CC BY
41
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.869.1:579.222].083.1
Чаленко Я.М., Сысолятина Е.В., Калинин Е.В., Собянин К.А., Ермолаева С.Л. ПРИРОДНЫЕ ВАРИАНТЫ БЕЛКА ИНТЕРНАЛИНА В LISTERIA MONOCYTOGENES
с отличающимся потенциалом стимуляции пролиферации
И ПЕРЕСТРОЕК ЦИТОСКЕЛЕТА эПИТЕЛИАЛьНЫХ КЛЕТОК HEp-2
ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ,
123098, Москва, Россия
Грамположительная патогенная бактерия Listeria monocytogenes относится к числу факультативных внутриклеточных паразитов. Белок InlB - важный фактор патогенности листерий, необходимый для активной инвазии в эпителиальные клетки. InlB взаимодействует с трансмембранным тирозинкиназным рецептором с-Met, активация которого его естественным лигандом - фактором роста гепатоцитов, - приводит к инициации ряда сигнальных каскадов, регулирующих пролиферацию и/или миграцию клеток. Взаимодействие InlB с с-Met также приводит к его активации, что в ходе клеточной инфекции вызывает перестройки цитоскелета и индукцию фагоцитоза. В рамках данной работы был исследован потенциал очищенного белка InlB как лиганда, стимулирующего пролиферацию клеток через активацию с-Met. Было проведено сравнение активности трех природных вариантов InlB, ранее выявленных среди изолятов листерий, выделенных из различных источников. В результате, было показано, что природные варианты InlB отличаются по своей способности индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток линии HEp-2, а также вызывать перестройки актинового цитоскелета. Ключевые слова: Listeria monocytogenes; интерналин В; c-Met; фактор роста гепатоцитов.
Для цитирования: Чаленко Я.М., Сысолятина Е.В., Калинин Е.В., Собянин К.А., Ермолаева С.А. Природные варианты белка интер-налина В Listeria monocytogenes с отличающимся потенциалом стимуляции пролиферации и перестроек цитоскелета эпителиальных клеток HEp-2. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35 (2): 53-58. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-53-58.
Грамположительная патогенная бактерия Listeria monocytogenes относится к числу факультативных внутриклеточных паразитов, способных инфицировать как макрофаги, так и клетки, не относящиеся к профессиональным фагоцитам, включая эпителиальные и эн-дотелиальные клетки, гепатоциты и спленоциты [1, 2]. Активная инвазия листерий в непрофессиональные фагоциты обусловлена взаимодействием секретируемых и поверхностных факторов патогенности с рецепторами клетки хозяина [3]. Основную роль в этом процессе играют белки L. monocytogenes, относящиеся к семейству интерналинов, интерналин А (InlA) и InlB [3].
Белки семейства интерналинов характеризуются наличием так называемого «интерналинового» домена [4]. В структуре интерналинового домена за короткой N-cap областью следуют лейцин-богатые повторы (leucine-rich repeat, LRR) и так называемая IR-область. Белок InlB через свой интерналиновый домен взаимодействует с трансмембранным рецептором с-Met, который присутствует на поверхности разных типов клеток, включая гепатоциты и эпителиальные клетки. с-Met, другое название которого - рецептор фактора роста гепатоцитов, относится к числу тирозинкиназных рецепторов, контролирующих перестройки цитоскелета, а также пролиферацию и миграцию клеток. Взаимодействие InlB с с-Met приводит к активации контролируемых этим рецептором сигнальных путей, что в ходе инфекции вызывает перестройки цитоскелета и индукцию фагоцитоза [5].
Для корреспонденции: Ермолаева Светлана Александровна, д-р биол. наук, зав. лаб. экологии возбудителей инфекции ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», e-mail: drermolaeva@mail.ru
Рецептор с-Met служит мишенью для терапии, необходимость в которой возникает при решении задач регенеративной медицины. Активация c-Met экзогенным лигандом может быть использована для ускорения процессов регенерации печени и мягких тканей [6, 7]. Природным агонистом с-Met в организме млекопитающих является фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF). Основной проблемой при использовании очищенного экзогенного HGF в регенеративной медицине является короткое время жизни в кровяном русле, не превышающее 3-5 мин. Использование же ДНК-вакцин ограничено потенциальными канцерогенными и аутоиммунными эффектами [8]. Другой проблемой терапевтического использования HGF является сложность его структуры. Функционально активный HGF предусматривает конформацию, содержащую 20 дисульфидных связей [9]. В связи с этими трудностями, несмотря на то, что экспериментальное изучение потенциала HGF в регенеративной медицине стартовало в 1980-х годах, к фазе клинических испытаний перешли только в 2014 г. [10].
