CC BY
62
УДК 611.841.2
DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1492-1499
ПРОБОПОДГОТОВКА РОГОВИЦЫ ДЛЯ СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ПОСЛЕ ФОРМИРОВАНИЯ РОГОВИЧНОГО КЛАПАНА С ПОМОЩЬЮ ФЕМТОСЕКУНДНОГО ЛАЗЕРА
© А.В. Дога1*, С.А. Борзенок1*, И.А. Мушкова1*, А.Н. Каримова1*, Е.В. Кечин1*, Н.В. Шевлягина2*
1) МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России 127486, Российская Федерация, г. Москва, Бескудниковский бульвар, 59а E-mail: nauka@mntk.ru 2) Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи 123098, Российская Федерация, г. Москва, ул. Гамалеи, 18 E-mail: info@gamaleya.org
В эксперименте на кадаверных глазах человека изучили методы пробоподготовки роговицы для сканирующей электронной микроскопии после формирования клапана с помощью фемтосекундного лазера. Образцы 1 и 2 групп фиксировали в 4,0 % растворе формальдегида, 3 и 4 - в реактиве Ито-Карновски. Дополнительно к образцам 2 и 4 групп применялась методика обезвоживания с использованием спиртовой батареи и сушка в критической точке. В 1 и 3 группах значимых артефактов не выявлено. Во 2 группе на поверхности стромы роговицы выявлены участки «крошковидного» материала, в 4 - кристаллоподобные структуры длиной до 15 мкм, шириной до 0,8 мкм.
Ключевые слова: сканирующая электронная микроскопия; роговица; роговичный клапан; фемтосекундный лазер; фемтоЛАЗИК
ВВЕДЕНИЕ
Фиксация биологического материала для проведения гистологического исследования является одним из основополагающих моментов в получении реальной картины препарата. Целью фиксации является остановка процессов аутолиза и стабилизация структуры клеток, тканей и их взаиморасположение. Этого можно добиться высушиванием, замораживанием и воздействием химических веществ [1].
При подготовке препаратов для проведения электронной микроскопии наибольшее распространение получила химическая фиксация. Так, в 1965 г. M.J. Kamovsky опубликовал свою работу по способу фиксации биологических тканей для электронной микроскопии. В качестве фиксатора в этом исследовании был использован формальдегид-глутаральдегидный раствор высокой осмолярности на 0,1 М фосфатном или какодилатном буфере (рН 7,2). Было показано, что формальдегид проникает в ткани быстрее глутаральде-гида, однако его эффект менее продолжителен, чем у глутаральдегида. Таким образом, сочетание формальдегида и глутаральдегида позволяет быстро и длительно сохранять максимально возможной неизменной структуру тканей. Концентрация формальдегида в этом фиксаторе составляет 2,0 %, а глутаральдегида - 2,5 %. Фосфатный или какодилатный буфер используется для стабилизации формальдегида, который в водных неза-буференных растворах со временем превращается в метиловый спирт, муравьиную кислоту и ацетон [2].
Фиксатор M.J. Kamovsky получил наибольшее распространение перед проведением электронной микроскопии, что отражается в многочисленных мировых публикациях [3-4].
Однако различные исследователи вносят свои корректировки в состав этого фиксатора в зависимости от исследуемого препарата [5-6]. Так, концентрация формальдегида варьирует от 0,5 до 4,0 %, а глутаральдегида - от 1,0 до 3,0 %. Вместе с тем в 1968 г. S. Ito и M.J. Kamovsky к ранее предложенному фиксатору добавили в состав пикриновую кислоту и 4 других соединения с тремя нитрогруппами, которые способствовали более полной сохранности биологических структур и химических веществ [7]. Так же пикриновая кислота вместе с ледяной уксусной кислотой и 40 % раствором формалина входит в состав фиксатора Буэна, который применяется в гистологических исследованиях [8-10].
При исследовании тетраоксида осмия (OsO4) в качестве фиксатора было отмечено, что он обладает более выраженным фиксирующим действием в отношении ненасыщенных липидов и фосфолипидов, чем альдегиды, однако медленнее проникает в ткани. Поэтому в основном его применяют для постфиксации липидов, когда в качестве первичных фиксаторов используют альдегиды [3-4; 11].
