CC BY
3Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 40 - 45 The Veterinarian. 2024; (1): 40 - 45
Научная статья
УДК 619:576.807.7.57.083.13
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_40
ПРИЖИВАЕМОСТЬ И ИММУНОГЕННОСТЬ R-КУЛЬТУРЫ БРУЦЕЛЛ, ПОЛУЧЕННОЙ ГЛУБИННЫМ СПОСОБОМ
Максим Аркадьевич Косарев, кандидат биологических наук, 2531468@mail.ru Рамиль Юнусович Насибуллин, n-ramil@bk. ru
Гульнара Минирашитовна Сафина, кандидат ветеринарных наук, narka1976@mail.ru Яна Александровна Богова, dragyana@yandex.ru
Вадим Расимович Саитов, доктор биологических наук, sinsavara@yandex.ru
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Рамиль Юнусович Насибуллин
Аннотация: При освоении технологии суспензионного культивирования в лабораторном ферментёре выявляются особенности роста бруцелл. Прежде всего, они свидетельствуют о принципиальной возможности суспензионного выращивания бруцелл в жидких средах с сохранением основных морфологических, культурально-биохимических, приживаемости в живом организме и, главное, им-муногенных свойств R-культуры. В логарифмической фазе роста проявляется высокая уреазная, ката-лазная активность и способность продуцировать сероводород особенно в жидкой среде. Культура бруцелл R-штамма обладает хорошей приживаемостью в организме подопытных животных. Это подтвердилось тем, что бруцеллы выделялись из органов и лимфоузлов животных при вскрытии. 72-х часовая культура бруцелл, которая близка к исходной культуре, является наибольшим показателем дис-семинации и по иммуногенным свойствам определённо находится ближе к ней, в отличие от 24 и 48 часовых культур. Данное обстоятельство определяет целесообразность применения R-культуры, которая находится в логарифмической фазе роста.
Сконструированная нами полусинтетическая среда и соблюдение условий при культивировании бруцелл в лабораторном ферментёре обеспечило сохранение стабильности иммуногенных свойств вакцинных штаммов бруцелл.
Ключевые слова: питательная среда, агар, культура, приживаемость, свойства, животные, стабильность
Для цитирования: Косарев М.А.,.Насибуллин Р.Ю., Сафина Г.М., Богова Я.А., Саитов В.Р. Приживаемость и иммуногенность R-культуры бруцелл, полученной глубинным способом // Ветеринарный врач. 2024. № 1. С. 40 - 45. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_1_40
ESTABLISHMENT AND IMMUNOGENICITY OF BRUCELLA R-CULTURES OBTAINED
BY THE DEEP METHOD
Maxim Arkadyevich Kosarev, candidate of biological sciences, 2531468@mail.ru Ramil Yunusovich Nasibullin, n-ramil@bk.ru
Gulnara Minirashitovna Safina, candidate of veterinary sciences, narka1976@mail.ru Yana Aleksandrovna Bogova, dragyana@yandex.ru
Vadim Rasimovich Saitov, doctor of biological sciences, sinsavara@yandex.ru
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Ramil Yunusovich Nasibullin
Abstract: When mastering the technology of suspension cultivation in a laboratory fermenter, the growth characteristics of Brucella are revealed. First of all, they indicate the fundamental possibility of suspension cultivation of Brucella in liquid media while maintaining the basic morphological, cultural-biochemical, survival in a living organism and, most importantly, immunogenic properties of the R culture. In the logarithmic growth phase, high urease and catalase activity and the ability to produce hydrogen sulfide are manifested, especially in a liquid medium. The R-strain Brucella culture has good survival rate in the body of experimental animals. This was confirmed by the fact that Brucella was isolated from the organs and lymph nodes of animals during autopsy. The 72-hour Brucella culture, which is close to the original culture, is the highest indicator of dissemination and is definitely closer to it in terms of immunogenic properties, in contrast to the 24 and 48-hour cultures. This circumstance determines the feasibility of using R-culture, which is in the logarithmic growth phase.
The semi-synthetic medium we constructed and compliance with the conditions for cultivating Brucella in a laboratory fermenter ensured the stability of the immunogenic properties of the Brucella vaccine strains.