Между тем, белок InlB также является природным агонистом с-Met и активирует сигнальные события, включая активацию PI3K- и MAPK-зависимых сигнальных путей [11, 12]. Было отмечено, что растворимый не связанный с бактериальной поверхностью InlB, ведет себя скорее как фактор роста, чем инвазин, стимулируя внутриклеточный сигналинг, очищенный InlB не вызывает значительных перестроек цитоскелета [13, 14]. Ряд работ показывает, что InlB и HGF не являются конкурентными агонистами и связываются с разными доменами c-Met [5]. Также было показано, что, изменяя структуру интерналинового домена InlB, можно менять степень активации рецептора c-Met [14, 15]. Потенциал InlB как терапевтического агента, ускоряющего процессы пролиферации и регенерации, усиливается тем, что бактериальный белок InlB не имеет структурного сходства с HGF, что предполагает отсутствие потенциальных аутоиммунных реакций, а также не требует посттрансляционных модификаций, что значительно упрощает получение очищенного препарата in vitro.
Ранее нами было установлено существование природной вариабельности InlB, определяющей эффективность инвазии листерий [16-18]. В рамках данной работы была поставлена цель оценить эффективность природных вариантов InlB в роли агониста рецептора c-Met, влияющего на пролиферацию эпителиальных клеток. Использование структурных вариантов, отличающихся по степени активации рецептора с-Met, позволит оптимизировать использование InlB как агониста c-Met, что в будущем может быть использовано в терапевтических целях для разработки средства, ускоряющего процессы регенерации определенных типов тканей человека.
Материал и методы
бактериальные штаммы и условия культивирования
В работе были использованы два штамма L. monocyto-genes, выделенные из клинических образцов перинаталь-
ного листериоза и хранящиеся в коллекции лаборатории экологии возбудителей инфекции ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи»: VIMHA034 (серовар 1/2a), VIMHA015 (серовар 4b), [17], а также типовой штамм L. monocytogenes EGD-e (серовар 1/2a). В процедурах клонирования и экспрессии были использованы штаммы E. coli BL21 («Novagen», США) и JM109 («Promega», США).
L. monocytogenes культивировали на сердечно-мозговом агаре («BHI, BD», США), при 37oC. Штаммы E. coli выращивали на среде Луриа-Бертани («LB, Amresko», США) при 37oC. Рекомбинантные штаммы, несущие вектор pGemT-easy («Promega», США) культивировали в присутствии ампициллина (200 мкг/мл), IPTG (0,1М), X-Gal (50 мкг/мл). Штаммы, содержащие вектор pET28b(+) («Novagen», США), выращивали в присутствии канами-цина (100 мкг/мл). Культивирование в бульоне проводили с постоянным шутелированием при 200 об/мин.
