CC BY
16
Таблица 1
Выявляемость в клещах различных возбудителей КИ. Выборка №1 (306 особей)
Один возбудитель 48,7 % (149) Микст-инфицированность 13,4 % (41)
ВКЭ Б А Э ВКЭ/Б ВКЭ/Э Б/А Б/Э ВКЭ/ ВКЭ/ Б/А/Э
Б/А Б/Э
3,6 % 42,8 % 0,7 % 1,6 % 2,6 % 0 % 2,3 % 7,5 % 0 % 0,3 % 0,7 %
(11) (131) (2) (5) (8) (0) (7) (23) (0) (1) (2)
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита; Б - B. burgdorferi s.l.; А - Anaplasma phagocytophilum; Э - Ehrlichia muris.
Таблица 2
Выявляемость в клещах различных возбудителей КИ. Выборка №2 (443 особи)
Один возбудитель 40,4 % (179) Микст-инфицированность 5,2 % (23)
ВКЭ Б А Э ВКЭ/Б ВКЭ/Э Б/А Б/Э ВКЭ/ Б/А ВКЭ/ Б/Э Б/А/Э
1,4 % (6) 36,8 % (163) 1,1 % (5) 1,1 % (5) 1,4 % (6) 0,2 % (1) 0,5 % (2) 2,3 % (10) 0,2 % (1) 0,5 % (2) 0,2 % (1)
табл. 1) и 5,2 % (выборка № 2, табл. 2). Половина анализированных клещей была инфицирована бор-релиями комплекса B.burgdorferi s.l. Для произвольно отобранных 57 образцов, в которых идентифицирована ДНК боррелий, было проведено секвени-рование участка линейной хромосомы гена RecA. 31,6 % боррелий (18 из 57) относились к виду B.afzelii, 68,4 % (39 из 57) - к B.garinii.
Общая выявляемость ДНК A.phagocytophilum в двух выборках клещей составила 3,3 % (10 из 306 клещей) и 2 % (9 из 443) соответственно. С помощью ПЦР-ана-лиза ДНК эрлихий была выявлена в 9,8 % (30 из 306) и 4,1 % (18 из 443) анализируемых клещей. Все образцы эрлихий, обнаруженных в клещах, на основании данных секвенирования были отнесены к Ehrlichia muris. Данные скрининга клещей свидетельствуют, что наличие в них ВКЭ или B.burgdorferi s.l. не исключает его инфицирования возбудителями ГАЧ и МЭЧ: более половины случаев выявления последних соответствуют микст-инфицированным клещам. При этом в большинстве случаев количество анаплазм и эрлихий
в клещах (в том числе с микст-формами инфицирования) достаточно велико и заметно превышает содержание боррелий.
Полученные данные свидетельствуют о высокой зараженности иксодовых клещей возбудителями КИ, что указывает на значительный риск инфицирования в случае укуса клеща, а также на вероятность микст-инфицирования человека. Примененные в работе наборы на основе метода ПЦР в реальном времени характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью, достаточной для выявления возбудителей КИ в клещах и в случае низких нагрузок. Эти особенности, а также возможность одновременного выявления нескольких возбудителей КИ в составе одного клеща делают данный метод безусловно актуальным для массовой лабораторной диагностики, направленной на выявление возбудителей в клещах, поступающих в диагностические лаборатории от пострадавшего населения, и проведения дальнейшего превентивного этиотропного лечения с целью предотвращения развития заболеваний.
ПРОБЛЕМА «СМЕНЫ» ГЕНОТИПА ВКЭ НА УРАЛЕ ЗА ПОСЛЕДНИЕ 60 ЛЕТ
С.Ю. Ковалев, Т.А. Мухачева
Уральский федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, г. Екатеринбург
Проблема распространения и эволюции вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) во многом еще остается terra incognita, и любое исследование в этой области представляет значительный научный интерес. В журнале «Вопросы вирусологии» в год 70-летнего юбилея открытия ВКЭ вышла статья «Эволюция клещевого эн-
цефалита и проблема эволюции возбудителя» (Погодина и др., 2007). В данной публикации авторы, основываясь на сравнении так называемых хронологических рядов штаммов ВКЭ, описали любопытный феномен изменения генотипического состава штаммов ВКЭ, выделенных в разные годы за почти 70-летний период на
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
территории Свердловской области. На основании этого авторы статьи делают вывод - в Свердловской области за 60 лет произошли кардинальные изменения в структуре популяций ВКЭ: дальневосточный подтип, который доминировал в 40-е годы ХХ века, был замещен сибирским подтипом, занявшим его экологическую нишу.