Keywords: nutrient medium, agar, culture, survival rate, properties, animals, stability
Введение. Стабильность иммуногенных свойств вакцинных штаммов бактерий является одним из главных критериев оценки методов культивирования микробов и питательных сред, используемых с этой целью. Особенно это важно в отношении таких бактерий, как бруцеллы. Известно, что они весьма предрасположены к изменчивости, следовательно, более требовательны к условиям культивирования и составу питательных сред. Некоторые виды бруцелл изначально находятся в S-форме, но при различных неблагоприятных условиях могут легко диссоциировать в R-форму. В соответствующих благоприятных условиях они реверсируют в S-форму [9,10]. При глубокой диссоциации бруцелл происходят существенные изменения в генетическом аппарате бактериальной клетки. Белки и другие составные элементы микробного тела приобретают при этом новую специфичность.
В соответствии с этим была поставлена задача изучить приживаемость и иммуногенность R-культуры бруцелл, полученной глубинным способом выращивания в сравнении с исходной культурой, полученной с плотной питательной среды.
Материал и методы. Для определения приживаемости и изучения иммуногенных свойств использовали инаглютиногенную R культуру B. Abortus, полученную из жидкой питательной среды и с печёночного агара [4,8]. Брали культуру исходную с ППГГА, 24-, 48-, и 72 часовую из жидкой среды. Опыт ставили на морских свинках, использовано 60 голов. Инъекцию вводили подкожно в область паха с помощью шприца.
Индекс инфицированности вычисляли по формуле
аХ100
X =
bxc
где х- индекс инфицированности (ИИ);
а- число органов и лимфатических узлов, из которых выделены культуры бруцелл; b - число животных в опыте;
с - число органов и лимфатических узлов, взятых для посева от каждого животного.
Электронно-микроскопические исследования бруцелл выполняли по апробированной методике ультратонких срезов [3]. Полутонкие срезы толщиной около 1,5 мкм получали на микротоме LKB - III (Швеция) 8800, окрашивали 1% раствором метиленового синего и просматривали в поле зрения светового поляризационно-интерференционного микроскопа PZO Biolar (Польша) на предмет выбора участка для последующей ультратонкой резки. Ультратонкие срезы толщиной 80 нм получали на микротоме фирмы «Reichert Jung Ultracut E» (Австрия) и помещали на сеточки. Контрастирование срезов проводили «методом капли» в растворах уранил ацетата (2 часа в термостате) и цитрата свинца (1,5 минуты). Срезы просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100 CX-II («Jeol» Japan) на увеличениях 19, 29, 36, 48, 58 и 72 тысяч раз при ускоряющем напряжении 80 кВ. Съемку проводили на фототехническую пленку Agfa orthochromatic. Для получения электронных фотографий негативы оцифровывали на сканере Epson perfection 4990 foto с разрешением 600 dpi. Морфометриче-ская и статистическая обработка микрофотографий производилась с помощью программ AxioVision Rel. 4.8 (Carl Zeiss) и ACDSee Pro v.6.
Результаты исследований. Все культуры бруцелл не зависимо от питательной среды и возраста обладали уреазной, каталазной активностью и способностью продуцировать сероводород. По этим показателям наиболее близко к исходной культуре 72-х часовая культура, т.е. бактерии, находящиеся в логарифмической фазе роста. Следует подчеркнуть, что культуры из жидкой среды проявляли тенденцию к повышенному образованию сероводорода [6].
В таблице 1 представлены результаты исследования приживаемости R-штамма в организме морских свинок в зависимости от возраста культуры.
Таблица 1 - Приживаемость бруцелл R-штамма в организме морских свинок
Культура бруцелл Индекс инфицированности %
Исходная с ППГГА 90
24 часовая из жидкой среды 70
48 часовая из жидкой среды 76,6
72 часовая из жидкой среды 86,6
Из приведённых данных видно, что все культуры бруцелл R-штамма обладали хорошей приживаемостью в организме морских свинок. Через месяц после вакцинации бруцеллы распространялись в организме подопытных животных и выделялись из большинства органов и лимфоузлов. Наибольший показатель диссеминации в организме из культур, полученных суспензионным методом, у 72-х часовой культуры - 86,6%, что на 16,6% и 10% соответственно выше молодых 24 и 48 культур бруцелл. Следовательно, и по иммуногенным свойствам она не уступает исходной культуре, полученной с печёночного агара, по сравнению с 24 и 48 часовыми культурами. Это обстоятельство важно учитывать в том плане, что для лучшей диссеминации в организме, и для создания напряжённого иммунитета целесообразнее использовать R-культуру, в логарифмической фазе роста.
Были проведены исследования по изучению иммуногенных свойств бруцелл R-культуры, выращенных в жидкой питательной среде суспензионным методом. Сводные результаты этих опытов представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Иммуногенные свойства бруцелл R-культур, полученных из жидкой питательной среды и с печёночного агара
Культуры бруцелл Иммунных животных (%) Не иммунных животных ( %) в т.ч.