Клонирование фрагмента гена inlB и создание генноинженерных конструкций
Фрагмент гена inlB, кодирующий интерналиновый домен InlB321, синтезировали в полимеразной цепной реакции на матрице ДНК, полученной из стационарной культуры листерий [19]. В качестве ДНК матрицы использовали лизаты соответствующих штаммов листе-рий: VIMHA034 (14 аллель), VIMHA015 (9 аллель) и EGDe (13 аллель) (согласно [17]). В ПЦР использовали праймеры: InlBF 5'-aca-agc-gga-tcc-tat-cac-tgt-gcc-3' и InlBR 5'-tgt-aaa-gct-ttt-tca-gtg-gtt-ggg-3' («Синтол», Россия) с введенными сайтами рестрикции для BamHI и HindIII, соответственно. ПЦР-продукты клонировани-ли в вектор pGemT-Easy с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems («Promega», США). Конструкции pGemT-Easy::InlBallele14, pGemT-Easy::InlBallele9 и pGemT-Easy::InlBallele13 траснформировали в штамм E. coli JM109 c использованием электропоратора GenPulsar Xсell Total System («Bio-Rad») при параметрах 25 ^F, 2,5 kV, 200 Q. Для выделения плазмидной ДНК из ре-комбинантных штаммов использовали набор БиоСи-лика («Biosilica», Россия). Выделенные плазмидные ДНК очищали с помощью Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System («Promega», США). В дальнейшем ПЦР продукты переклонировали в вектор pET28b(+) по сайтам рестрикции BamHI и HindIII, с последующей электропорацией конструкций pET28b(+)::InlBallele14, pET28b(+)::InlBallele13 и pET28b(+)::InlBallele9 в штамм E. coli BL21. Плазмиды, полученные на последнем этапе, кодировали фрагменты InlB321, слитые с 6 остатками гистидина (His-tag) на аминоконце белка. Экспрессия полученной конструкции проходила под контролем встроенного в вектор фагового промотора. На всех этапах создания генных конструкций нуклеотидные последовательности анализировали методом секвенирования. экспрессия и очистка рекомбинантного белка Культуру рекомбинантных штаммов, описанных выше, выращенную в течение ночи разводили свежей средой в соотношении 1:100, растили до оптической плотности 0,6 D, после чего добавляли 1М IPTG для индукции экспрессии фаговой РНК-полимеразы, и продолжали растить культуру еще 3 ч. Очистку реко-бинантного белка, несущего метки His-tag, осуществляли с помощью наночастиц Dynabeads («Invitrogen», США). Очищенный белок и лизаты рекомбинантных штаммов проверяли методом проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле. Образцы для электрофореза были приготовлены с использованием 1хЛеммли буфера (0,125 M Tris HCl, pH 6,8, SDS 4%, 20% глицерин10%, Р-меркаптоэтанол, 0,001% - бром-фениловый синий).
Клеточные культуры и условия культивирования
Культуру человеческих эпителиальных клеток HEp-2 выращивали в среде DMEM («ПАНЭКО», Россия) в присутствии 10% фетальной бычьей сыворотки.
Оценка эффекта рекомбинантных белков на пролиферацию клеток HEp-2
Оценку эффекта рекомбинантных белков на пролиферацию клеток HEp-2 проводили двумя способами: подсчетом числа делящихся клеток в полях зрения через 6 ч после добавления белков и с помощью МТТ-теста через 72 ч после добавления белков. Для оценки числа делящихся клеток в полях зрения, клетки линии HEp-2 наносили на покровные стекла в количестве 20000 клеток/стекло и инкубировали 18 ч в среде DMEM с 2% FBS без антибиотиков в лунках 12-луночного планшета. Далее культуральную жидкость отбирали и в каждую лунку вносили по 500 мкл среды с белками InlBallele14, InlBallele13 и InlBallele9 в концентрации 1 мкг/мл, в качестве положительного контроля использовался HGF в концентрации 100 нг/мл, в отрицательном контроле проводили замену среды. Клетки инкубировали 6 ч, после чего проводили окраску ядер витальным красителем Hoechst (1 мкг/мл) путем смены среды на среду, содержащую краситель, с последующей инкубацией в течение 30 мин в СО2 инкубаторе. Оценку митотического индекса - процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток, проводили в десяти полях зрения по два повтора для каждого действующего белка и контрольных образцов.
Для оценки числа живых клеток с помощью МТТ-теста, клетки ресуспендировали в культуральной среде в концентрации 2 ■ 104 кл/мл, 100 мкл клеточной суспензии добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. В лунки вносили рекомбинантные белки InlBallele14, InlBallele13 и InlBallele9 в концентрации от 1 мкг/мл до 125 нг/мл. В качестве положительного контроля использовали фактор роста гепатоцитов HGF в концентрации от 50 до 150 нг/мл. Отрицательный контроль - клеточная суспензия в культуральной среде. Клетки инкубировали 48 ч во влажной камере с содержанием 5% СО2 при 37oC. На третий день количество жизнеспособных клеток оценивали добавлением по 10 мкл МТТ (5 мг/мл) в каждую лунку. Планшет инкубировали 4 ч при 37oC и 5% СО2. Затем супернатант осторожно удаляли, не затрагивая кристаллы формазана. Кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО. Результат теста оценивали измерением оптической плотности при длине волны 540 нм. Эксперимент был продублирован.