Вместе с тем рекомендуют при первичной фиксации и постфиксации использовать один и тот же буферный раствор (наибольшее распространение получили фосфатный и какодилатный). После фиксации биологического препарата проводят обезвоживание. Для
этого наиболее часто используют этанол или ацетон в сменах с возрастающей концентрацией. Таким образом, этанол или ацетон замещает воду в препаратах [1; 3-5]. Затем производят сушку в критической точке -некоторая температура и давление, при которых фазовые состояния жидкость и пар находятся в состоянии равновесия, следовательно, отсутствует поверхностное натяжение. Идеальным вариантом для этого было бы высушивание в критической точке воды. Однако критическая температура воды составляет 647 К (374 °С), при достижении которой в биологическом препарате происходит нарушение его структуры. Критическая температура СО2 составляет 304 К (31 °С) и критическое давление 7,39 МПа, что позволяет на следующем этапе производить замещение этанола или ацетона на жидкий СО2 в специальном аппарате и проводить сушку в критической точке [1; 4; 5].
В офтальмологии сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения как неизмененной морфологической структуры слезной жидкости, роговицы, трабекулярной сети, хрусталика, стекловидного тела, сетчатки и др., так и после различного воздействия на них [3; 12-19]. Некоторые исследователи проводили сканирующую электронную микроскопию для оценки качества поверхности стромального ложа роговицы, формируемого с помощью микрокератома и фемтосекундного лазера [20-25].
В процессе пробоподготовки после воздействия фемтосекундного лазера на роговицу M.A. Sarayba et al. (2007) отказались от использования формальдегида для первичной фиксации и тетраоксида осмия для постфиксации и фиксировали образцы в 2,0 % растворе глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), затем обезвоживали в растворах этилового спирта с увеличением концентрации, после чего помещали в раствор гексаметилдисилазана и высушивали на воздухе [24].
Отличие подготовки роговицы в исследовании C. Zhang (2015) от работы M.A. Sarayba et al. (2007) состояло в том, что на этапе первичной фиксации был добавлен 0,025 % хлорид кальция для лучшей фиксации липидов и проводили постфиксацию в 1,0 % растворе тетраоксида осмия с этой же целью [24-26].
A.K. Riau et al. (2014) для фиксации роговицы использовали 2,0 % раствор параформальдегида, 2,0 % раствор глутаральдегида и 0,1 М какодилата натрия (рН 7,4), затем промывали образцы в фосфатном буфере (хотя другие авторы рекомендуют использовать один и тот же буферный раствор), после чего производили постфиксацию в 1,0 % растворе тетраоксида осмия, затем образцы обезвоживали этанолом с увеличением концентрации и проводили сушку в критической точке [20].
C. Monterosso (2013) не применял для фиксации роговицы формальдегид и для постфиксации тетраоксид осмия, а использовал 2,5 % раствор глутаральдегида на фосфатном буфере, после чего образцы обезвоживались с помощью этанола в сменах с возрастающей концентрацией, и далее проводилась сушка в критической точке [22].
G.D. Kymionis et al. (2014) в отличие от C. Monterosso (2013) добавили для постфиксации 2,0 % раствор тетраоксида осмия и в качестве буферного раствора использовали 0,1 М какодилатный буфер (рН 7,4) [22-23]. N.M. Ziebarth (2013) фиксацию роговицы проводил только с использованием 2,0 % раствора фор-
мальдегида, обосновывая это тем, что обезвоживание и сушка в критической точке приводят к деформации истинной структуры биологического препарата и к искаженному представлению о нем [21].
Все это говорит об отсутствие единого подхода в вопросах пробоподготовки роговицы для сканирующей электронной микроскопии после формирования рого-вичного клапана с помощью фемтосекундного лазера.
Цель работы: отработка методов пробоподготовки препаратов кадаверной роговицы человека для сканирующей электронной микроскопии после формирования роговичного клапана с помощью фемтосекундного лазера.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на 8 кадаверных глазах от 4 доноров-трупов без признаков патологии роговицы, не соответствующих критериям отбора для кератопластики. Кадаверные глаза были предоставлены Глазным тканевым банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» МЗ РФ, имеющим лицензию на осуществление медицинской деятельности по изъятию и хранению органов и (или) тканей человека для трансплантации; транспортировке органов и (или) тканей человека для трансплантации.
Возраст доноров варьировал от 30 до 38 лет. От момента смерти до энуклеации проходило не более 6 часов, от момента смерти до выполнения эксперимента -не более 11 часов. Для формирования роговичного клапана была выбрана фемтосекундная лазерная установка Femto LDV Z6 (Ziemer, Швейцария), являющаяся одной из самых современных на сегодняшний день и подтвердившая свою эффективность и безопасность при проведении лазерных рефракционных операций [27-29].
Вначале производили подготовку кадаверного глаза к воздействию фемтосекундного лазера, для этого выполняли скарификацию эпителия роговицы. Затем создавали необходимый для фемтодиссекции отфальмо-тонус - 15 мм рт. ст. путем введения в витреальную полость физиологического раствора. После чего када-верный глаз помещали в «зажим-лепесток» для механической фиксации. Затем производили апланацию стыковочного конуса фемтолазерной установки с последующим формированием роговичного клапана с заданными параметрами: диаметр клапана 9,0 мм, толщина - 100 мкм.
