CC BY-ND
30
Май Н0Е (278)
ЗНиСО
45
УДК 579.843.1:575.25:579.61
ПРИРОДНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ КАК РЕЗЕРВУАР ГЕНОВ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ
С.В. Титова, Е.В. Монахова, И.В. Архангельская, Р.В. Писанов, Н.Б. Непомнящая
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
С помощью ПЦР и секвенирования ДНК выявлена значительная гетерогенность геномов штаммов холерных вибрионов, выделенных в России и некоторых бывших республиках СССР, как по наличию/отсутствию, так и по структуре генов-факторов патогенности. Результаты анализа распространения генов и их аллелей в популяциях возбудителей, циркулирующих на не эндемичных по холере территориях, указывают на то, что эти популяции следует рассматривать как резервуар генетического материала для горизонтальной передачи и формирования новых ге-новариантов.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, гены факторов патогенности, нуклеотидная последовательность.
S.V. Titova, E.V. Monakhova, I.V. Arkhangel'skaya, R.V. Pisanov, N.B. Nepomnyashchaya □ NATURAL POPULATIONS OF VIBRIO CHOLERAE AS A RESERVOIR OF VIRULENCE-ASSOCIATED GENES □ Rostov-on-Don Anti-Plague Scientific Research Institute of Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
Significant genomic heterogeneity of Vibrio cholerae strains isolated in Russia and certain former USSR republics has been revealed by means of PCR and DNA sequencing, which concerned both presence/absence and structure of virulence-associated genes. The results of analysis of distribution of genes and their alleles in the populations circulating in non-endemic areas evidenced that these populations are to be considered as a reservoir of genetic material for horizontal transfer and formation of new genovariants.
Key words: Vibrio cholerae, virulence-associated genes, nucleotide sequence.
Как известно, холерные вибрионы способны существовать не только в организме человека, но и длительно персистировать в водоемах как в свободноживущем («планктонном») состоянии, так и в ассоциации с биотическими (простейшие, ракообразные, насекомые, рыбы, птицы) и абиотическими (твердые субстраты естественного и искусственного происхождения) объектами [3, 6]. Геном возбудителя, представленный двумя хромосомами, высоко пластичен, что обусловливает крайнюю генетическую неоднородность популяций, присутствующих на различных территориях. По всей видимости, штаммов, одновременно содержащих интактные гены всех известных на сегодняшний день факторов патогенности, практически не существует - вероятно, это невыгодно энергетически [1]. Вместе с тем благодаря способности к обмену генетической информацией природные популяции холерных вибрионов принято считать резервуарами генов, которые могут горизонтально передаваться другим микроорганизмам, что приводит к формированию новых высоковирулентных клонов [2, 5]. В России серьезные эпидосложнения имели место лишь в прошлом столетии, однако и по настоящее время периодически регистрируются спорадические случаи холеры (как правило, завозные), единичные и групповые диа-рейные заболевания, вызванные Vibrio cholerae nonO1/nonO139, а из водных объектов окружающей среды штаммы различных серогрупп выделяются постоянно [1, 3]. Поэтому для оценки потенциальных рисков необходимо знание совокупного набора генов, присутст-
вующих в геномах штаммов, циркулирующих в Российской Федерации (РФ), а также, в связи с миграцией населения и возможностью новых заносов, на пограничных территориях.
Цель исследования - проведение анализа распространения различных генов и их аллелей в популяциях холерных вибрионов, циркулирующих в России и на сопредельных территориях.
Материалы и методы. Объектами исследования служили штаммы холерных вибрионов О1, О139 и неО1/неО139-серогрупп, выделенные с 1987 по 2014 гг. от людей и из источников окружающей среды на территории России и некоторых бывших республик СССР. ПЦР-детекцию генов факторов патогенности проводили как описано ранее [1]. Полногеномные последовательности ДНК ряда штаммов определяли на платформе MiSeq (Illumina) согласно прилагаемому к оборудованию протоколу. Отдельные гены и их кластеры идентифицировали в полных геномах в режиме on-line с помощью программы BLASTN 2.2.29, для сборки контигов использовали программу ContigEx-press (Vector NTI 11), для анализа генов и их продуктов - AlignX (Vector NTI 11), SMART DOMAINS (www.dove.embl-heilderberg.de) и SCOP (www.scop.mrc-lmb.cam.ac.uk). В сравнительный анализ были также включены последовательности, найденные в базах NCBI GenBank.
