CC BY
9
Проблема химиорезистентности PRAME-экспрессирующей клетки меланомы и способ ее преодоления c помощью бортезомиба
В.А. Мисюрин1, Д.В. Калениченко2, А.А. Рудакова1, Ю.П. Финашутина1, Н.А. Лыжко1, В.В. Тихонова1, Л.А. Кесаева1, О.Н. Солопова1, А.Е. Мисюрина3, А.Н. Великанов4, М.А. Барышникова1, А.В. Мисюрин1
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА им. К.И. Скрябина»;
Россия, 109472 Москва, ул. Скрябина, 23; ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4; ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 119991 Москва, Ленинские горы, 1
Контакты: Всеволод Андреевич Мисюрин [email protected]
Введение. В настоящее время показано, что активность раково-тестикулярного гена PRAME, характерная только для опухолевой клетки, может контролироваться сигнальным каскадом NF-kB. Белок PRAMEувеличивает жизнеспособность опухолевой клетки. Отсюда следует, что стрессовые условия могут повышать уровень экспрессии PRAME и увеличивать жизнеспособность опухолевой клетки. Мы предположили, что данный феномен определяет химиорезистентность PRAME-экспрессирующей клетки. Эту резистентность можно преодолеть ингибиторами NF-кВ-пути, такими как бортезомиб.
Материалы и методы: инкубирование в течение суток клеток меланомы линии A875 с цисплатином, бортезомибом и дексаме-тазоном, смесью цисплатина и бортезомиба, а также со смесью цисплатина и дексаметазона. Для оценки цитотоксичности применяемых препаратов использовали МТТ-тест, уровня экспрессии гена PRAME — полимеразную цепную реакцию в реальном времени. Анализ данных проводили с помощью критерия Вилкоксона для связанных выборок.
Результаты. Установлено, что цисплатин и дексаметазон увеличивают уровень экспрессии PRAME по сравнению с клетками меланомы линии A875, не подвергнутыми действию экспериментальных веществ (p <0,03). Добавление дексаметазона к цисплатину снижает цитотоксический эффект последнего. Бортезомиб обладает цитотоксическим действием, но практически не увеличивал активность гена PRAME (p = 0,12). В клетках, инкубированных со смесью цисплатина и бортезомиба, активность гена PRAME находилась на более низком уровне по сравнению с клетками, инкубированными с цисплатином (p = 0,0277).
Заключение. Результаты экспериментов показывают, что увеличение уровня экспрессии гена PRAME снижает чувствительность клеток к цитотоксическому действию цисплатина. Активность PRAME увеличивается в условиях стресса. Применение бортезомиба препятствует росту уровня экспрессии PRAME и делает опухолевую клетку более уязвимой к цитотоксическим агентам. С другой стороны, дексаметазон может увеличить резистентность PRAME-экспрессирующей клетки к цитотоксическому воздействию цисплатина.
Ключевые слова: PRAME, меланома, цисплатин, бортезомиб, дексаметазон, лекарственная резистентность
Для цитирования: Мисюрин В.А., Калениченко Д.В., Рудакова А.А. и др. Проблема химиорезистентности PRAME-экспрессиру-ющей клетки меланомы и способ ее преодоления при помощи бортезомиба. Успехи молекулярной онкологии 2018;5(4):131—4.
cv
CS
и ш u
DOI: 10.17650/2313-805X-2018-5-4-131-134
Chemoresistance of PRAME-expressing melanoma cell can be resolved with help of bortezomib
V.A. Misyurin1, D.V. Kalenichenko2, A.A. Rudakova1, Yu.P. Finashutina1, N.A. Lyzhko1, V.V. Tikhonova1, L.A. Kesaeva1, O.N. Solopova1,
A.E. Misyurina3, A.N. Velikanov4, M.A. Baryshnikova1, A.V. Misyurin1
'N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow ''5478, Russia; 2K.I. Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology; 23 Akademika Skryabina St., Moscow '09472, Russia; 3National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow '25167, Russia; 4M.V. Lomonosov Moscow State University; ' Leninskie Gory, Moscow ''999', Russia
Background. PRAME gene spontaneous expression is frequently observed in a cancer cell. The protein encoded by this gene increases the viability of tumour cell. NF-kB signalling pathway takes part in PRAME upregulation. It proposes, that stress conditions may increase the expression level of PRAME in the tumour cell and increase cell's viability after it. We hypothesized that this phenomenon determines chemoresistance of PRAME-expressing cell, which can be overcome by NF-kB inhibitors, such as bortezomib.
CV
us
и ш U
Materials and methods. We incubated A875 melanoma cells with cisplatin, bortezomib and dexamethasone, as well as with a mixture of cisplatin with bortezomib and cisplatin with dexamethasone within 24 hours. To assess the cytotoxicity of these combinations MTT-test was used. For evaluation of PRAME expression level, real-time polymerase chain reaction was used. All data were analyzed with Wilcoxon test for coupled samples.