Далее выкраивали роговично-склеральный диск, из которого с помощью вакуумного трепана Barron (Katena, США) диаметром 8 мм формировали рогович-ный диск. Затем с помощью лезвия роговичный диск разрезали на 4 равные части по принципу «пиццы», с целью рационального использования аутопсийного материала. После этого одним пинцетом фиксировали край получившейся % части роговицы со стороны дес-цеметовой мембраны, а другим - край роговичного клапана и производили «раскрытие». Таким образом, отсутствовало механическое воздействие по обе стороны от фемтодиссекционного разреза.
В процессе подготовки материала к дальнейшему исследованию было получено 32 образца стромального ложа и сформировано 4 группы по 8 образцов в каждой. Далее, на этапе пробоподготовки, все образцы хранили при температуре 4 °С. Образцы первой и второй группы помещали в 2,0 % раствор формальдегида
на 4 часа, затем перемещали в 4,0 % раствор формальдегида на 8 часов. Образцы третьей и четвертой групп подвергались фиксации в реактиве Ито-Карновски в течение 12 часов [7]. Дополнительно к образцам второй и четвертой групп применялась методика обезвоживания с использованием спиртовой батареи (50°, 70°, 90°, 96° х2, 100° х3) по 30 минут в каждом растворе и последующим высушиванием в критической точке.
После пробоподготовки все образцы всех групп монтировали на алюминиевые столики таким образом, чтобы поверхность стромы роговицы была обращена вверх, и на установке SPI-MODULE Sputter Coater (SPI, США) производили напыление золотом (проба 999, толщина слоя 5 нм) для обеспечения электронно-проводящего слоя на поверхности образцов. Затем образцы помещали в камеру двулучевого сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, США) и анализировали в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5 кВ.
Сканирующую электронную микроскопию проводили на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ «ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи».
Рис. 1. Недегидратированный образец, фиксированный в 4,0 % растворе формальдегида. Увеличение х1000
Рис. 2. Недегидратированный образец, фиксированный в 4,0 % растворе формальдегида. Увеличение х4000, угол наклона 15 градусов
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенной сканирующей электронной микроскопии было выявлено, что в недегидратиро-ванных препаратах роговицы, фиксированных в 4,0 % растворе формальдегида (первая группа), собственное вещество представлено волокнистой структурой, состоящей из разноориентированных коллагеновых волокон, погруженных в аморфное межклеточное вещество (рис. 1-2).
Строма препаратов недегидратированной роговицы, фиксированных в реактиве Ито-Карновски (третья группа), также представлена волокнистой структурой, состоящей из коллагеновых волокон и аморфного межклеточного вещества (рис. 3-4).
При исследовании препаратов роговицы после фиксации в 4,0 % растворе формальдегида и последующей спиртовой дегидратации, а также сушки в критической точке (вторая группа) были обнаружены некоторые морфологические отличия от недегидрати-рованных образцов первой группы: волокнистая структура стромы роговицы более выражена, присутствуют участки «крошковидного» материала на поверхности (рис. 5-6).
Рис. 3. Недегидратированный образец, фиксированный в реактиве Ито-Карновски. Увеличение х1000
Рис. 4. Недегидратированный образец, фиксированный в реактиве Ито-Карновски. Увеличение х4000, угол наклона 15 градусов
Рис. 5. Образец, фиксированный в 4,0 % растворе формальдегида, обезвоженный в спиртах и высушенный в критической точке. Увеличение х1000
Рис. 6. Образец, фиксированный в 4,0 % растворе формальдегида, обезвоженный в спиртах и высушенный в критической точке. Увеличение х4000, угол наклона 15 градусов
На поверхности препаратов стромы роговицы, фиксированной в реактиве Ито-Карновски, дегидратированной в спиртах и высушенной в критической точке (четвертая группа), выявлены крупные кристаллопо-добные структуры длиной до 15 мкм, шириной до 0,8 мкм, тесно связанные с волокнистой тканью роговицы, и мелкие кристаллоподобные структуры длиной до 0,8 мкм, шириной до 0,2 мкм (рис. 7-8).
ОБСУЖДЕНИЕ
В электронной микроскопии успех всего исследования зависит от качества подготовки образцов. С этой целью для получения наиболее реальной картины препаратов разные авторы используют различные методы пробоподготовки, такие как фиксация в растворах формальдегида, глутаральдегида, тетраоксида осмия, реактивах Карновски, Ито-Карновски, дегидратация в спиртах, ацетоне, а также сушка в критической точке [1-4; 7; 11; 20-25; 32].
