об эволюционной значимости существования в рамках единого организма двух «параллельных» защитных систем — систем врожденного и приобретенного иммунитета
При анализе становления системы защитных реакций высших позвоночных традиционно особое внимание уделяется оболочникам, занимающим промежуточное положение между
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 07-04-00084, 07-04-10038, 07-04-00095 и 04-08-00111).
© А. Н . Сухачев, И . В . Кудрявцев, Д. С . Романюк, В . В . Кумейко, А. Д . Харазова, А. В . Полевщиков, 2008
позвоночными и беспозвоночными животными. На основании исследования генома некоторых представителей данной группы (Ciona intestinalis, Botryllus schlosseri) было показано, что ас-цидии обладают широким набором генов, кодирующих как рецепторные, так и эффекторные молекулы врожденного иммунитета, в том числе и NADPH оксидазу, супероксиддисмутазу и миелопероксидазу [16] . В ходе экспериментов in vitro было показано, что гемоциты как колониальных (B. schlosseri), так и одиночных (H. roretzi) асцидий способны к синтезу супероксид-аниона и пероксида водорода [1, 5] . Достоверное увеличение продукции этих молекул было зарегистрировано только при наличии в культуральной среде объектов фагоцитоза (бактерии, частицы зимозана), тогда как в случае других контактных реакций, например реакции алло-генного распознования, продукция активных форм кислорода не наблюдалась [1]
До настоящего времени нет единого мнения о том, какие же клетки отвечают за синтез активных форм кислорода у асцидий, равно как и не существует единой классификации гемоцитов у асцидий. В наиболее общем виде гемоциты асцидий принято разделять на три основных типа: гранулоциты, макрофагоподобные и лимфоцитоподобные клетки. При этом в составе каждого типа можно выделить несколько групп клеток. Так, на основании окраски гранул, гранулоциты подразделяются на азурофильные, базофильные и эозинофильные клетки, причем среди последних выделяют морулярные клетки и эозинофильные гранулоциты . Способность к фагоцитозу, который, однако, не сопровождается синтезом активных форм кислорода, сильно выражена у эозинофильных гранулоцитов [13]. Вместе с тем в составе гранул морулярных клеток обнаружены компоненты фенолоксидазной системы и ферменты, обладающие пероксидазной активностью [7] . Функции базофиль-ных гранулоцитов точно не определены . Основной функцией макрофагоподобных клеток является поглощение инородных частиц при этом лизис поглощенных микроорганизмов осуществляется в них посредством генерации кислородных радикалов [5], тогда как в эозинофильных амебоцитах уничтожение бактерий происходит при помощи антибактериальных пептидов, входящих в состав гранул [12] . Что же касается лимфоцитоподобных гемоцитов, то эти клетки традиционно рассматриваются в качестве стволовых и не принимают прямого участия в элиминации патогена [9] .
Материалы и методы исследования. Объектом исследования послужили розовые асцидии Halocynthia purpureae (H. auranthum) (Urochordata, Ascidiacea: Pyuridae), собранные в августе 2007 г. на базе «Восток» Института биологии моря ДВО РАН . Всего в экспериментах было использовано более 100 животных возрастом 4-6 лет. Гемолимфу с циркулирующими клетками получали путем пункции субэпидермального синуса и собирали в пробирки объемом 15 мл (Sarstedt, USA) . С целью предотвращения коагуляции клеток в пробирки добавляли раствор ЭДТА («Нева-Реактив», Россия) на фильтрованной морской воде (ФМВ), получая финальную концентрацию ЭДТА 30 мМ. Полученные образцы гемолимфы мягко центрифугировали при 100g в течение 10 мин при 4 °С, отмывали раствором Дальбекко без Ca2+ и Mg2+, содержавшим 34 г/л NaCl («ПанЭко», Россия) . Осадок использовали для фракционирования клеток и постановки НСТ-теста .