Оценка эффекта рекомбинантных белков на перестройки клеточного цитоскелета
Клетки линии HEp-2 высевали на покровные стекла в концентрации 10000 кл/стекло и инкубировали в среде DMEM («ПАНЭКО», Россия) в присутствии 2% фетальной бычьей сыворотки («Gibco», USA) в течение 18 ч. Затем в лунки вносили рекомбинантные белки InlBal-lele14, InlBallele13 и InlBallele9 в концентрации 1 мкг/ мл. В качестве положительного контроля использовали фактор роста гепатоцитов HGF в концентрации 50 нг/ мл. Отрицательный контроль - клеточная суспензия в культуральной среде. Спустя 6 ч инкубации клетки отмывали дважды PBS, фиксировали 3,7% формалином в течение 10 мин, затем пермеабилизировали 3-5 мин Тритоном Х-100 («Panreac», Испания) и окрашивали фаллоидином (Alexa Fluor 555 Phalloidin, USA) в течение 20 мин согласно инструкции производителя. Учет результатов проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axio Scope A1 с увеличением x1000 в трех независимых экспериментах.
Таблица 1
Замены, характеризующие использованные природные варианты InlB321
41 49 69 73 91 117 132 138 164 176 181
197
205
246
251
262
вариант9 P P L s I A I L L L I E s s M I
вариант13 P s A N V A V L P I V Q A P s T
вариант14 s P A N V T I L P I V Q A P s T
Статистика
Все эксперименты повторяли минимум дважды. При анализе фотографий использовали не менее 10 полей зрения. Для статистической обработки использовали Excel 2010. Для определения статистической достоверности использовали t-test.
Результаты и обсуждение
Клонирование и очистка рекомбинантных белков
Интерналин B имеет массу 67 кД и состоит из 630 аминокислот [20]. Ранее было показано, что амино-концевой интерналиновый домен InlB (аминокислоты 36-321, InlB) полностью функционален при взаимодействии с c-Met [5, 21]. Три природных варианта этого фрагмента были использованы для создания конструкций, кодирующих рекомбинантные белки InlB321, содержащие на амино-конце дополнительные 6 остатков гистидина (His-tag) (см. «Материал и методы»).
Варианты InlB321 отличались рядом аминокислотных замен, характерных для природных вариантов InlB, которые были ранее идентифицированы нами у штаммов листерий, выделенных от различных природных хозяев (табл. 1) [16-18]. Всего варианты отличались по 15 аминокислотным остаткам. Ни одна из замен не затрагивала аминокислотные остатки, участвующие в непосредственных контактах с с-Met [22]. Замены, свойственные для варианта InlBallele14, были ранее описаны как свойственные для штаммов L. monocytogenes с низкой вирулентностью [23]. Тем не менее, эпидемиологические данные показывают, что InlBallele14, как и другие варианты, свойственные для широкого круга как клинических, так и природных изолятов L. monocytogenes, что косвенно свидетельствует о функциональной активности всех вариантов [17, 18].
Очистку белков проводили как описано в разделе «Материал и методы». Уровень экспрессии рекомби-нантных белков и степень очистки определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатуриру-
Рис. 1. Очистка рекомбинантных белков InlB321.
Белки были клонированы в штамм Е. coli BL21 и очищены как описано в «Материалах и методах». Представлена электрофореграмма лизатов Е. coli и очищенных препаратов белков, разделенных на 10 % SDS-PAGE.
ющих условиях. В результате было получено три варианта очищенного препарата белка 1пШ (рис. 1)
Варианты' 1п1В321 отличаются по способности влиять на пролиферацию клеток НЕр-2
Клетки эпителиальной карциномы гортани человека НЕр-2 несут на поверхности рецептор c-Met и усиливают пролиферацию в присутствии природного агониста с-Ме^ фактора роста гепатоцитов НGF [13]. Поэтому эти клетки были использованы нами в качестве модели для изучения различий в активности вариантов ШВ321.