Результаты и обсуждение. Поскольку ключевыми факторами патогенности холерных вибрионов являются холерный токсин и ток-син-корегулируемые пили адгезии, нас в пер-
46
ЗНиСО
май Н0Е (278)
вую очередь интересовали штаммы, несущие их детерминанты, соответственно ctxAB (в составе профага СТХ) и tcpA (в составе острова патогенности УР1). На современном этапе седьмой пандемии ведущая роль в этиологии холеры принадлежит генетически измененным штаммам, содержащим специфические точко-вые мутации (8КР) в генах ctxB и tcpA, в соответствии с которыми различают несколько аллелей обоих генов. У геновариантов V. cholerae 01 ctxB типа Эль Тор (ctxB3) замещен ctxB классического типа ctxB1 либо его вариантом ctxB7, впервые обнаруженным у штаммов, вызвавших эпидемию на Гаити (2010). Эти штамм-мы также содержат так называемый гаитянский аллель tcpA (tcpA '), отличающийся от «канонического» tcpA типа Эль Тор ^срЛ11) наличием однонуклеотидной замены (8КР) в позиции 266. С помощью В1а8^анализа в полногеномных сиквенсах штаммов, выделенных в России от больных и из объектов окружающей среды с 1994 по 2014 гг., нами были идентифицированы аллели с1хВ и ^рЛ, которые распределились следующим образом: 1) с1хВ3 и ^рЛ11 -
1 штамм из внешней среды (Ростов-на-Дону, 2000); 2) с^В1 и &рЛ11 - 1 клинический штамм (Дагестан, 1994) и 4 из внешней среды (Ростов-на-Дону, 2001, 2003); 3) сХВ1 и ^рЛНаШ -
2 клинических штамма (Тверь, 2005; Мурманск, 2006) и 2 из внешней среды (Ростовская обл., 2011, 2014); 4) сХВ7 и ^рЛНаШ - 6 клинических штаммов (Москва, завозы из Индии, 2010, 2012, 2014). До настоящего времени такие высоковирулентные штаммы (близкие гаитянским) не обнаруживались во внешней среде РФ, контаминации удалось избежать благодаря своевременной изоляции больных, однако риск их попадания в водоемы в будущем достаточно высок.
Особый интерес представляет тот факт, что профаг СТХ, интегрированный в геном клинического штамма неО1/неО139-серогруппы (КЯ072210, Узбекистан, 1987), оказался полностью идентичным таковому одного из штаммов О37-серогруппы (ЛЛК12.1), вызвавших крупную вспышку в Судане в 1968 г. (460 заболевших, 125 летальных исходов). Этот профаг, обозначенный нами как СТХ , содержал ранее не описанный аллель с!хВ9 классического типа и целый ряд 8КР в других генах. Идентификация профага СТХ в составе генома штамма другой серогруппы, выделенного на другой территории спустя почти 20 лет после Суданской вспышки, свидетельствует о том, что этот профаг сохранил свою уникальную структуру в неизменном виде. Не исключено, что штаммы, содержащие такой профаг, циркулируют в природе и по настоящее время.
