CC BY
48
Гр 1 Осн
Примечание: *
Гр. сравнения (латвнты
р=0,09 при сравнении 1-й и 2-й основных групп /' р=0,01 при сравнении 2-й основной группы и группы сравнения, ***р<0,01 при сравнении группы контроля с группами 1-й, 2-й и группой сравнения.
Рис. 3. Частота определения онкобелка Е7 ВПЧ 16/18 типа у больных с СШ.
Полученные данные согласуются с данными других исследователей, установивших повышение экспрессии онкобелка Е7 у женщин с СШ, более выраженное
при СШШ и раке шейки матки [3,4,12]. У женщин с персистирующей ПВИ в сочетании с интраэпи-телиальной неоплазией и раком шейки матки экспрессия онкобелка Е7 регистрируется наиболее часто (в 73,5% случаев), а персистирующее течение ПВИ сопровождается экспрессией онкобелка Е7 в 10,4 раза чаще, чем при транзиторном течении [3]. По нашим данным, различия в уровне Е7 при транзиторной и персистирующей ПВИ не столь выражены. Экспрессия онкобелка Е7 среди больных с предраком увеличивается от 66,7±12,2% при Ъ81Ъ до 82,4±5,2% при И81Ъ [6], что находит подтверждение в результатах проведенного нами исследования.
Таким образом, результаты ВПЧ-типирования свидетельствуют о различиях в распространенности отдельных типов ВПЧ в зависимости от степени цервикального предрака. Доминирование 16 типа ВПЧ наблюдается как при СШП-Ш (78,0%), так и при СШ I (41,0%) (р<0,01) в форме моно и сочетанной инфекции. Относительное преобладание других типов ВПЧ (31,45,52) характерно для СШ I, однако не имеет существенных различий с латентной формой инфекции (р>0,05). Тяжесть цервикального предрака коррелирует с частотой выявления онкобелка Е7 ВПЧ. Преобладание персистирующего характера течения инфекции свойственно для СШП-Ш в отличие СЮТ (р=0,09) и латентной формы ПВИ (р<0,01).
ЛИТЕРАТУРА
1. Аполихина И.А., Денисова Е.Д. Папилломавирусная инфекция гениталий: актуальная проблема современной гинекологии и пути ее решения // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2007. - Т. 6. №6. - С.70-75.
2. Гаврикова М.В. Роль количественного тестирования вируса папилломы человека в диагностике и постлечебном наблюдении цервикальных интраэпителиальных поражений высокой степени тяжести: Автореф. дис. ... канд. мед. наук.
- М., 2010. - 23 с.
3. Евстигнеева Н.П. Экспрессия онкобелка Е7 у пациенток с урогенитальной папилломавирусной инфекцией // Российский журнал кожных и венерических болезней. -2006. - №2. - С.4-6.
4. Киселев В. И., Свешников П.Г., Барановский П.М. и др. Онкобелок Е7 вируса папилломы человека - новый маркер ранних стадий канцерогенеза. // Тегга Ме&са. - 2011. - №1.
- С.35-39.
5. Клинышкова Т.В., Каратюк Т.И., Самосудова И.Б. Клинико-микробиологические аспекты вирус папилломы человека-ассоциированных плоскоклеточных интраэпите-лиальных поражений шейки матки // Сибирский медицинский журнал. - Иркутск, 2011. - Т. 102. №3. - С.85-87.
6. Костевич Г.В., Косенко И.А. Результаты ВПЧ-диагностики и экспрессии онкобелков Е6/Е7 ВПЧ 16 типа при доброкачественных и предраковых заболеваниях шейки матки // Онкологический журнал. - 2010. - Т.4. №1. - С.33-36.
7. Подистов Ю.И., Лактионов К.П., Петровичев Н.Н., Брюзгин В.В. Эпителиальные дисплазии шейки матки (диагностика и лечение). - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 136 с.
8. Шипулина О.Ю., Куевда Д.А., Насонова В.С. и др.
Генотипы ВПЧ в раке и предраковой патологии шейки матки. Материалы Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее». - М., 2008. - С.79-80.
9. Choi H.S., Kang W.D, Kim S.M., et al. Difference of HPV genotyping in cervical precancer and cancer. - Lisbon: Eurogin, 2011. - Р.241.
10. Cuschieri K.S., Cubie H.A., Whitley M.W., et al. Persistent high risk HPV infection associated with development of cervical neoplasia in a prospective population study //J. Clin Pathol. -2005. - Vol. 58. №9. - Р.946-950.
11. Dobec M., Bannwart F., Kilgus S., et al. Human papillomavirus infection among women with cytological abnormalities in Switzerland investigated by an automated linear array genotyping test // J. Med Virol. - 2011. - Vol. 83. №8. -Р.1370-1376.
12. Ehehalt D., Pircher H., Dreier K., et al. Detection and quantication of HPV E7 oncoproteins in cervical smears. - Lisbon: Eurogin, 2011. - Р.126.
13. Kedzia W., Jozefiak A., Pruski D., et al. Human papilloma virus genotyping in women with CIN 1 // Ginekol Pol. - 2010. -Vol. 81. №9. - Р.664-667.