Рис. 7. Образец, фиксированный в реактиве Ито-Карновски, обезвоженный в спиртах и высушенный в критической точке. Увеличение х1000
Рис. 8. Образец, фиксированный в реактиве Ито-Карновски, обезвоженный в спиртах и высушенный в критической точке. Увеличение х4000, угол наклона 15 градусов
В проведенном исследовании на поверхности образцов, фиксированных в 4,0 % растворе формальдегида и дегидратированных в спиртах восходящей концентрации, а также подвергшихся сушке в критической точке (вторая группа), обнаружен «крошковидный» материал. Данное явление, вероятно, возникает в результате взаимодействия спирта с белками, которые входят в состав роговицы. На таком взаимодействии основан один из принципов фракционирования белков, что приводит к выпадению в осадок определенных фракций белка [30-31]. Однако при использовании аналогичного метода пробоподготовки роговицы у других исследователей данное явление не было описано [20; 22-23]. Возможно, это связано с тем, что в своих исследованиях для визуализации они использовали недостаточно высокое увеличение, не более х250, а в проведенном нами исследовании образцы подвергались изучению на увеличениях х 1000 и х4000.
Некоторые исследователи в качестве фиксатора при пробоподготовке используют реактив Ито-Карновски, в его состав помимо формальдегида и глутаральдегида
входит пикриновая кислота, которая способствует более полной сохранности биологических структур и химических веществ [7; 11]. Особенностью применения пикриновой кислоты является образование нерастворимых кристаллов при взаимодействии ее с белками. Поэтому для профилактики образования таких кристаллов авторы рекомендуют промывать образцы в спиртах высоких концентраций [31-32]. Несмотря на это, в настоящем исследовании на поверхности образцов, фиксированных в реактиве Ито-Карновски, подвергшихся спиртовой обработке и сушке в критической точке (четвертая группа), были выявлены кристаллопо-добные структуры. Вместе с тем в образцах, которые не подвергали спиртовой обработке и сушке в критической точке, фиксированные в реактиве Ито-Карновски (третья группа), не было выявлено кристаллоподобных структур и каких-либо других значимых артефактов, также этого не было отмечено и в образцах, подготовленных только с использованием 4,0 % раствора формальдегида (первая группа).
Наличие как мелких, так и крупных артефактов («крошковидный» материал, кристаллоподобные структуры) на исследуемых препаратах роговицы затрудняет визуализацию объекта и может дать ложное представление о качестве поверхности стромального ложа роговицы, в т. ч. при сравнении образцов, полученных с использованием различных фемтосекундных лазерных установок.
Ввиду того, что в нативной роговице содержится до 80 % воды, отказ от использования в процессе пробо-подготовки дегидратации и сушки в критической точке приведет к сохранению морфологического вида роговицы, наиболее приближенного к физиологичному [33].
ВЫВОДЫ
1. При использовании в качестве фиксаторов 4,0 % раствор формальдегида и реактив Ито-Карнов-ски с последующей дегидратацией в спиртах и сушкой в критической точке образуются артефакты («крошко-видный» материал, кристаллоподобные структуры) на препаратах кадаверной роговицы после формирования клапана с использованием фемтосекундного лазера.
2. Оптимальными методами пробоподготовки препаратов кадаверной роговицы человека для сканирующей электронной микроскопии после формирования роговичного клапана с помощью фемтосекундного лазера является фиксация материала в 4,0 % растворе формальдегида и в реактиве Ито-Карновски без последующей дегидратации с использованием спиртовой батареи и сушки в критической точке. Данные методы позволяют сохранить морфологический вид роговицы, наиболее приближенный к физиологичному, и проводить детальную оценку качества поверхности стро-мального ложа роговицы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996. 544 с.
2. Karnovsky M.J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1965. V. 27. № 1. P. 137-138.
3. Sihota R., Goyal A., Kaur J. et al. Scanning electron microscopy of the trabecular meshwork: understanding the pathogenesis of primary angle closure glaucoma // Indian J. Ophthalmol. 2012. V. 60. № 3. P. 183188.
4. Conegero C.I., Chopard R.P. Tridimensional architecture of the collagen element in the arachnoid granulations in humans: a study on scanning electron microscopy // Arq. Neuropsiquiatr. 2003. V. 61. № 3A. P. 561-565.
5. Rocha C.T., Rossi M.A., Leonardo M.R. et al. Biofilm on the apical region of roots in primary teeth with vital and necrotic pulps with or without radiographically evident apical pathosis // Int. Endod. J. 2008. Vol. 41. № 8. P. 664-669.