Мы исследовали эффект 1п1В на ускорение клеточной пролиферации и перестройку цитоскелета через 6 ч после добавления белков. В качестве положительного контроля использовали НGF, в качестве отрицательного контроля использовали клетки, выращиваемые в тех же условиях, но без добавления белков или НGF.
Используя флуоресцентную микроскопию, провели подсчет числа делящихся клеток в поле зрения и оценку митотического индекса (процента делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток). Для отрицательного контроля величина митотического индекса составила 1,04%, для положительного контроля в присутствии фактора роста гепатоцитов эта величина равнялась 14,14% (рис. 2). Митотический индекс клеток, обработанных вариантами 1п1В321, был достоверно (/><0,05) выше, чем в отрицательном контроле: 1п1Ва11е19 - 20,69%, 1п1Ва11е114 -22,63 %, 1п1Ва11е113 - 10,0 %. Для 1п1Ва11е114 митотический индекс был достоверно (р < 0,05) выше, чем для фактора роста НGF. Концентрация фактора роста составляла 100 нг/мл, а белка 1п1Ва11е114 - 1 мкг/мл. Однако увеличение концентрации фактора роста выше 100 нг/мл не приводило к усилению пролиферативного эффекта на изучаемые клетки. Минимальная рабочая концентрация белка не была изучена в этих экспериментах, однако по данным МТТ-теста (см. дальше) она может быть ниже, чем 1 мкг/мл.
Анализ состояния ядер выявил в образцах, обработанных НGF и вариантами 1п1В321, клетки на разных стадиях деления (рис. 3). Помимо различий в процентах делящихся клеток, для каждого действующего фак-
30-,
25-
20-
о; о CD
к
<и et
15-
10-
5-
Контроль HGF
ЫВ9
InlB 13 InlB 14
Рис. 2. Активация пролиферации клеток НЕр-2 в присутствии очищенных препаратов белков 1п1В321.
Белки 1п1В321 и НОБ добавлены к клеткам НЕр-2 в концентрациях 1 мкг/мл и 100 нг/мл, соответственно. Делящиеся клетки наблюдали через 6 ч после добавления белков. Показан митотический индекс (отношение числа делящихся клеток к общему числу клеток в поле зрения). Данные получены усреднением по минимум 10 полям зрения в двух независимых экспериментах.
тора были выявлены специфические цитологические изменения в состоянии ядра. Так, в отрицательном контроле все ядра имели ровную форму и содержали по 1 ядрышку. В положительном контроле, клетки, обработанные HGF, имели ядра с неровной формой, которые выглядели рыхло, что может соответствовать начальным этапам митоза - ранней профазе. В то же время большинство ядер в клетках, обработанных вариантами 1п1В321, имели ровную форму, характерную для контроля, и лишь некоторые - неровную, описанную выше. Различия между HGF и вариантами бактериального белка могут свидетельствовать о том, что эффект 1п1В321 зависит от дополнительных параметров, либо является более сложным, чем эффект, вызываемый природным лигандом с-Ме1
Еще одним способом оценки эффекта 1п1В.на пролиферацию клеток было использование МТТ-теста, позволяющего оценить число метаболически активных клеток в зависимости от концентрации лиганда. Через 72 ч после начала эксперимента максимальным пролиферативным эффектом, согласно МТТ-тесту, обладали белки 1п1В321 в концентрации 250 и 125 нг/
Рис. 3. Изменения в состоянии ядер клеток HEp-2 в присутствии очищенных препаратов белков InlB321 и HGF.
Ядра клеток окрашивали красителем Hoechst через 6 ч после добавления белков. а - отрицательный контроль; б - HGF в концентрации 50 нг/мл, стрелки показывают характерные изменения ядра; в - InlBallel9 в концентрации 1 мкг/мл, крупная стрелка показывает на ядро с ми-тотической пластиной (метафаза), черные стрелки - на ядра в начале анафазы; г - InlBallel13 в концентрации 1 мкг/мл, серая стрелка указывает на ядро в анафазе; д - InlBallel14 в концентрации 1 мкг/мл, серые стрелки указывают на ядро в анафазе.