Для получения фракций гемоцитов клеточную суспензию в объеме 1 мл наносили на охлажденные до 4 оС фазы диатризоата натрия (MP Biochemicals Inc, USA) . Градиент формировали в центрифужных пробирках (Sarstedt, USA) путем последовательного наслоения растворов диатризоата натрия в концентрациях 30, 25, 20 и 10 % на искусственной морской воде (3,4 г NaCl в 100 мл дистиллированной воды, pH 7,4) . Центрифугирование осуществляли при 100 g в течение 10 мин при 4 оС . На интерфазе гемолимфа — 10%-ный раствор диатризоата натрия оседали разрушенные клетки, первая фракция гемоцитов была обнаружена на границе градиентов 10 и 20 %, вторая — на границе 20 и 25 % диатризоата натрия, а третья фракция — на границе 25 и 30 % диатризоата натрия . Образовавшиеся фракции гемоцитов снимали с интерфаз, отмывали охлажденным до 4 °С раствором Дальбекко без Ca2+ и Mg2+ в течение
5 мин при 100 g . Полученные клетки переводили в свежий холодный раствор Дальбекко без Ca2+ и Mg2+ и хранили на льду до использования .
Для определения числа гемоцитов 20 мкл суспензии клеток разных фракций смешивали со 180 мкл 0,1%-ного раствора кристалл-виолета на ФМВ, получая финальное разведение подкрашенной суспензии клеток в 10 раз . Подсчет проводили в гемоцитометре Горяева при увеличении 200х . Каждую пробу просчитывали дважды и на основании среднего значения вычисляли количество клеток в 1 мл суспензии Для оценки кислородного метаболизма гемоцитов асцидии H. purpureae базовой методикой служил автоматизированный НСТ-тест в спонтанной и индуцированной модификациях . Для экспериментов использовали полную культуральную среду, составленную на основе модифицированной питательной среды RPMI-1640, содержащей 34 г/л NaCl, 10 мМ HEPES, 2 % телячьей эмбриональной сыворотки,
2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (все реактивы — «ПанЭко», Россия) . Для определения спонтанного показателя к 100 мкл клеточной суспензии в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (Sarstedt, USA) добавляли по 50 мкл ФМВ, а для определения индуцированного показателя НСТ-теста — равный объем стимуляторов, в качестве которых использовали 0,2%-ную суспензию зимозана А (Saccharomyces cerevisiae, «Нева-Реактив», Россия) в ФМВ, либо 0,2%-ную суспензию латексных микросфер (диаметр 1,5 мкм, «ПанЭко», Россия) в ФМВ или раствор ЛПС S. typhimurium (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток, Россия) в финальной концентрации 50 мкг/мл на ФМВ . Каждую пробу ставили не менее чем в двух параллелях. Далее во все лунки добавляли по 50 мкл 0,2%-ного раствора пара-НСТ (Merck, Germany) . После внесения всех реагентов планшеты инкубировали в течение
4 или 6 ч при 16 °С . По завершении инкубации надосадок удаляли, лунки дважды промывали избытком ФМВ, образцы фиксировали этанолом . Полного растворения гранул диформазана НСТ достигали внесением 120 мкл 2М КОН («Нева-Реактив», Россия) и 140 мкл ДМСО («Нева-Реактив», Россия) . Спектроскопию проводили на многоканальном спектрофотометре ПИКОН («Пикон», Россия) при X = 620 нм. Результат выражали в единицах оптической плотности (ед ОП)
При адаптации метода к новому модельному объекту был осуществлен подбор оптимальных условий инкубации гемоцитов с раствором НСТ. Для этого при постановке экспериментов были использованы следующие концентрации гемоцитов: 1 • 106, 2-106 и 4-106 гемоцитов в 1 мл . Кроме того, сравнивали два срока инкубации — 4 и 6 ч
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакетов программ Excel, STATISTICA 5 . 0 . Итоговые результаты экспериментов выражали в форме средней арифметической и ее ошибки Для определения статистически значимых различий между независимыми группами нормально распределенных данных использовали i-критерий или Z-критерий .