6. Pullen A.H., Martin J.E. Ultrastructural abnormalities with inclusions in Onufs nucleus in motor neuron disease (amyotrophic lateral sclerosis) // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 1995. V. 21. № 4. P. 327-340.
7. Ito S., Karnovsky М. Formaldehyde glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds // J. Cell. Biol. 1969. V. 39. P. 168-169.
8. Friedrich R.E., Holstein A.F., Middendorff R., Davidof M.S. Vascular wall cells contribute to tumourigenesis in cutaneous neurofibromas of patients with neurofibromatosis type 1. A comparative histological, ultrastructural and immunohistochemical study // Anticancer Res. 2012. V. 32. № 5. P. 2139-2158.
9. Miller C.C., Godeau G., Lebreton-De Coster C. et al. Validation of a morphometric method for evaluating fibroblast numbers in normal and pathologic tissues // Exp. Dermatol. 2003. V. 12. № 4. P. 403-411.
10. Filipiak E., Suliborska D., Laszczynska M. et al. Estrogen receptor alpha localization in the testes of men with normal spermatogenesis // Folia Histochem. Cytobiol. 2013. V. 50. № 3. P. 340-345.
11. Зиганирова Н.А., Петяев И.М., Пашко Ю.П. и др. Генерализация инфекции у больных с урогенитальным хламидиозом // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007. Т. 9. № 4. С. 351-360.
12. Егорова Э.В., Тухтаев К.Р., Агафонова В.В., Файзиева У.С. Морфологические особенности отложений псевдоэксфолиативного материала на передней капсуле хрусталика при первичной закры-тоугольной глаукоме // Офтальмохирургия. 2012. № 2. С. 69-72.
13. Туманян Э.Р., Иванова Е.С., Любимова Т.С., Субхангулова Э.А. Морфологическая оценка измерений трабекулярной сети УПК глаза после СЛТ по М. Latina и СЛАТ // Офтальмохирургия. 2010. № 3. С. 39-42.
14. Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Репин В.С. и др. Методологические и технологические проблемы конструирования искусственной роговицы на базе 3D-клеточного культивирования // Офтальмохи-рургия. 2012. № 4. С. 12-17.
15. Малюгин Б.Э., Борзенок С.А., Сабурина И.Н. и др. Разработка биоинженерной конструкции искусственной роговицы на основе пленочного матрикса из спидроина и культивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока // Офтальмохирургия. 2013. № 4. С. 89-97.
16. Копаев С.Ю., Борзенок С.А., Копаева В.Г., Алборова В.У. Состояние заднего эпителия роговицы после лазерной и ультразвуковой факофрагментации. Электронно-микроскопическое исследование в эксперименте. Сообщение 3 // Офтальмохирургия. 2014. № 2. С. 6-9.
17. Зотов В.В., Паштаев Н.П., Ларионов Е.В. и др. Электронная микроскопия роговичной стромы после стандартного кросслин-кинга и с применением фемтолазера в эксперименте // Офтальмо-хирургия. 2015. № 2. С. 22-27.
18. Григорьева А.Е., Еремина А.В., Дружинин И.Б. и др. Диагностический потенциал электронно-микроскопического анализа слезной жидкости человека // Офтальмохирургия. 2013. № 4. С. 104-107.
19. Ferrer C., Abu-Mustafa S.K., Alio J.L. Scanning electron microscopy analysis of a Sputnik-like intraocular lens 28 years after implantation // J. Refract. Surg. 2009. V. 25. P. 788-791.
20. Riau A.K., Liu Y. C., Lwin N. C. et al. Comparative study of nJ- and J energy level femtosecond lasers: evaluation of flap adhesion strength, stromal bed quality, and tissue responses // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2014. V. 55. № 5. P. 3186-3194.
21. Ziebarth N.M., Dias J., Hürmerig V. et al. Quality of corneal lamellar cuts quantified using atomic force microscopy // J. Cataract Refract. Surg. 2013. V. 39. № 1. P. 110-117.
22. Monterosso C., Galan A., Böhm E. et al. Effect of 60 kHz and 150 kHz Femtosecond Lasers on Corneal Stromal Bed Surfaces: A Comparative Study // ISRN Ophthalmol. 2013. V. 2013. P. 971451.
23. Kymionis G.D., Kontadakis G.A., Naoumidi I. et al. Comparative study of stromal bed of LASIK flaps created with femtosecond lasers (Intra-Lase FS150, WaveLight FS200) and mechanical microkeratome // Br. J. Ophthalmol. 2014. V. 98. № 1. P. 133-137.
24. Sarayba M.A., Ignacio T.S., Binder P.S., Tran D.B. Comparative study of stromal bed quality by using mechanical, IntraLase femtosecond laser 15- and 30-kHz microkeratomes // Cornea. 2007. V. 26. № 4. P. 446-451.