Действительно, присутствие штаммов ВКЭ дальневосточного генотипа (Дв-ВКЭ) на территории Свердловской области в 40-х годах прошлого века и их исчезновение к настоящему времени - бесспорный научный факт. Однако предлагаемая интерпретация данного факта вводит в заблуждение специалистов-эпидемиологов, создавая у них искаженное представление о закономерностях формирования природных очагов клещевого вирусного энцефалита (КВЭ). Так, в Постановлении Главного санитарного врача РФ от 12 мая 2011 г. № 53 «Об усовершенствовании эпидемиологического надзора и профилактических мероприятий в отношении клещевого вирусного энцефалита» можно прочесть следующее: «.. .результаты многолетних исследований в области молекулярной эпидемиологии КВЭ с использованием штаммов, выделенных в разные годы (начиная от 40-х годов ХХ века до настоящего времени) и на различных территориях Российской Федерации, указывают на то, что за последние 50-60 лет происходит смена дальневосточного генотипа вируса возбудителя КВЭ на сибирский, что может оказать влияние на эффективность проводимых профилактических мероприятий». Чтобы исправить сложившуюся ситуацию, мы хотели бы аргументированно показать несостоятельность представления о смене генотипа ВКЭ на Среднем Урале.
В недавно опубликованной работе путем сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е у 165 изолятов, выделенных в разные годы на территории Свердловской области, была установлена выраженная генетическая структура популяции ВКЭ сибирского генотипа (Сиб-ВКЭ) (Kovalev et а!., 2009). На основе расчета скорости нуклеотидных замен было показано, что возраст вирусной популяции составляет приблизительно 400 лет, т. е. первые штаммы Сиб-ВКЭ появились на Среднем Урале не ранее начала XVII века. Эти данные хорошо согласуются со временем начала колонизации Западной Сибири Московским государством в конце XVI века. Следовательно, современная популяция Сиб-ВКЭ на территории Свердловской области формировалась на протяжении нескольких столетий, а не в последние 60 лет, как следует из выводов авторов обсуждаемой гипотезы.
Для обоснования концепции смены генотипов приводится следующий довод: «Причины смены подтипов ВКЭ могут быть связаны с комплексом экологических факторов, прежде всего с изменением экосистем вследствие антропогенной трансформации естественных ландшафтов. Интенсивная промышленная эксплуатация лесов, разнообразных природных ресурсов и другие виды хозяйственной деятельности и социальной активности привели к формированию производных лесов с новыми растительными группировками». На первый взгляд все правильно, однако не учитывается то обстоятельство, что наряду с вышесказанным происходили и обратные процессы. Так, по материалам информационно-справочной базы данных «Города и села Среднего Урала в XX веке», из 2807 постоянных населенных пунктов, расположенных в сельских райо-
нах Свердловской области, в 1930-1980-е гг. исчезли по разным причинам 1267 поселений, т. е. 45,1 %. Иными словами, на значительной территории Свердловской области антропогенно трансформированные ландшафты возвращались к своему естественному состоянию как раз в то время, когда, по мнению авторов, происходила смена генотипов ВКЭ. Следовательно, на таких территориях должны были сохраниться многочисленные эндемичные очаги с циркуляцией штаммов Дв-ВКЭ. К настоящему времени среди изученных нами 400 современных изолятов ВКЭ, выделенных в разных районах области (в том числе самых отдаленных и малонаселенных), Дв-ВКЭ был зафиксирован только в одном случае в 2007 г. (Каменск-Уральский район), что составляет менее 0,003 % от всех изученных изолятов. Однако последующие попытки обнаружить в том же районе штаммы ВКЭ этого генотипа были безуспешными. Таким образом, мы констатируем факт исчезновения штаммов Дв-ВКЭ на территории Среднего Урала.
В качестве ключевого доказательства смены генотипов ВКЭ приводятся результаты исследования 23 штаммов, выделенных М.П. Чумаковым с сотрудниками в 1939-1945 гг. на территории Свердловской области. Ретроспективное генотипирование этих штаммов показало абсолютное доминирование Дв-ВКЭ (22 (95,7 %) из 23 штаммов). К сожалению, отсутствует информация о том, сколько из этих штаммов было выделено из природы, т. е. от клещей и мелких млекопитающих, а сколько - из клинического материала. Однако как минимум восемь штаммов из этой группы, чей фрагмент генома удалось расшифровать, были выделены от больных и погибших от КВЭ людей. Отсюда можно сделать предположение о том, что значительная доля штаммов начала 40-х гг. была получена из клинического материала. Очевидно, что делать выводы о распределении генотипов ВКЭ на основе таких штаммов нельзя, так как выборка не является случайной. Известно, что КВЭ, вызванный вирусами разных генотипов, может существенно отличаться по клиническому проявлению. Как правило, более тяжелые формы КЭ с наибольшей летальностью отмечается у Дв-ВКЭ, тогда как для Сиб-ВКЭ характерны лихорадочные и менингеальные формы. Объективно оценить распределение генотипов ВКЭ на отдельно взятой территории можно только по штаммам, выделенным из природы.
Нами была изучена коллекция штаммов ВКЭ Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций, собранная с 1966 по 1986 г. Из 59 штаммов, выделенных на территории Свердловской области, 11 (18,6 %) принадлежали Дв-ВКЭ, шесть из которых были выделены из клинического материала. Важно отметить, что пять из них были филогенетически близки вышеупомянутым штаммам 40-х гг. Оценка возраста этих штаммов показывает, что время их появления на территории Среднего Урала приходится на первую половину XX в., что свидетельствует о заносном характере их происхождения. Последующее исчезновение штаммов Дв-ВКЭ с территории области, вероятнее всего, произошло по причине их вытеснения аборигенными штаммами Сиб-ВКЭ.