мл (табл. 2). Более высокие концентрации внесенных белков, по-видимому, проявляли токсический эффект. Аналогично, более высокая концентрация HGF (150 нг/мл) была менее эффективна, чем более низкая (100 нг/мл). Одним из возможных объяснений наблюдаемой нелинейной зависимости эффекта от концентрации могут быть достаточно сложные последствия активации c-Met, в определенных условиях приводящие к апоптозу клеток [25]. Статистически значимых различий между вариантами согласно MTT-тесту выявлено не было.
В целом сравнительный анализ пролиферативной активности природных вариантов InlB показал, что все они обладают дозозависимой способностью влиять на пролиферацию клеток HEp-2, хотя эта способность различается у различных вариантов. Полученные результаты подтверждают потенциал InlB как агента, способного ускорять пролиферацию некоторых типов клеток человека. Однако выявленная цитотоксичность в условиях пролонгированной инкубации клеток с высокими концентрациями рекомбинантных белков, должна быть учтена в дальнейших исследованиях.
Л
л
Рис. 4. Перестройки актинового цитоскелета, индуцированные добавлением очищенных препаратов белков 1п1В321 и HGF.
Б-актин окрашен через 6 ч после добавления белков. а - отрицательный контроль, крупная стрелка указывает на кортикальную область клеток; б - HGF в концентрации 100 нг/мл, крупные стрелки указывают на характерное усиление окраски кортикальной области, связанное с формированием ламеллоподии, маленькая стрелка указывает на многочисленные филоподии; в - 1п1Ба11е19 в концентрации 1 мкг/мл, крупная стрелка указывает на характерное усиление окраски кортикальной области, связанное с формированием ламеллоподии, филоподий мало; г - 1п1Ба11е113 в концентрации 1 мкг/мл, крупные стрелки указывает на характерное усиление окраски кортикальной области, связанное с формированием ламеллоподии, филоподий мало; д - 1п1Ба11е114 в концентрации 1 мкг/мл, стрелки указывают на филоподии, характерного усиления окраски
кортикальной области, связанного с формированием ламеллоподии, не замечено. Анализ проводили по 10 полям зрения в трех независимых экспериментах. Показаны типичные изображения.
Варианты InlB321 отличаются по влиянию на перестройки цитоскелета
Одним из последствий активации c-Met фактором роста гепатоцитов является активная миграции клеток, так что альтернативным названием HGF является scatter factor. Перестройки актиновых микрофиламентов клеточного скелета вызывает и InlB [13]. Используя флуоресцентное окрашивание F-актина, мы наблюдали, что фактор HGF вызывает характерные изменения, связанные с формированием ламеллоподий и филопо-дий, - структур, вовлеченных в миграцию клетки (рис. 4, б). Видимое формирование ламеллоподий вызывал вариант InlB InlBallel9 (см. рис. 4, в). Филоподии у клеток, обработанных этим вариантом, наблюдались в ограниченном количестве. Вариант InlBallel13 вызывал относительно незначительные перестройки, связанные с формированием ламеллоподий (см. рис. 4, г). Наконец, InlBallel14 вызывал заметное формирование филоподий, но не ламеллоподий (см. рис. 4, д). Таким образом, сравнивая эффект разных вариантов InlB321 на состояние клеточного скелета, мы выявили различия в эффектах на
перестройки актиновых микрофиламентов, вызванных взаимодействием с разными вариантами.
В целом, полученные нами результаты демонстриру-
Таблица 2
Оценка жизнеспособности клеток по результатам МТТ-теста через 72 ч после внесения HGF или 1пШ321 к клеткам HEp-2
Концентрация белка, мкг/мл InlBallel9 InlBallel13 InlBallel14 HGF Контроль (без факторов)
1 0,53 0,55 0,57 - н/пв
0,500 0,45 0,6 0,45 - н/п
0,250 0,8 а 0,76 0,8 - н/п
0,150 —б - - 0,88 н/п
0,125 0,75 0,69 0,7 - н/п
0,100 - - - 0,93 н/п
0 н/пб н/п н/п н/п 0,67
Примечание. а - жирным выделены результаты, достоверно (р < 0,05) отличающиеся от контроля; б - «-» - не сделано; в - «н/п» - неприменимо.