25. Zhang C., BaldM., Tang M. et al. Interface quality of different corneal lamellar-cut depths for femtosecond laser-assisted lamellar anterior ke-ratoplasty // J. Cataract Refract. Surg. 2015. V. 41. № 4. P. 827-835.
26. Baker J.R. The histochemical recognition of lipine // Q. J. Microsc. Sci. 1946. V. 87. № 4. P. 441-470.
27. Tomita M., Waring G.O. 4th, Watabe M. Analysis of corneal endothelial cell density and morphology after laser in situ keratomileusis using two types of femtosecond lasers // Clin. Ophthalmol. 2012. V. 6. P. 1567-1572.
28. Zhou Y., Zhang J., Tian L., Zhai C. Comparison of the Ziemer FEMTO LDV femtosecond laser and Moria M2 mechanical microkeratome // J. Refract. Surg. 2012. V. 28. № 3. P. 189-194.
29. Zhang J., Zhou Y., Zhai C., Tian L. Comparison of 2 femtosecond lasers for laser in situ keratomileusis flap creation // J. Cataract Refract. Surg. 2013. V. 39. № 6. P. 922-927.
30. Рубина Х.М., Добринская М.А., Романчук Л.А. Практикум по физической и коллоидной химии: учебник для вузов. М.: Высш. шк., 1972. 152 с.
31. Голлеман А. Курс органической химии. М.: ГОНТИ, 1938. 552 с.
32. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М.: Сов. наука, 1957. 467 с.
33. Тахчиди Х.П., Ярцева Н.С., Деев Л.А. Избранные лекции по офтальмологии. М.: Офтальмология, 2008. Т. 1. 292 с.
Поступила в редакцию 18 марта 2016 г.
UDC 611.841.2
DOI: 10.20310/1810-0198-2016-21-4-1492-1499
CORNEAL SAMPLE PREPARATION FOR SCANNING ELECTRON MICROSCOPY AFTER THE FORMATION OF A CORNEAL FLAP USING THE FEMTOSECOND LASER
© A.V. Doga1*, S.A. Borzenok1*, I.A. Mushkova1*, A.N. Karimova1*, E.V. Kechin1*, N.V. Shevlyagina2*
^ Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery" of Ministry of Health of Russia 59a Beskudnikovskiy Blvd., Moscow, Russian Federation, 127486 E-mail: nauka@mntk.ru 2) N.F. Gamaley FSRCEM 18 Gamalei St., Moscow, Russian Federation, 123098 E-mail: info@gamaleya.org
Eyes methods of sample preparation for corneal scanning electron microscopy after the flap formation using femtosecond laser were studied in the experiment on human cadaver. Samples 1 and 2 groups were fixed in 4.0 % formaldehyde solution, 3 and 4 - in the Ito-Karnovsky reagent. The samples 2 and 4 were also dehydrated using alcohol battery and critical point drying. No artifacts were found in 1 and 3 groups of samples. In 2 group on the surface of corneal stroma was identified certain "crumbs-looking" material, in 4 group - were identified crystal-like structures with length up to 15 microns and 0.8 microns in wide. Key words: scanning electron microscopy; cornea; corneal flap; femtosecond laser; femtoLASIK
REFERENCES
1. Sarkisov D.S., Perov Yu.L. Mikroskopicheskaya tekhnika. Moscow, Meditsina Publ., 1996. 544 p.
2. Karnovsky M.J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J. Cell. Biol., 1965, vol. 27, no. 1, pp. 137-138.
3. Sihota R., Goyal A., Kaur J. et al. Scanning electron microscopy of the trabecular meshwork: understanding the pathogenesis of primary angle closure glaucoma. Indian J. Ophthalmol., 2012, vol. 60, no. 3, pp. 183-188.
4. Conegero C.I., Chopard R.P. Tridimensional architecture of the collagen element in the arachnoid granulations in humans: a study on scanning electron microscopy. Arq. Neuropsiquiatr., 2003, vol. 61, no. 3A, pp. 561-565.
5. Rocha C.T., Rossi M.A., Leonardo M.R. et al. Biofilm on the apical region of roots in primary teeth with vital and necrotic pulps with or without radiographically evident apical pathosis. Int. Endod. J., 2008, vol. 41, no. 8, pp. 664-669.
6. Pullen A.H., Martin J.E. Ultrastructural abnormalities with inclusions in Onufs nucleus in motor neuron disease (amyotrophic lateral sclerosis). Neuropathol. Appl. Neurobiol., 1995, vol. 21, no. 4, pp. 327-340.