В сущности, речь идет не о смене одного генотипа другим, а о причинах заноса штаммов Дв-ВКЭ на Урал, в Западную Сибирь, а также европейскую часть бывшего СССР. В 2010 г. было высказано предположение о том, что одной из причин распространения неэнде-
мичных штаммов ВКЭ стала реализация государственной программы по акклиматизации охотничье-промыс-ловых зверей и птиц (Кота1ет et а!., 2010). Эта программа действовала с начала 30-х до начала 90-х гг. прошлого века - фактического распада Советского Союза. В результате более миллиона особей 45 видов млекопитающих и около полумиллиона особей восьми видов птиц было переселено из различных территорий, в том числе и с Дальнего Востока, на Урал и европейскую часть
СССР. Большинство из этих животных являются естественными прокормителями иксодовых клещей и вовлечены в циркуляцию ВКЭ.
Подводя итог, можно с уверенностью утверждать: проблемы смены генотипов не существует, есть проблема понимания причин, по которым штаммы Дв-ВКЭ заносились на неэндемичные территории. В основе этих причин, по нашему мнению, лежит прежде всего антропогенный фактор.
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСОВ ДЕНГЕ (НУ ТИПОВ) МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Е.В. Найденова, Ю.И. Яшечкин, С.А. Щербакова
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов
За последнее десятилетие в мире произошло значительное увеличение случаев заболевания лихорадкой Денге и геморрагической лихорадкой Денге во многих эндемичных регионах.
В настоящее время эта инфекционная болезнь приобретает актуальность и для России в связи с тем, что одни из наиболее популярных мест отдыха россиян расположены на территориях, где отмечаются случаи заболевания людей лихорадкой Денге (Таиланд, Карибские острова). Завозные случаи лихорадки Денге зарегистрированы в различных регионах Российской Федерации (В.Ф. Ларичев и др., 2007). На территории России в районе Большого Сочи (Краснодарский край) были обнаружены местные популяции комаров Aedes aegypti (Ю.В. Юничева и др., 2008) - основных переносчиков вирусов Денге.
Одним из методов лабораторной диагностики лихорадки Денге является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
На сегодняшний день в России отсутствуют зарегистрированные коммерческие препараты для обнаружения и дифференциации вирусов Денге, разработанные на основе амплификационных технологий. Целью нашей работы являлось конструирование набора для выявления РНК вирусов Денге (I-IV типов) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы. Для подбора праймеров из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/ Genbank /Genbank /overview. html) выбрана 2441 полная нуклеотидная последовательность вирусов Денге, из которых: первого типа - 1151, второго - 650, третьего - 549 и 91 - четвертого типа. При клонировании наработанных фрагментов использовали вектор pTZ57R/T («Fermentas», Литва) с последующей трансформацией штамма Escherichia coli JM109. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора «AxyPrep Plasmid Miniprep Kit» («Axygen», США). Оценку чувствительности и специфичности проводили с 11 препаратами кДНК вирусов, 2 бактериальными штаммами, а также с образцами кро-
ви и сыворотки здоровых доноров, суспензии печени и селезенки мелких млекопитающих. ДНК и РНК получали с использованием наборов «Рибо-сорб» («Интер-лабсервис», Россия). Реакцию обратной транскрипции проводили с набором «REVERTA-L» («Интерлабсер-вис», Россия).
Результаты и обсуждение. Для подбора праймеров выбрали область неструктурных протеинов NS3 и NS5. В связи с высокой вариабельностью вирусных нуклеиновых кислот и для повышения надежности выявления РНК вирусов в ОТ-ПЦР было решено использовать праймеры на два локуса из каждого генома, т. е. всего восемь локусов. Для получения сведений о ком-плементарности выбранных праймеров к NS5 и NS3-сегментам РНК вирусов Денге, а также для выявления участков неспецифического связывания с нуклеотид-ными последовательностями других видов вирусов, бактерий и ДНК человека выбранные праймеры были протестированы с помощью программы для обработки базы данных BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/ BLAST). Анализ полученных результатов показал, что праймеры специфически комплементарны (с рассчитанной степенью гомологии) к нуклеотидной последовательности выбранных фрагментов РНК вирусов Денге. С близкородственными вирусами ком-плементарность отсутствовала.
В результате последующих экспериментов были оптимизированы условия проведения ПЦР с выбранными праймерами.
Для повышения уровня биологической безопасности при работе с диагностическим препаратом нами в качестве положительного контрольного образца (ПКО) предложено использование рекомбинантных молекул, содержащих известную последовательность ДНК, которые безопасны, стабильны при хранении. Клонирование наработанных фрагментов проводили с вектором pTZ57R/T («Fermentas», Литва), полученной ре-комбинантной плазмидой трансформировали штамм E. coli JM109. Рекомбинантные клоны отбирали на