Нетоксигенные штаммы V. с^1егае 01 и не01/не0139-серогрупп также могут вызывать острые холероподобные диареи, реализуя патогенетический потенциал за счет продукции целого ряда дополнительных факторов патоген-ности. Такие штаммы, выделенные из разных
источников в РФ и ряде бывших республик ^с СССР, представлены разнообразными генотипами и могут содержать профаги pre-CTX с разными аллелями генов Я82-элемента rstR, коровой области ace, zot; остров патогенности VPI c разными аллелями tcpA, полный либо не- ^^ полный остров VPI-2, в котором может быть делетирован ген нейраминидазы nanH. Далеко <~ь не у всех штаммов присутствует интактный кластер RTX, кодирующий синтез высокомолекулярного цитотоксина MARTX, у многих имеются делеции, препятствующие экспрессии либо приводящие к инактивации продукта. Это же можно сказать и о кластерах генов систем секреции третьего и шестого типов (T3SS и T6SS). Так, штаммы, обладающие детерминантами структурных компонентов, могут быть лишены последовательностей, кодирующих эффекторы либо их активные домены, и наоборот.
Ген термостабильного токсина, мощного фактора патогенности (stn/sto), довольно часто встречающийся у азиатских штаммов разных серогрупп, лишь недавно был выявлен при ретроспективном скрининге всего у 6 штаммов О1, выделенных с 2002 по 2014 гг. в шести географически удаленных друг от друга регионах РФ (Пензенская, Ленинградская, Ростовская области, Республика Калмыкия, Ставропольский и Хабаровский края). Ген еще одного нового фактора патогенности - cholix-токсина (chxA) - был обнаружен в геномах V. cholerae nonOl, выделенных в России (Ростовская область) и Узбекистане. Сравнительный AlignX-анализ нуклеотидных последовательностей генов chxA позволил выявить среди них типы I, II и III. Большинство штаммов неО1/неО139-серогрупп содержали chxAI, и только один -chxAIII (хотя и инактивированный вследствие делеции одного нуклеотида, приведшей к сдвигу рамки считывания и образованию «преждевременного» стоп-кодона), тогда как chxAII был выявлен у двух нетоксигенных водных штаммов О139-серогруппы, причем в измененной форме, сохранившей, тем не менее, последовательности, кодирующие активные домены. Ген фактора патогенности/персистенции Cef (CHO cell elongation factor), который считался достаточно консервативным, у нехолерогенных штаммов оказался крайне вариабельным: в группе из 40 штаммов разных серогрупп, выделенных в России, Украине, Молдове, Азербайджане, Узбекистане, было выявлено 16 аллелей, однако их продукты, несмотря на значительную изменчивость аминокислотных последовательностей, сохранили активные домены, которые были идентифицированы программами SMART DOMAINS и SCOP. В результате проведенного AlignX-анализа нам удалось выявить среди них уникальные варианты. Ген се-риновой протеазы - диареегенного фактора -был также представлен несколькими аллелями, обладающими от 94 до 99 % идентичности с геном VC 1649 типового штамма N16961. Ин-тактный ген белка наружной мембраны ompU
май Hic (27В)
ЗНиСО
47
присутствовал у всех изученных холерогенных I— и нескольких нехолерогенных штаммов, у большинства же последних он содержал протяженные делеции. По-видимому, этим объясняется наблюдавшееся нами ранее при постановке ПЦР амплификатов образование мень-сЁ шей длины по сравнению с рассчитанной [1].
Сравнительный AlignX-анализ показал, что даже такие видоспецифичные маркеры пато-генности/персистенции как гены гемагглюти-нин/протеазы hapA, коллагеназы VC1650, белка наружной мембраны ompW, глобального регулятора toxR содержали единичные и множественные, идентичные и неидентичные SNP либо делеции нуклеотидов.
По всей вероятности, продукты разных аллелей каждого гена могут различаться по биохимической и биологической активностям, с которыми связана способность вибрионов как к проявлению патогенных свойств, так и к пер-систенции в разных экологических нишах. Возможно, что существование множества аллелей не является случайным, но несет определенный биологический смысл, тем более, что идентичные либо обладающие высоким уровнем сходства аллели были выявлены у ряда штаммов, не связанных общностью происхождения. Однако для проверки этого предположения необходимо клонировать измененные гены и изучить фенотипические свойства рекомби-нантных белков.