7. Ito S., Karnovsky M. Formaldehyde glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol., 1969, vol. 39, pp. 168-169.
8. Friedrich R.E., Holstein A.F., Middendorff R., Davidoff M.S. Vascular wall cells contribute to tumourigenesis in cutaneous neurofibromas of patients with neurofibromatosis type 1. A comparative histological, ultrastructural and immunohistochemical study. Anticancer Res., 2012, vol. 32, no. 5, pp. 2139-2158.
9. Miller C.C., Godeau G., Lebreton-De Coster C. et al. Validation of a morphometric method for evaluating fibroblast numbers in normal and pathologic tissues. Exp. Dermatol., 2003, vol. 12, no. 4, pp. 403-411.
10. Filipiak E., Suliborska D., Laszczynska M. et al. Estrogen receptor alpha localization in the testes of men with normal spermatogenesis. FoliaHistochem. Cytobiol., 2013, vol. 50, no. 3, pp. 340-345.
11. Ziganirova N.A., Petyaev I.M., Pashko Yu.P. i dr. Generalizatsiya infektsii u bol'nykh s urogenital'nym khlamidiozom. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya — Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2007, vol. 9, no. 4, pp. 351360.
12. Egorova E.V., Tukhtaev K.R., Agafonova V.V., Fayzieva U.S. Morfologicheskie osobennosti otlozheniy psevdoeks-foliativnogo materi-ala na peredney kapsule khrustalika pri pervichnoy zakrytougol'noy glaukome. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2012, no. 2, pp. 69-72.
13. Tumanyan E.R., Ivanova E.S., Lyubimova T.S., Subkhangulova E.A. Morfologicheskaya otsenka izmereniy trabekulyarnoy seti UPK glaza posle SLT po M. Latina i SLAT. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2010, no. 3, pp. 39-42.
14. Borzenok S.A., Saburina I.N., Repin V.S. i dr. Metodologicheskie i tekhnologicheskie problemy konstruirovaniya iskusstvennoy rogo-vitsy na baze 3D-kletochnogo kul'tivirovaniya. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2012, no. 4, pp. 1217.
15. Malyugin B.E., Borzenok S.A., Saburina I.N. i dr. Razrabotka bioinzhenernoy konstruktsii iskusstvennoy rogovitsy na osnove plenochnogo matriksa iz spidroina i kul'tivirovannykh kletok limbal'noy zony glaznogo yabloka. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2013, no. 4, pp. 89-97.
16. Kopaev S.Yu., Borzenok S.A., Kopaeva V.G., Alborova V.U. Sostoyanie zadnego epiteliya rogovitsy posle lazernoy i ul'trazvukovoy fakofragmentatsii. Elektronno-mikroskopicheskoe issledovanie v eksperimente. Soobshchenie 3. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2014, no. 2, pp. 6-9.
17. Zotov V.V., Pashtaev N.P., Larionov E.V. i dr. Elektronnaya mikroskopiya rogovichnoy stromy posle standartnogo krosslinkinga i s primeneniem femtolazera v eksperimente. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2015, no. 2, pp. 22-27.
18. Grigor'eva A.E., Eremina A.V., Druzhinin I.B. i dr. Diagnosticheskiy potentsial elektronno-mikroskopicheskogo analiza sleznoy zhid-kosti cheloveka. Oftal'mokhirurgiya - The Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery, 2013, no. 4, pp. 104-107.
19. Ferrer C., Abu-Mustafa S.K., Alio J.L. Scanning electron microscopy analysis of a Sputnik-like intraocular lens 28 years after implantation. J. Refract. Surg., 2009, vol. 25, pp. 788-791.
20. Riau A.K., Liu Y.C., Lwin N.C. et al. Comparative study of nJ- and ^J-energy level femtosecond lasers: evaluation of flap adhesion strength, stromal bed quality, and tissue responses. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2014, vol. 55, no. 5, pp. 3186-3194.
21. Ziebarth N.M., Dias J., Hürmerif V. et al. Quality of corneal lamellar cuts quantified using atomic force microscopy. J. Cataract Refract. Surg., 2013, vol. 39, no. 1, pp. 110-117.
22. Monterosso C., Galan A., Böhm E. et al. Effect of 60 kHz and 150 kHz Femtosecond Lasers on Corneal Stromal Bed Sur-faces: A Comparative Study. ISRNOphthalmol., 2013, vol. 2013, p. 971451.
23. Kymionis G.D., Kontadakis G.A., Naoumidi I. et al. Comparative study of stromal bed of LASIK flaps created with femto-second lasers (IntraLase FS150, WaveLight FS200) and mechanical microkeratome. Br. J. Ophthalmol., 2014, vol. 98, no. 1, pp. 133-137.