Результаты исследования. Результаты адаптации автоматизированного НСТ-теста для исследования продукции активных форм кислорода гемоцитами асцидии H. purpureae приведены в табл 1 В ходе серии экспериментов было показано, что оптимальным временем инкубации клеток является 6, а не 4 ч . В ходе 4-часовой инкубации гемоцитов досто-
Таблица 1
Результаты адаптации автоматизированного НСТ-теста для исследования продукции активных форм кислорода гемоцитами асцидии Halocynthia purpureae по времени инкубации и числу клеток в культуре, X±s, n > 15 по каждой точке, ед. ОП (I = 620 нм)
Время Число клеток ФМВ 0,2%-ная суспензия зимозана Раствор ЛПС, 50 мкг/мл 0,2%-ная суспензия латекса
4 ч 1-105 0,133±0,014 0,146±0,012 0,135±0,018 0,173±0,022
2-105 0,193±0,027 0,215±0,022 0,193±0,036 0,277±0,050
4-105 0,267±0,033 0,322±0,028 0,315±0,048 0,368±0,047
6 ч 1-105 0,202±0,015 0,239±0,013 0,168±0,010 0,292±0,027**
2-105 0,269±0,017 0,343±0,021** 0,256±0,025 0,433±0,038***
4-105 0,371±0,030 0,470±0,032* 0,394±0,038 0,567±0,041***
Примечание. Здесь и далее, *, **, *** — различия с контрольными образцами (спонтанная продукция активных форм кислорода) достоверны прир < 0,05, р < 0,01 и р < 0,001 соответственно по Г-критерию Стьюдента.
верных различий между контрольными и стимулированными образцами зарегистрировано не было при всех использованных концентрациях клеток Увеличение срока инкубации еще на 2 ч привело к значительному повышению (на 45-б0 %) продукции диформазана НсТ гемоцитами. При внесении в лунку 1 • 105 гемоцитов зарегистрированы достоверные различия между контрольными образцами (внесение 50 мкл ФMВ) и образцами, стимулированными суспензией латексных микросфер (44,5 %, p < 0,01) . При увеличении числа вносимых клеток до 2-105 в лунке были отмечены достоверные различия с контролем в случае использования в качестве стимуляторов суспензий зимозана и микросфер латекса, когда данные величины составили 0,343±0,021 и 0,433±0,038 ед. ОП, соответственно, что превысило значения контроля на 27,51 и б0,97 % соответственно (p < 0,01) . В ходе дальнейшего увеличения содержания клеток (до 4405 гемоцитов на лунку) достоверный прирост продукции активных форм кислорода был отмечен при стимуляции частицами зимозана и латекса В этом случае значения стимулированных образцов превысили значения контрольных на 26,6B и 52,83 % соответственно (см . табл . 1) . При использовании в качестве стимулятора раствора бактериального ЛПс достоверных различий с контролем не было зарегистрировано ни при одном из сроков инкубации, равно как и увеличение концентрации клеток не влияло на изменение данного показателя . Таким образом, для оценки уровня продукции активных форм кислорода при помощи НСТ-теста оптимальной является концентрация клеток в 2^ 10б гемоцитов в 1 мл при времени инкубации в б ч . В качестве стимуляторов могут быть использованы суспензии латексных микросфер и зимозана А в финальной концентрации 0,25 мг/мл .