14. Shahsiah R., Khademalhosseini M., Mehrdad N., et al. Human papillomavirus genotypes in Iranian patients with cervical cancer. // Pathol Res Pract. - 2011. - Vol. 207. №12. - Р.754-757.
15. Stanley M. A practitioner’s guide to understanding Immunity to human papillomavirus // US Obstetrics & Gynecology. - 2009. - Vol. 4. №1. - Р.10-15.
16. Zur Hausen H. Papillomaviruses causing cancer: evasion from host - cell control in early events in carcinogenesis // J. Natl Cancer Inst. - 2000. - Vol. 92. №9. - Р.690-698.
Информация об авторах: 644043, Омск-43, ул. Ленина, 12; тел. (3812) 23-02-93, e-mail: klin_tatyana@mail.ru, Клинышкова Татьяна Владимировна - д.м.н., профессор; Самосудова Ирина Болеславовна - соискатель, врач-акушер-гинеколог; Каратюк Татьяна Ивановна - к.м.н., ассистент кафедры
© САВЧЕНКО И.А., РУКША Т.Г. - 2012 УДК 616-092 : 616.5
ПРИМЕНЕНИЯ ЛИГАНДА TSPO ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЕМ
УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Ирина Алексеевна Савченко, Татьяна Геннадьевна Рукша (Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов, кафедра патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова, зав. - д.м.н. Т.Г. Рукша)
Резюме. Целью данного исследования была оценка возможности применения лиганда TsPO для коррекции изменений, вызванных воздействием ультрафиолетового излучения. Исследование выполнено с помощью иммуно-гистохимического метода, а также лазерной допплеровской флоуметрии. Выявлено, что после воздействия ультрафиолетового излучения при применении диазепама показатели TsPO, клеточной пролиферации, уровни микроциркуляции, а также морфологические изменения в дерме остаются на уровне здоровой кожи. Таким образом, диазепам посредством взаимодействия с TsPO реализует противовоспалительный эффект в коже, что может быть использовано для определения новых молекулярных мишеней для терапии состояний, вызванных воздействием ультрафиолетового излучения.
Ключевые слова: TsPO, диазепам, ультрафиолетовое излучение, воспаление.
TSPO LIGAND DIAZEPAM APPLICATION FOR CORRECTION OF THE CHANGES CAUSED BY INFLUENCE OF ULTRAVIOLET RADIATION
I.A. Savchenko, T.G. Ruksha (Krasnoyarsk State Medical University named after V.F. Voino-Yasenetsky)
Summary. The estimation of application TsPO ligand for correction of the changes caused by influence of ultraviolet radiation was an objective of this research. The research has been executed by means of an immunohistochemical method, and also laser flowmetry. It has been established that after influence of ultraviolet radiation in application of a diazepam indicators TsPO, a cellular proliferation, microcirculation levels, and also morphological changes in a derma remain at level of a healthy skin. Thus, the diazepam by means of interaction with TsPO realizes antiinflammatory effect in a skin, that can be used for definition of new molecular targets for therapy of the conditions caused by influence of ultra-violet radiation.
Key words: TsPO, diazepam, ultraviolet radiation, inflammation.
Сохраняющиеся высокими уровни заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи обусловливают необходимость дальнейшего исследования эффектов ультрафиолетового излучения, поиска модуляторов хода воспалительного процесса, а также маркеров развития опухолевого процесса в коже.
TsPO (18 kDa translocator protein), ранее известный как периферический бензодиазепиновый рецептор, является фоточувствительным белком, экспрессия которого выявлена в клетках эпидермиса, дермы [5]. Показано, что через 30 минут после воздействия УФИ из двух молекул тирозина двух мономеров посредством образования ковалентных связей происходит образование полимеров TsPO [3].
Известно, что TsPO участвует в регуляции ряда биологических функций посредством связывания с лигандами [4,6]. Лигандами TsPO являются Ro 5-4864 (4-хлор-диазепам), РК 11195 (производное изохинолина карбоксамида, небензодиазепиновой природы), алпидем (ими-дазопиридин), FGIN-1-27 (2-арил-3-индолацетамид), бензодиазепины.
Диазепам рассматривается традиционно как анк-сиолитическое средство бензодиазепинового ряда. Оказывает седативно-снотворное, противосудорожное и центральное миорелаксирующее действие. Механизм действия диазепама обусловлен стимуляцией бензо-диазепиновых рецепторов супрамолекулярного ГАМК-бензодиазепин-хлорионофор рецепторного комплекса, приводящей к усилению ингибирующего действия ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты) на передачу нервных импульсов. Стимулирует бензодиазепиновые рецепторы, расположенные в аллостерическом центре постсинаптических ГАМК-рецепторов восходящей активирующей ретикулярной формации ствола мозга и вставочных нейронов боковых рогов спинного мозга; уменьшает возбудимость подкорковых структур головного мозга (лимбическая система, таламус, гипоталамус), тормозит полисинаптические спинальные рефлексы [1]. Однако известно, что помимо связывания с бензодиазепиновыми рецепторами центрального типа, диазепам также взаимодействует диазепиновыми рецепторами в периферических тканях - с TsPO практически с одинаковой афинностью [4]. Однако при этом эффекты TsPO в коже, в том числе модулируемые диазепамом, являются малоизученными. В дерматологической практике диазепам используется только в комплексной терапии при лечении заболеваний, сопровождающихся зудом.