Results. It was found that cisplatin and dexamethasone increased an expression level of PRAME compared to control (p <0.03). The addition of dexamethasone to cisplatin reduced cytotoxic effect of cisplatin. Bortezomib has a cytotoxic effect, but it did not increase the activity of PRAME gene (p = 0.12). PRAME gene activity in cells incubated with a mixture of cisplatin and bortezomib was observed at a lower level in comparison with cells incubated with cisplatin (p = 0.0277).
Conclusion. The results of experiments show that an increase of PRAME expression level reduces the sensitivity of melanoma cells to the cytotoxic effect of cisplatin. PRAME activity increases under stress conditions. Using of bortezomib can inhibit the growth of PRAME expression and makes the tumour cell more vulnerable to cytotoxic agents. On the other hand, dexamethasone may increase a resistance of PRAME-expressing cell to cytotoxic effects.
Key words: PRAME, melanoma, cisplatin, bortezomib, dexamethasone, drug resistance
For citation: Misyurin V.A., Kalenichenko D.V., Rudakova A.A. et al. Chemoresistance of PRAME-expressing melanoma cell can be resolved with help of bortezomib. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2018;5(4):131—4.
x ш
и
Введение
Раково-тестикулярный ген РЯЛМЕ экспрессиру-ется при онкологических и онкогематологических заболеваниях, но не активен в нормальной клетке. Свойства белка PRAME таковы, что увеличивают жизнеспособность опухолевой клетки. PRAME блокирует TRAIL-опосредованный апоптоз, защищает клетку от отравления солями тяжелых металлов, блокирует дифференцировку и увеличивает скорость пролиферации [1—5]. При лечении множества онкологических заболеваний гиперэкспрессия РЯЛМЕ становится проблемой, так как она связана с прогрессией и неблагоприятным исходом [5].
Проблема РЯЛМЕ-опосредованной лекарственной резистентности усугубляется тем, что активность РЯЛМЕ у больных наблюдается чрезвычайно часто — примерно в каждом 2-м случае [6]. Очевидно, что для нивелирования последствий экспрессии РЯЛМЕ нужно найти способ ее блокировки на уровне транскрипции РНК или функций зрелого белка.
Возможностью для снижения уровня активности гена РЯЛМЕ может быть блокирование внутриклеточных сигнальных путей. Так, в культуре трансформированных клеток НL60 экспрессия РЯЛМЕ может быть опосредована провоспалительными сигнальными путями, в том числе, возможно, и NF-кB, так как промотор гена РЯЛМЕ имеет последовательности, распознающиеся субъединицами ЯеЬА комплекса NF-кB [7]. Некоторые препараты способны блокировать инициацию передачи сигнала по NF-кB-зависимому пути. Один из таких препаратов — дексаметазон, применяемый для купирования воспаления [8]. Известно также, что белок PRAME является компонентом комплекса убиквитинлигазы Е2 [7]. Функция PRAME в этом комплексе заключается в распознавании белковых субстратов, которые убиквитинируются и деградируют в протеасоме. Несмотря на то что эти субстраты пока неизвестны, можно предположить, что данное свойство позволяет опухолевой клетке активно перерабатывать поврежденные белки, что снижает ее
чувствительность к химиопрепаратам. Таким образом, использование ингибиторов протеасом может подавить PRAME-опосредованную деградацию белков. В результате жизнеспособность РЯЛМЕ-экспрессирующей клетки снизится. Действительно, бортезомиб, инги-бирующий функции протеасом, улучшает прогноз РЯЛМЕ-экспрессирующих больных множественной миеломой. Терапия, не включающая бортезомиб, оказывается менее результативной при лечении таких больных [9]. Бортезомиб интересен также тем, что стабилизирует 1кВ, который, в свою очередь, препятствует активации NF-кB [10].
Как дексаметазон, так и бортезомиб можно сочетать с традиционными химиопрепаратами, в том числе с цисплатином. В данном исследовании мы определили чувствительность клеток меланомы линии А875 (пример опухоли, для которой типична гиперэкспрессия РЯЛМЕ) [11] к различным сочетаниям дексамета-зона (Эллара, Россия), бортезомиба (Ф-Синтез, Россия) и цисплатина (Цисплатин-РОНЦ, Россия), ожидая, что блокирование функций РЯЛМЕ на уровне матричной РНК или белка увеличит цитотоксический эффект цисплатина.
Материалы и методы
На 1-м этапе методом МТТ-теста мы определяли концентрацию перечисленных веществ, при которой в течение суток инкубирования погибало 50 % клеток А875. Для цисплатина эта концентрация составила 20 мкг/мл, для бортезомиба — 86 мкг/мл. Дексаметазон оказался не токсичным для этих клеток. Более того, инкубирование клеток с дексаметазоном увеличивало скорость их роста примерно на 10 %.