Результатом центрифугирования гемоцитов асцидии H. purpureae в градиенте плотности диатризоата натрия стало получение трех фракций клеток. Первая (верхняя) фракция, формировавшаяся на инферфазе 10 и 20 % диатризоата натрия, была обогащена макрофагоподобными клетками, а также встречались отдельные лимфоцитоподобные клетки Основным клеточным типом второй (средней) фракции (на границе градиентов 20 и 25 % диатризоата) были гранулярные амебоциты с невысоким содержанием мелких гранул в области ядра. Клетки этой фракции при контакте со стеклом быстро распластывались и приобретали дискоидальную форму. В третью (нижнюю) фракцию, снятую с интерфазы 25 и 30 % градиента, входили амебоциты с высоким содержанием гранул, которые были равномерно распределены по цитоплазме, а также многочисленные морулярные клетки
В рамках данного исследования была проведена оценка спонтанной и индуцированной способностей клеток различных фракций продуцировать активные формы кислорода (табл . 2) . Было показано, что спонтанная продукция активных форм кислорода достоверно снижалась от первой фракции к третьей, для которых эти величины составили 0,205±0,008,
0,141±0,007 и 0,114±0,004 ед. ОП / 2 • 105 клеток соответственно . В случае стимуляции бактериальным липополисахаридом была отмечена сходная динамика в синтезе активных форм кислорода, однако полученные значения достоверно не отличались от уровня спонтанной
Таблица 2
Продукция активных форм кислорода различными фракциями гемоцитов асцидии Halocynthia purpureae, X±s, n > 15, ед. ОП (I = 620 нм)/2105 клеток
Фракции гемоцитов ФMВ 0,2%-ная суспензия зимозана Раствор ЛПс 0,2%-ная суспензия латекса
верхняя 0,205±0,008 0,321±0,018*** 0,22б±0,014 0,238±0,008**
средняя 0,141±0,007 0,182±0,00б*** 0,141±0,007 0,187±0,007***
нижняя 0,114±0,004 0,127±0,004* 0,103±0,00б 0,119±0,005
продукции В случае стимуляции суспензией зимозан для всех фракций гемоцитов было отмечено достоверное увеличение продукции активных форм кислорода. Для первой фракции его величина повысилась на 56,59 %, для второй — на 29,09, а для третьей — на 11,40 % соответственно . В целом сходная динамика отмечалась и при стимуляции клеток различных фракций суспензией латексных микросфер . Однако в этом случае максимальные приросты были зарегистрированы для второй фракции клеток, у которой имело место повышение синтеза активных форм кислорода и соответственно оптической плотности раствора диформазана НСТ с 0,141±0,007 ед. 0П/2-105 до 0,187±0,007 ед. 0П/2-105 клеток, что составило около 33 %. В случае третьей фракции достоверного увеличение уровня продукции активных форм кислорода, определяемого путем оценки ОП раствора дифор-мазана НСТ, отмечено не было
обсуждение результатов исследования. В ходе проведенного исследования нами были подобраны условия для оценки способности клеток асцидии Н. ригригеае к синтезу активных форм кислорода при помощи автоматизированного НСТ-теста. Были определены оптимальные концентрация клеток и время инкубации гемоцитов в среде, содержащей раствор НСТ До настоящего времени при исследовании гемоцитов асцидий НСТ-тест использовался лишь для определения числа НСТ-позитивных клеток [5]. Другой подход к изучению этого свойства клеток предусматривает использование люминесцентных субстратов, в частности, люминола, что позволяет оценить влияние различных стимуляторов на активность клеток [2] . Кроме того, было показано, что продукция активных форм кислорода напрямую зависит от присутствия в культуральной среде объектов фагоцитоза, например, частиц зимозана. При этом стимуляция клеток липополисахаридом и Р-1,3-гликанами не приводила к усилению синтетической активности клеток [3] . Аналогичные результаты были получены и в ходе наших собственных исследований, когда корпускулярные модельные антигены (латексные микросферы и зимозан) достоверно увеличивали продукцию активных форм кислорода, тогда как растворимые (бактериальный липополи-сахарид) не оказывали существенного влияния на активность клеток
В целом сходные результаты были получены при исследовании продукции активных форм кислорода у фракционированных гемоцитов . Следует отметить, что уровень синтеза кислородных радикалов во фракциях клеток был значительно ниже такового у объединенных в пул клеток Считается, что для эффективной реализации защитных функций необходима кооперация различных типов клеток [17]. Так, наиболее активными фагоцитами асцидий считаются макрофагоподобные клетки, обладающие широким спектром паттерн-распознающих рецепторов Вместе с тем этот тип клеток практически лишен гранул, в составе которых, например, у базофильных гранулоцитов находятся молекулы-опсонины (С3 компонент комплемента, лектины различной углеводной специфичности) . Среди белков, входящих в состав вакуолей морулярных клеток, встречаются опсонины и хематтрактанты [14] Дегрануляция морулярных клеток сопровождается высвобождением интерлейкин-1а- и TNFа-подобных молекул, что вызывает активацию гемоцитов, их направленный хемотаксис в очаги проникновения патогенов и в целом усиливает фагоцитарную активность клеток [15] . Таким образом, совместное культивирование клеток, равно как и дополнительная опсонизация объектов фагоцитоза, приводят к значительному усилению фагоцитарной активности клеток [3] .