24. Sarayba M.A., Ignacio T.S., Binder P.S., Tran D.B. Comparative study of stromal bed quality by using mechanical, IntraLase femtosecond laser 15- and 30-kHz microkeratomes. Cornea, 2007, vol. 26, no. 4, pp. 446-451.
25. Zhang C., Bald M., Tang M. et al. Interface quality of different corneal lamellar-cut depths for femtosecond laser-assisted lamellar anterior keratoplasty. J. Cataract Refract. Surg., 2015, vol. 41. № 4, pp. 827-835.
26. Baker J.R. The histochemical recognition of lipine. Q. J. Microsc. Sci., 1946, vol. 87, no. 4, pp. 441-470.
27. Tomita M., Waring G.O. 4th, Watabe M. Analysis of corneal endothelial cell density and morphology after laser in situ keratomileusis using two types of femtosecond lasers. Clin. Ophthalmol., 2012, vol. 6, pp. 1567-1572.
28. Zhou Y., Zhang J., Tian L., Zhai C. Comparison of the Ziemer FEMTO LDV femtosecond laser and Moria M2 mechanical microkeratome. J. Refract. Surg., 2012, vol. 28, no. 3, pp. 189-194.
29. Zhang J., Zhou Y., Zhai C., Tian L. Comparison of 2 femtosecond lasers for laser in situ keratomileusis flap creation. J. Cataract Refract. Surg., 2013, vol. 39, no. 6, pp. 922-927.
30. Rubina Kh.M., Dobrinskaya M.A., Romanchuk L.A. Praktikum po fizicheskoy i kolloidnoy khimii. Moscow, Vysshaya Shkola Publ., 1972. 152 p.
31. Golleman A. Kurs organicheskoy khimii. Moscow, State Scientific-Technical Publ., 1938. 552 p.
32. Roskin G.I., Levinson L.B. Mikroskopicheskaya tekhnika. Moscow, Sovetskaya nauka Publ., 1957. 467 p.
33. Takhchidi Kh.P., Yartseva N.S., Deev L.A. Izbrannye lektsiipo oftal'mologii. Moscow, Oftal'mologiya Publ., 2008, vol. 1. 292 p.
Received 28 April 2016
Дога Александр Викторович, МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва, Российская Федерация, доктор медицинских наук, профессор, зам. генерального директора по научно-клинической работе, e-mail: alexander_doga@mail.ru
Doga Aleksander Viktorovich, Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery", Moscow, Russian Federation, Doctor of Medicine, Professor, Deputy Director General on Scientific-Clinical Work, e-mail: alexander_doga@mail.ru
Борзенок Сергей Анатольевич, МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва, Российская Федерация, доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, руководитель центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем, e-mail: mdborzenok@yandex.ru
Borzenok Sergey Anatolevich, Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery", Moscow, Russian Federation, Doctor of Medicine, Professor, RANS Academician, Director of Basic and Applied Biomedical Problems Center, e-mail: mdborzenok@yandex.ru
Мушкова Ирина Альфредовна, МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва, Российская Федерация, доктор медицинских наук, ученый секретарь диссертационного совета, зав. отделом лазерной рефракционной хирургии, e-mail: i.a.muskova@mail.ru
Mushkova Irina Alfredovna, Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery", Moscow, Russian Federation, Doctor of Medicine, Scientific Secretary of Dissertation Council, Head of Laser Refraction Surgery Department, e-mail: i.a.muskova@mail.ru
Каримова Аделя Насибуллаевна, МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва, Российская Федерация, кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела лазерной рефракционной хирургии, e-mail: adelya.k.n@mail.ru
Karimova Adelya Nasibullaevna, Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery", Moscow, Russian Federation, Candidate of Medicine, Scientific Worker of Laser Refraction Surgery Department, e-mail: adelya.k.n@mail.ru
Кечин Евгений Владимирович, МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова, г. Москва, Российская Федерация, аспирант, специальность «Глазные болезни», e-mail: evgeny.kechin@gmail.com
Kechin Evgeniy Vladimirovich, Academician S.N. Fyodorov FSBI IRTC "Eye Microsurgery", Moscow, Russian Federation, Post-graduate Student, "Eye Diseases" Specialty, e-mail: evgeny.kechin@gmail.com
Шевлягина Наталья Владимировна, Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва, Российская Федерация, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории анатомии микроорганизмов, e-mail: info@gamaleya.org
Shevlyagina Natalya Vladimirovna, Federal Scientific Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honored Academician N.F. Gamaleya, Moscow, Russian Federation, Candidate of Medicine, Senior Research Worker of Anatomy Microorganisms Laboratory, e-mail: info@gamaleya.org