На следующем этапе мы определили, какое влияние оказывают используемые препараты на уровень экспрессии гена РЯЛМЕ в опухолевой линии через сутки инкубирования. Концентрация цисплатина при инкубировании составила 20 мкг/мл, бортезомиба — 10 и 0,4 мкг/мл, дексаметазона — 100 мкг/мл. Выбор концентрации обоснован использованием
Эффекты от воздействия химиопрепаратов Effects of chemotherapy drug interactions
ТИп воздействия Interaction type Медиана уровня экспрессии PRAME в процентах относительно контрольного гена ABL Сравнение с контролем, p Comparison with control, p Доля погибших клеток, %
Нет(контроль) No (control) 5308 2
Цисплатин, 20 мкг/мл Cisplatin, 20 Hg/ml 42 900 0,0277 50
Бортезомиб,10 мкг/мл 0990 Bortezomib, 10 Hg/ml 6990 0,1158 24
Бортезомиб, 0,4 мкг/мл 6372 Bortezomib, 0.4 Hg/ml 03/2 0,2804 5
Дексаметазон, 100 мкг/мл 44 941 Dexamethasone, 100 Hg/ml 0,0277 1
Цисплатин, 20 мкг/мл + бортезомиб, 10 мкг/мл 22 ,30 Cisplatin, 20 Hg/ml + bortezomib, 10 Hg/ml 22 130 0,0277 59
Цисплатин, 20 мкг/мл + бортезомиб, 0,4 мкг/мл 21 080 Cisplatin, 20 Hg/ml + bortezomib, 0.4 Hg/ml 21 080 0,0404 54
Цисплатин, 20 мкг/мл + дексаметазон, 100 мкг/мл 84 200 Cisplatin, 20 Hg/ml + dexamethasone, 100 Hg/ml 84 200 0,0277 44
cv
CS
и ш u
цисплатина в дозе IC50 дальнейших экспериментов, а сниженная концентрация бортезомиба подобрана для возможности сочетать его с цисплатином и сохранить при этом достаточное количество клеток. Концентрация дексаметазона соответствовала той, которая достигается в крови при введении препарата больному. Согласно данным количественной полиме-разной цепной реакции в реальном времени циспла-тин и дексаметазон значимо увеличивают уровень экспрессии гена PRAME (см. таблицу). После инкубирования с бортезомибом активность PRAME менялась незначимо.
На заключительном этапе эксперимента мы проверили эффекты сочетания цисплатина с бортезомибом и дексаметазоном. Инкубирование линии A875 с цисплатином и бортезомибом приводило к гибели большего количества клеток и к менее выраженному увеличению уровня экспрессии PRAME по сравнению с клетками, инкубированными только с цисплатином (p = 0,0303). С другой стороны, добавление дексаметазона и цисплатина снижало количество погибших клеток и вдвое увеличивало активность PRAME (p = 0,0277) по сравнению с результатами, полученными после инкубирования с цисплатином (см. таблицу).
Результаты
Таким образом, стрессовые условия, такие как повреждение самих опухолевых клеток с помощью цисплатина, приводят к увеличению уровня экспрессии гена PRAME. В результате гиперэкспрессия PRAME снижает чувствительность опухолевой клетки к стрессу в целом и химиопрепаратам в частности. Это позволяет PRAME-положительным клеткам опухоли очень быстро приобретать резистентность к химиопрепара-там не путем естественного отбора новых клонов, а увеличением уровня экспрессии PRAME в уже существующих. Это следует из увеличения уровня экспрессии PRAME на порядок, в то время как погибла только половина клеток.
Заключение
Наиболее важное следствие наших результатов — возможность не допускать увеличения уровня экспрессии гена PRAME с помощью бортезомиба — известного и достаточно доступного препарата. Поскольку экспрессия PRAME не является обязательной для нормальной соматической клетки, отрицательных для организма последствий блокирования функций белка ожидать не следует, в то время как резистентность опухолевой клетки не будет увеличиваться.
ж ш
и
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
CV
us
и ш U
1. Epping M.T., Wang L., Plumb J.A. et al. A functional genetic screen identifies reti-noic acid signaling as a target of histone deacetylase inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(45):17777-82.
DOI: 10.1073/pnas.0702518104. PMID: 17968018.
2. Passeron T., Valencia J.C., Namiki T. et al. Upregulation of SOX9 inhibits the growth of human and mouse melanomas and restores their sensitivity to retinoic acid.
J Clin Invest 2009;119(4):954-63. DOI: 10.1172/JCI34015. PMID: 19273910.