Всего генерализованная форма регионарная форма
Исходная с ППГГА 30,6 69,4 65,0 4,4
24 часовая из жидкой питательной среды - 100,0 100,0 -
48 часовая из жидкой питательной среды - 100,0 100,0 -
72 часовая из жидкой питательной среды 36,7 63,7 33,2 30,5
96 часовая из жидкой питательной среды 34,3 65,7 35,7 30,0
При проведении электронно-микроскопического анализа данного препарата на электронном микроскопе была определена морфология и тонкая структура бактерий. Размер бактериальных клеток варьировал в пределах 0,4 до 2,5 мкм в длину и от 0,4 до 0,6 мкм в ширину, что присуще бактериям вида Brucella abortus.
Таким образом, проведенная электронная микроскопия срезов R-штамма бруцелл показала, что они имеют одни и те же основные структурные элементы (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, нуклеоид). Однако наряду с этим нашими исследованиями обнаружена кокковид-ность формы диссоцированных R-форм бруцелл, С-образные инвагинаты оболочки и присутствует выраженный бугристо-складчатый рельеф.
R-культуры, отличающиеся между собой по возрасту, той или иной степени вызывали иммунитет у животных. По этим свойствам данные культуры не уступали показателям исходных. В связи с этим можно сделать предварительный вывод, что наибольшей иммуногенностью обладают R-куль-туры, находящиеся в логарифмической фазе роста. В данной фазе бактериальная клетка достигает наиболее полного физиологического развития, с развитой системой ферментативных процессов в ней и наибольшей активностью детерминантных групп, ответственных за биологические свойства микробов. Несколько ниже показатель иммуногенности у молодых культур бруцелл штаммов. Со старением
бруцеллы в значительной степени теряли свои иммуногенные свойства [2]. При этом 10% животных заразились генерализованной формой бруцеллёза.
Рисунок 1 - Клетки живой культуры Brucella abortus R штамма
Условные обозначения: КС - клеточная стенка, ЦП - цитоплазма, ПМ - плазматическая мембрана, МПО - мембраноподобные образования.
Рисунок 2 - Клетки живой культуры Brucella abortus R штамма.
Условные обозначения: КС - клеточная стенка, ЦП - цитоплазма, ПМ - плазматическая мембрана, МСВ - мембраноограниченные сферические везикулы.
При постановке серологических реакций с сыворотками крови морских свинок, показателм РА и РСК зависели в определённой степени от возраста культур. Большинство морских свинок, реагировали положительно в высоких титрах в РА до 640 МЕ-1280 МЕ и в РСК до 1:320. Это свидетельствует дополнительно о прорыве иммунитета у этих животных.
Заключение. Культура бруцелл R-штамма обладает хорошей приживаемостью в организме подопытных животных. 72-х часовая культура обладает наибольшими показателями диссеминации в организме животных и по иммуногенным свойствам не уступает исходной культуре, выращенной на плотной питательной среде, в отличие от 24 и 48 часовых культур. Сохранение основных морфологических, культурально-биохимических и иммуногенных свойств R культуры бруцелл полученных, из жидких питательных сред свидетельствуют о принципиальной возможности суспензионного их выращивания.
Список источников
1. Альбертян, М.П. Стабильность свойств вакцинного штамма В. abortus 104—М при пассировании через организм нетелей (по данным патоморфологии) // Бюллетень ВНИИЭВ. - 1987. - Вып.64. - С. 71-73.
2. Иванов, A.B. Антигенные и иммуногенные свойства у инактивированных культур штаммов B. abortus 82 и 86 на морских свинках / A.B. Иванов, М.А. Косарев, В.П. Шашкаров // Казань. Ветеринарный врач. - 2010. - № 1.- С. 19-22.
3. Иванов А.В. Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов / А.В. Иванов, А.А. Иванов, А.Н. Чернов, М.М. Сальникова, В.Р. Саитов, И.Ф. Рахматуллин, Е.Л. Матвеева // ФГБНУ «Росинформагротех», 2011. - 67 с.
4. Косарев М.А. Изучение оптимальных условий глубинного культивирования R-штамма B. Abortus / М.А. Косарев, Р.Ю. Насибуллин, Г.М. Сафина, А.К. Габбасова // Ветеринария. 2022. № 7. С. 28-3;
5. Косарев, М. А. Иммунологическая эффективность живых и гамма-инактивированных противо-бруцеллезных вакцин для мелкого рогатого скота: специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»: автореф. дис. ... канд. биол. наук / Косарев Максим Аркадьевич; Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных. - Казань, 2011. - 22 с.