Особого внимания заслуживает сравнение влияния суспензий зимозана и латексных микросфер на синтез активных форм кислорода в разных фракциях гемоцитов . В случае первой фракции клеток максимальный уровень продукции кислородных радикалов имел место при стимуляции зимозаном (более чем на 56 %), тогда как внесение
в культуральную среду частиц латекса увеличивало этот показатель лишь на 16 %, для второй фракции клеток эти величины составили 29 и 33 % соответственно . Нефракцио-нированные гемоциты на стимуляцию зимозаном отвечали 27 %-ным приростом продукции активных форм кислорода, а на стимуляцию латексными микросферами — почти 53 %-ным приростом (см . табл . 1) . При этом значения, установленные для клеток первой фракции при стимуляции зимозаном, соответствуют таковым пула всех гемоцитов . Полученные результаты косвенно указывают на то, что для эффективного поглощения инертных частиц латекса необходима опсонизация, причем эти опсонины локализованы в гранулах более тяжелых фракций гемоцитов . Поглощение зимозана, видимо, опосредуется в первую очередь клеточными рецепторами макрофагоподобных клеток . Возможно, именно поэтому гемоциты первой фракции в отсутствие опсонинов более интенсивно поглощают частицы зимозана, тогда как клетки второй фракции, обладающие слабой фагоцитарной активностью, но несущие в своих гранулах весьма большой спектр опсонинов, были способны с одинаковой эффективностью поглощать как частицы зимозана, так и латексные микросферы При сравнении уровней продукции активных форм кислорода в различных фракциях гемоцитов было показано, что максимальной активностью по этому показателю обладают клетки первой фракции, обогащенной макрофагоподобными клетками По мере увеличения гранулярности клеток и, следовательно, увеличения плотности способность гемоцитов к генерации кислородных радикалов снижается . Литературные данные указывают на то, что аналогичным образом происходит снижение и фагоцитарной активности клеток [17].
Таким образом, в ходе проведенного исследования был адаптирован метод автоматизированной оценки уровня продукции активных форм кислорода для асцидии Halocynthia purpureae . Показано, что корпускулярные модельные антигены (зимозан и латекс) стимулируют синтез гемоцитами кислородных радикалов, а растворимые (бактериальный липополисахарид) не оказывают существенного влияния на активность клеток. Эффективность защитных реакций асцидий значительно возрастает при кооперации различных типов клеток
Авторы выражают искреннюю благодарность всем сотрудникам морской биологической станции «Восток» Института биологии моря им . А . В . Жирмунского ДВО РАН (Директор института, академик РАН — А . В . Адрианов) за предоставленную возможность проведения исследований и создание оптимальных условий для научной работы
Summary
Sukhachev A.N., Kudryavtsev I.V., Romanyuk D.S., Kumeiko V.V., Kharazova A.D., Polevschikov A.V Reactive oxygen species production by fractionated haemocytes of ascidian Halocynthya purpureae .
This article is devoted to the investigation of reactive oxygen species production by fractionated haemocytes of the ascidian Halocynthya purpureae . It was demonstrated that the ROS production was stimulated by corpuscular model antigens (yeast cells and latex beads), but not by soluble antigens (bacterial LPS) . Cooperation between different cell types increases the effectiveness of ascidian defense reactions .