3. Oehler V.G., Guthrie K.A., Cummings C.L. et al. The preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME) inhibits myeloid differentiation in normal hematopoietic and leukemic progenitor cells. Blood 2009;114(15):3299-308. DOI: 10.1182/ blood-2008-07-170282. PMID: 19625708.
4. Kim H.L., Seo Y.R. Molecular and ge-nomic approach for understanding the gene-environment interaction between Nrf2 deficiency and carcinogenic nickel-
induced DNA damage. Oncol Rep 2012;28(6):1959-67. DOI: 10.3892/ or.2012.2057. PMID: 23023193.
5. Zhang W., Chi K., Zhang Y. et al. Correlation between preferentially expressed antigen of melanoma and tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene expression in different types of leukaemia patients. Acta Haematol 2013;130(4): 297-304. DOI: 10.1159/000351166. PMID: 24008770.
6. Yao J., Caballero O.L., Yung W.K. et al. Tumor subtype-specific cancer-testis antigens as potential biomarkers and immuno-therapeutic targets for cancers. Cancer Immunol Res 2014;2(4):371-9.
DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-13-0088. PMID: 24764584.
7. Wadelin F.R., Fulton J., Collins H.M. et al. PRAME is a golgi-targeted protein that associates with the Elongin BC complex and is upregulated by interferon-gam-ma and bacterial PAMPs. PLoS One 2013;8(2):e58052. DOI: 10.1371/journal. pone.0058052. PMID: 23460923.
8. Bhattacharyya S., Ratajczak C.K., Vogt S.K. et al. TAK1 targeting by glucocorticoids determines JNK and IkappaB regulation in Toll-like receptor-stimulated macrophages. Blood 2010;115(10): 1921-31. DOI: 10.1182/ blood-2009-06-224782.
PMID: 20065289.
9. Qin Y., Lu J., Bao L. et al. Bortezomib improves progression-free survival in multiple myeloma patients overexpressing preferentially expressed antigen of melanoma. Chin Med J (Engl) 2014;127(9):1666-71. PMID: 24791872.
10. Chen D., Frezza M., Schmitt S. et al. Bortezomib as the first proteasome inhibitor anticancer drug: current status and future perspectives. Curr Cancer Drug Targets 2011;11(3):239-53. PMID: 21247388.
11. Ikeda H., Lethe B., Lehmann F. et al. Characterization of an antigen that is recognized on a melanoma showing partial HLA loss by CTL expressing an NK inhibitory receptor. Immunity 1997;6(2): 199-208. PMID: 9047241.
X ш
и
Вклад авторов
В.А. Мисюрин: разработка дизайна исследования, анализ полученных данных, написание текста рукописи; Д.В. Калениченко, А.А. Рудакова, Н.А. Лыжко, В.В. Тихонова, А.Н. Великанов, Л.А. Кесаева: получение данных для анализа; Ю.П. Финашутина: написание текста рукописи; О.Н. Солопова: анализ полученных данных;
А.Е. Мисюрина: разработка дизайна исследования, анализ полученных данных;
М.А. Барышникова, А.В. Мисюрин: разработка дизайна исследования, доработка финальной рукописи. Authors' contributions
V.A. Misyurin: developing the research design, analysis of the obtained data, article writing;
D.V. Kalenichenko, A.A. Rudakova, N.A. Lyzhko, V.V. Tikhonova, A.N. Velikanov, L.A. Kesaeva: obtaining data for analysis;
Yu.P. Finashutina: article writing;
O.N. Solopova: analysis of the obtained data;
A.E. Misyurina: developing the research design, analysis of the obtained data;
M.A. Baryshnikovа, A.V. Misyurin: developing the research design, finalizing the final manuscript.
ORCID авторов/ORCID of authors
B.А. Мисюрин/V.A. Misyurin: https://orcid.org/0000-0002-0762-5631
Ю.П. Финашутина/Yu.P. Finashutina: https://orcid.org/0000-0002-6154-535X Н.А. Лыжко/N.A. Lyzhko: https://orcid.org/0000-0003-3834-5816 В.В. Тихонова/V.V. Tikhonova: https://orcid.org/0000-0002-8658-2819 Л.А. Кесаева/L.A. Kesaeva: https://orcid.org/0000-0001-8277-8649 О.Н. Солопова/O.N. Solopova: https://orcid.org/0000-0002-5465-6094 А.Е. Мисюрина/A.E. Misyurina: https://orcid.org/0000-0002-9535-6688 А.Н. Великанов/A.N. Velikanov: https://orcid.org/0000-0002-3819-8564 М.А. Барышникова/M.A. Ba^hm^^: https://orcid.org/0000-0002-6688-8423 А.В. Мисюрин/A.V. Misyurin: https://orcid.org/0000-0003-1349-2879
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding.
Статья поступила: 02.10.2018. Принята к публикации: 31.10.2018. Article received: 02.10.2018. Accepted for publication: 31.10.2018.