Гены всех факторов патогенности включая их аллели у разных штаммов находились в различных сочетаниях, но почти полный их набор присутствовал в популяциях, циркулирующих на конкретных территориях. Как было отмечено нами ранее [1], поддержание полного набора генов в геноме одного штамма, возможно, было бы энергетически невыгодно для него в условиях стрессорного воздействия внешней среды, но будучи «распределенным» среди членов популяции, этот набор позволяет ей сохранять патогенетический потенциал.
Заключение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что штамм-мы холерных вибрионов, выделяемые в РФ и на прилегающих территориях, так же, как и циркулирующие в других регионах мира, могут рассматриваться как резервуар генов факторов патогенности и персистенции. Несмотря на то, что климатические факторы большинства регионов РФ неблагоприятны для длительной персистенции холерных вибрионов, они могут сохраняться в объектах окружающей среды в течение некоторого времени. Например, в 2001 г. в Ростове-на-Дону из сточных вод был выделен ctxB1/tcpA штамм, а спустя 2 недели 2 полностью идентичных ему штамма были обнаружены на той же территории в воде двух разных водоемов. Временное существование подходящих для V. cholerae экологических ниш косвенно подтверждается постоянным выделением нетоксигенных штаммов в процессе мо-
ниторинга из естественных водоемов и сточных вод [З]. Вместе с тем природные популяции в условиях умеренного климата представляют скорее динамичные, чем постоянные сообщества, в которых на смену одним штаммам приходят другие, занесенные извне либо сформировавшиеся в результате генетической рекомбинации. Мы полагаем, что до того, как какой-либо штамм будет элиминирован, он вполне может успеть передать другим определенные аллели генов, что приведет к образованию геновариантов с повышенным эпидемическим, патогенетическим либо персистентным потенциалом. Как было установлено, в условиях эксперимента российские штаммы, в том числе геноварианты, проявили способность к образованию биопленки [4], в составе которой клетки вибрионов обретают способность к трансформации и генетическому обмену [б]. Последний может происходить и в организме человека при условии одновременного заражения двумя и более штаммами. Все это указывает на риски возникновения эпидосложнений, для оценки степени вероятности которых необходимы дальнейшие исследования структуры генов холерных вибрионов в сочетании с фенотипичес-кими особенностями их продуктов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Архангельская И.В. и др. Генетическая неоднородность популяции Vibrio cholerae nonO1/nonO139, выделенных в Ростовской области / И. В. Архангельская, Н. Б. Непомнящая, Е.В. Монахова [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № З. С. 25-27.
2. Смирнова Н. И. и др. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эль-тор, изолированных на территории России в современный период / Н.И. Смирнова, С.П. Заднова, А.В. Шашкова, В.В. Ку-тырев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. № З. С. 11-1S.
3. Титова С.В. и др. Анализ динамики выделения и биологических свойств штаммов V. cholerae О1 El Tor, изолированных из водных объектов на территории Ростовской области в 200З-2014 гг. / С.В. Титова, В.Д. Круг-ликов, М.И. Ежова [и др.] // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 2. С. З9-41.
4. Титова С. В. и др. Экспериментальное изучение формирования холерными вибрионами биопленок на абиотических поверхностях в разных условиях культивирования / С.В. Титова, Е.В. Кушнарева // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № З. С. З1-З4.
5. Khouadja S. et al. Occurrence of virulence genes among Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus strains from treated waste waters / S. Khouadja, E. Suffredini, B. Bac-couche [et al.] // Environ. Monit. Assess. 2014. Vol. 1S6. No.10. P. б9З5-б945.
6. Lutz C. et al. Environmental reservoirs and mechanisms of persistence of Vibrio cholerae / C. Lutz, M. Erken, P. Noorian [et al.] // Frontiers in Microbiol. 201З. Vol. 4. Art. З75.
Контактная информация:
Монахова Елена Владимировна, тел.: +7 (863) 240-91-33, e-mail: unicorn54@mail.ru Contact information: Monakhova Elena, р^м: +7 (863) 240-91-33, e-mail: unicorn54@mail.ru