Key words: comparative immunology, reactive oxygen species, tunicate, cell separation
Литература:
1. Akita N., HoshiM. Hemocytes release phenoloxidase upon contact reaction, an allogeneic interaction, in the ascidian Halocynthia roretzi // Cell Struct. Funct. 1995 . Vol . 20 . P. 81-87 .
2 . Azumi K., Ishimoto R., Fujita T. Opsonin-independent and -dependent phagocytosis in the ascidian Halocynthia roretzi: galactose-specific lectin and complement C3 function as target-dependent opsonins // Zool . Science . 2000. Vol . 17 . P. 625-632 .
3 . Azumi K., Kuribayashi F., Kanegasaki S. Zymosan induces production of superoxide anions by hemocytes of the solitary ascidian Halocynthia roretzi // Comp . Biochem . Physiol . C . Toxicol . Pharmacol . 2002. Vol . 133 . P. 567-574 .
4 . Babior B. M. NADPH oxidase // Curr. Opinion Immunol . 2004. Vol . 16 . P. 42-47.
5 . Ballarin L., Cima F., Sabbadin A. Phagocytosis in the colonial ascidian Botryllus schlossery // Dev. Comp . Immunol. 1994 . Vol. 18 . P. 467-481.
6 . BeutlerB. Innate immunity: an overview // Mol . Immunol . 2004. Vol . 40 . P. 845-859.
7 . Cima F., Sabbadin A., Ballarin L . Cellular aspects of allorecognition in the compound ascidian Botryl-lus schlosseri // Dev Comp Immunol 2004 Vol 28 P 881-889
8 . Coteur G., Warnau M., JangouxM. et al . Reactive oxygen species (ROS) production by amoebocytes of Asterias rubens (Echinodermata) // Fish Shellfish Immunol. 2002. Vol. 12 . P. 187-200.
9 . Fuke M., Fukumoto M. Correlative fine structural, behavioral and histochemical analisys of ascidian blood cells// Acta Zool . 1993 . Vol . 74 . P. 61-71.
10 . Hahn U. K., Bender R. C., Bayne C. J. Production of reactive oxygen species by hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specific stimulation // Dev. Comp . Immunol . 2000. Vol . 24 . P. 531-541.
11. Holmblad T., SoderhallK. Cell adhesion molecules and antioxidative enzymes in a crustacean, possible role in immunity // Aquaculture. 1999 . Vol. 172 . P. 111-123 .
12 . Menzel L. P., Lee I. H., Sjostrand B. et al. Immunolocalization of clavanins in Styela clava hemocytes // Dev. Comp . Immunol . 2002. Vol . 26 . P. 505-515 .
13 . Ohtake S., Abe T., Shishikura F. et al . The phagocytes in hemolymph of Halocynthia roretzi and their phagocytic activity // Zool . Sci . 1994. Vol . 11. P. 681-691.
14 . Raftos D. A., Fabbro M., Nair S. V. Exocytosis of a complement component C3-like protein by tunicate hemocytes // Dev Comp Immunol 2004 Vol 28 P 181-190
15 . Raftos D. A., Stillman D. L., Cooper E. L. Chemotactic responses of tunicate (Urochordata, Ascidia-cea) hemocytes in vitro // J. Invert . Pathol . 1998 . Vol . 72 . P. 44-49.
16 . Shida K., Terajima D., Uchino R. et al . Hemocytes of Ciona intestinalis express multiple genes involved in innate immune host defense // Biochem. Biophys . Res . Comm. 2003 . Vol . 302 . P. 207-218.
17 . Smith V. J., Peddie C. M. Cell cooperation during host defense in the solitary tunicate Ciona intestinalis // Biol. Bull. 1992 . Vol . 183 . P. 211-219 .
18 . StaffordJ. L., GalvezF., Goss G. G. Induction ofnitric oxide and respiratory burst response in activated goldfish macrophages requires potassium channel activity // Dev. Comp . Immunol . 2002. Vol . 26 . P. 445-459 .