6. Косарев М.А. Культуральные, агглютиногенные и биохимические свойства R- культуры бруцелл выращенной глубинно-суспензионным способом / М.А. Косарев, Р.Ю. Насибуллин, Г.М. Сафина, Я.А. Богова // В книге: Инновационные решения актуальных вопросов биобезопасности. Сборник материалов Международной научно-практической конференции. 2022. С. 200-203.;
7. Сафина, Г. М. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма B. abortus R-1096: специальность 03.00.07 «Микробиология», 16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»: автореф. дис. . канд. биол. наук / Сафина Гульнара Миннерашитовна; Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных. - Казань, 2004. - 20 с.
8. Тараканов Ю.И. Глубинное культивирование Br. abortus 19 на бульоне Хоттингера. Микробиологическая промышленность. 1973; 3:51 - 53.
9. Уласевич, П.С. Применение вакцины из штамма РЕВ-1 в целях профилактики бруцеллеза мелкого рогатого скота // Тр. ВИЭВ. - 1974. - Т. 42. - С. 217-219.
10. Elberg, S.S. Immunization against Brucella infection / S.S. Elberg // Med. J. - 1973. - Vol. 52. - №4. - P. 339-342.
References
1. Albertyan, M.P. Stability of the properties of the vaccine strain B. abortus 104-M during passage through the body of heifers (according to pathomorphology) // Bulletin of VNIIEV. - 1987. - Issue 64. - pp. 71-73.
2. Ivanov, A.B. Antigenic and immunogenic properties of inactivated cultures of B.abortus strains 82 and 86 in guinea pigs / A.B. Ivanov, M.A. Kosarev, V.P. Shashkarov // Kazan. Veterinarian. - 2010. - No. 1.- P. 19-22.
3. Ivanov A.V. Methodological recommendations for electron microscopic studies of biological objects / A.V. Ivanov, A.A. Ivanov, A.N. Chernov, M.M. Salnikova, V.R. Saitov, I.F. Rakhmatullin, E.L. Matveeva // Federal State Budgetary Institution "Rosinformagrotech", 2011. - 67 p.
4. Kosarev M.A. Study of optimal conditions for deep cultivation of the R-strain of B. Abortus / M.A. Kosarev, R.Yu. Nasibullin, G.M. Safina, A.K. Gabbasova // Veterinary medicine. 2022. No. 7. P. 28-3;
5. Kosarev, M.A. Immunological effectiveness of live and gamma-inactivated anti-brucellosis vaccines for small cattle: specialty 06.02.02 "Veterinary microbiology, virology, epizootology, mycology with myco-toxicology and immunology": abstract. dis. ...cand. biol. Sciences / Kosarev Maxim Arkadevich; Federal Center for Toxicological and Radiation Safety of Animals. - Kazan, 2011. - 22 p.
6. Kosarev M.A. Cultural, agglutinogenic and biochemical properties of Brucella R-culture grown by deep-suspension method / M.A. Kosarev, R.Yu. Nasibullin, G.M. Safina, Y.A. Bogova // In the book: Innovative solutions to current biosafety issues. Collection of materials of the International Scientific and Practical Conference. 2022. pp. 200-203.
7. Safina, G. M. Comparative study of the immunobiological properties of the vaccine strain B. abortus R-1096: specialty 03.00.07 "Microbiology", 16.00.03 "Veterinary microbiology, virology, epizootology, mycology with mycotoxicology and immunology": abstract. dis. ...cand. biol. Sciences / Safina Gulnara Min-nerashitovna; Federal Center for Toxicological and Radiation Safety of Animals. - Kazan, 2004. - 20 p.
8. Tarakanov Yu.I. Deep cultivation of Br. abortus 19 in Hottinger broth. Microbiological industry. 1973; 3:51 - 53.
9. Ulasevich, P.S. Application of a vaccine from the REV-1 strain for the prevention of brucellosis in small cattle // Tr. VIEV. - 1974. - T. 42. - P. 217-219.
10.Elberg, S.S. Immunization against Brucella infection / S.S. Elberg // Med. J. - 1973. - Vol. 52. - No. 4. - P. 339-342.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 09.11.2023;
© Косарев М.А., Насибуллин Р.Ю., Сафина Г.М., Богова Я.А., Саитов В.Р. 2024