ют, что природные варианты интерналинового домена InlB321 фактора инвазии L. monocytogenes InlB оказывают различающиеся эффекты на пролиферацию эпителиальных клеток и перестройки актинового цитоскелета. Полученные результаты представляют интерес как с точки зрения роли наблюдаемых различий в вирулентности штаммов, несущих отличающиеся варианты InlB321, так и с точки зрения потенциала InlB321 как средства для стимуляции процессов регенерации. Дальнейшее изучение сигнальных путей, активируемых разными вариантами, поможет пролить свет на оба аспекта роли природной вариабельности фактора патогенности листерий InlB.
Благодарности.
Работа была поддержана Российским Научным Фондом (грант 116-15-00091).
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1, 3-18, 20-24 см. REFERENCES)
2. Тартаковский И. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. М.: Медицина для всех; 2002.
19. Карпова Т., Фирсова Т., Родина Л., Котляров В. и др. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003; 5 (3): 251-8.
REFERENCES
1. Vazquez-Boland J., Kuhn M., Berche P. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14 (3): 584-640.
2. Tartakovskiy I. [Listerii: rol' v infektsionnoy patologii cheloveka i laboratornaya diagnostika]. Moscow: Meditsina dlya vsekh; 2002. (in Russian)
3. Cossart P., Invasion of mammalian cells by Listeria monocytogenes: functional mimicry to subvert cellular functions. Trends in Cell Biol. 2003; 13 (1): 23-31.
4. Schubert W., Gobel G., Diepholz M. Internalins from the human pathogen Listeria monocytogenes combine three distinct folds into a contiguous internalin domain1. J. Mol. Biol. 2001; 312 (4): 783-94.
5. Shen Y., Naujokas M., Park M., Ireton K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 2000; 103 (3): 501-10.
6. Ishiki Y., Ohnishi H., Muto Y., Matsumoto K., Nakamura T. Direct evidence that hepatocyte growth factor is a hepatotrophic factor for liver regeneration and has a potent antihepatitis effectin vivo. Hepa-tology. 1992; 16 (5): 1227-35.
7. Kawaida K. Matsumoto K., Shimazu H., Nakamura T. Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 1994; 91 (10): 4357-61.
8. Lee J., Joo K., Lee J., Yoon Y., Nam D. Targeting the epithelial to mesenchymal transition in glioblastoma: The emerging role of MET signaling. Onco. Targets. Ther. 2014; 7: 1933-44.
9. Bottaro D., Rubin J., Faletto D., Chan A., Kmiecik T., Vande Woude G., Aaronson S. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product. Science. 1991; 251 (4995): 802-4.
10. Kringle Pharma,Inc. TheLatestNews. [Электронный ресурс]. URL: http://www.kringle-pharma.com/en/index.html (дата обращения: 22.05.2016).
11. Pizarro-cerda J. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012; 2 (11): 1-1.
12. Jiwani S., Wang Y., Dowd G., Gianfelice A., Pichestapong P., Gavi-cherla B. et al. Identification of components of the host type IA phos-phoinositide 3-kinase pathway that promote internalization of Listeria monocytogenes. Infect. andlmmun. 2012; 80 (3): 1252-66.
13. Bierne H., Cossart P. InlB, a surface protein of Listeria monocyto-genes that behaves as an invasin and a growth factor. J. Cell Sci. 2002; 115: 3357-67.
14. Ferraris D., Gherardi E., Di Y., Heinz D., Niemann H. Ligand-medi-ated dimerization of the met receptor tyrosine kinase by the bacterial invasion protein InlB. J. Mol. Biol. 2010; 395 (3): 522-32.
15. Mungunsukh O., Lee Y., Marquez A., Cecchi F., Bottaro D., Day R. A tandem repeat of a fragment of Listeria monocytogenes interna-lin B protein induces cell survival and proliferation. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 2010; 299 (58): 905-14.
16. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from
wild animals in the far east of Russia. Infect., Genet., Evolut. 2007; 7 (6): 736-42.
17. Adgamov R. Zaytseva E., Thiberge J., Brisse S., Ermolaeva S. Genetically related Listeria monocytogenes strains isolated from lethal human cases and wild animals. In: Genetic Diversity in Microorganisms. 2012; ISBN 978-953-51-0064-5.
18. Voronina O. et al. Diversity and pathogenic potential of Listeria monocytogenes isolated from environmental sources in the Russian Federation. Int. J. Modern Eng. Res. 2015; 5 (3): 5-12.
19. Karpova T., Firsova T., Rodina L., Kotlyarov V. et al. Tipirovanie Listeria monocytogenes na osnove polimorfizma genov faktorov patogennosti. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimi-oterapiya. 2003; 5 (3): 251-8.
20. Mengaud J., Lecuit M., Lebrun M., Nato F., Mazie J., Cossart P. Antibodies to the leucine-rich repeat region of internalin block entry of Listeria monocytogenes into cells expressing E-cadherin. Infect. and Immun. 1996; 64 (12): 5430-3.
21. Niemann H., Jäger V., Butler P., van den Heuvel J., Schmidt S., Ferraris D. et al. Structure of the human receptor tyrosine kinase met in complex with the Listeria invasion protein InlB. Cell. 2007; 130 (2): 235-46.
22. Machner M., Frese S et al. Aromatic amino acids at the surface of InlB are essential for host cell invasion by Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 2003; 48 (6): 1525-36.
23. Témoin S. Roche S., Grépinet O., Fardini Y., Velge P. Multiple point mutations in virulence genes explain the low virulence of Listeria monocytogenes field strains. Microbiology. 2008; 154 (3): 939-48.
24. Sun Y., Su L., Wang Z., Xu Y., Xu X. H-RN, a peptide derived from hepatocyte growth factor, inhibits corneal neovascularization by inducing endothelial apoptosis and arresting the cell cycle. BMC Cell Biol. 2013; 14: 8.
Поступила 12.01.17
Chalenko Ya.M, Sysolyatina E.V., Kalinin E.V., Sobyanin K.A., Ermolaeva SA.
NATURAL VARIANTS OF LISTERIA MONOCYTOGENES INTERNALIN B WITH A DIFFERENT ABILITY TO STIMULATE CELL PROLIFERATION AND CYTOSKELETON REARRANGEMENT IN HEP-2 CELLS
Federal State Institution «N.F. Gamaleya Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology», Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
The Gram-positive bacterium Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogen. The InlB protein is required for L. monocytogenes active invasion in epithelial cells. InlB interacts with the surface tysozine-kinase receptor c-Met. Activation c-Met by its natural ligand, hepatocyte growth factor, induces intracellular signaling pathways and causes cell proliferation and/or migration. Interactions of InlB with c-Met in the course of infection activates the receptor and results in cy-toskeleton rearrangement and bacterial uptake. In this work, we have studied the potential of the purified InlB protein as a c-Met ligand causing cell proliferation. Three distinct InlB variants were compared. These variants were previously described in L. monocytogenes strains isolated from different sources. The variants were shown to have different abilities to induce HEp-2 cell proliferation. In addition, differences in cy-toskeleton rearrangements were shown for different InlB variants. Keywords: Listeria monocytogenes, internalin B; c-Met, hepatocyte growth factor
For citation: Chalenko Ya.M., Sysolyatina E.V., Kalinin E.V., Sobyanin K.A., Ermolaeva S.A. Natural Variants of Listeria monocytogenes Internalin B with a Different Ability to Stimulate Cell Proliferation and Cytoskeleton Rearrangement in HEp-2 Cells. Moleku-lyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017; 35(2):53-58. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-53-58.
For correspondence: SvetlanaA. Ermolaeva, Sc.D, head of the Laboratory of ecology of pathogenic bacteria, Federal State Institution «N.F. Gamaleya Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology», Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation; E-mail: drermolaeva@mail.ru Acknwledgments. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant №116-15-00091).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