В этой связи целью данного исследования была
оценка возможности применения лиганда TsPO для коррекции изменений, вызванных воздействием ультрафиолетового излучения.
Материалы и методы
Моделирование действия УФИ in vivo осуществлялось на белых беспородных крысах-самцах, содержащихся в стандартных условиях вивария, массой 220-240 г, исследование выполнено с соблюдением правил гуманного обращения с животными. В качестве источника УФИ использовалась лампа с длиной волны 240-400 нм. У животных в области предполагаемого воздействия УФИ предварительно удалялся волосяной покров. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Было сформировано 2 группы (n=6 в каждой группе) и контрольная группа. Доза облучения составила 600 Дж/м2, причем облучению подвергались два участка кожи крысы с противоположных сторон. Один участок после этого подвергался лечению. Для опытной группы применяли 0,2% диазепам из расчета 0,15 мг/кг массы в виде мази. Лечение проводилось в течение трех дней: в день облучения, через 24 часа, через 48 часов. Взятие биопсии осуществлялось через 72 часа после облучения.
Взятие биопсии размером 1х1 см кожи у крыс проводилось под местной анестезией - 2% раствор лидокаи-на внутрикожно из расчета 0,15 мг/кг веса животного. Биоптаты кожи фиксировались в 10% нейтральном за-буференном формалине с последующей заливкой в парафин. В дальнейшем изготавливались гистологические срезы для иммуногистохимического исследования толщиной до 5 мкм.
В качестве маркера интенсивности клеточной пролиферации использовался PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток). Проводилось иммуногистохими-ческое исследование с моноклональными антителами к PCNA (Novocastra Lab. Ltd., UK) и TsPO (Trevigen Inc., USA) по стандартным методикам. Использовались био-тинилированные вторичные антитела (BD Biosciences, USA) и диаминобензидин (BD Biosciences, USA) в качестве хромогена. Микроскопия производилась при увеличении в 600 раз с помощью микроскопа Olympus BX-41 с видеонасадкой Sanyo и компьютерной программы Infinity Software (Lumenera Corporation, Canada). Оценивалось число PCNA+ и TsPO+ клеток на 100 клеток эпидермиса.
В другой серии экспериментов гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Для каждой группы в дерме при увеличении в 600 раз с помощью микроскопа Olympus BX-41 с видеонасадкой Sanyo и компьютерной программы Infinity Software оценивались диаметр сосудов (с помощью окуляр-микрометра), уровень лимфоцитарной инфильтрации дермы, число дермальных капилляров в 10 полях зрения, после чего вычислялось среднее значение для каждого показателя. Количество PCNA+ эндотелиальных клеток определялось в 10 полях зрения с последующим вычислением среднего значения.
Параллельно производилось измерение уровня перфузии с помощью анализатора лазерного микроциркуляции крови ЛАКК-02 (Россия) у всех групп через 24, 48 и 72 часа.
Статистическая обработка результатов осуществлялась по методу Т-критерия Манна-Уитни для непараметрических исследований, а также с помощью метода Крускала-Уоллиса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05 [2].
Результаты и обсуждение
УФИ в дозе 600 Дж/м2 (3 минимальных эритемных дозы) вызывало уменьшение экспрессии TsPO и PCNA по сравнению с контрольной группой (а=0,01) (табл. 1).
Таблица 1
Уровни экспрессии TsPO и PCNA после воздействия диазепамом
Контроль УФИ УФИ + диазепам
% PCNA+ клеток/^G клеток эпидермиса 14,1±4,2 4±G,9# 11±1,8*
% TsPO+ клеток/^G клеток эпидермиса 77,6±9,1 62±6,4# 69±5,7*#
Примечание: # - статистически значимо по отношению к контролю, а=0,01; * - статистически значимо по отношению к УФИ, а=0,01.
Диазепам индуцировал статистически значимое увеличение уровня TSPO по сравнению с группой, не подвергавшейся лечению. Уровень PCNA увеличивался по сравнению с группой, где выполнялось облучение кожи ультрафиолетовым излучением без диазепама (а=0,01).
По данным доплеровской флоуметрии величина перфузии в нормальной коже составила 25,8±2,6 пф.ед. При измерении периферического кровообращения после облучения увеличивалась до 56,2±18,4 пф.ед. Наблюдалось статистически значимое снижение микроциркуляции до уровня контроля при использовании диазепама через 24ч. (22±2,1 пф.ед.), 48ч. (28,5±4,6 пф.ед.) и 72 ч. (20,0±5,1 пф.ед.) после облучения (а=0,05) (табл. 2).
Средний диаметр сосудов дермы в 10 полях зрения в нормальной коже составил 15,3 мкм, число PCNA+ клеток - 3,5 на 100 клеток эпидермиса, уровень перива-скулярной инфильтрации лимфоцитами 5,9 на 10 полей зрения. Статистически значимое увеличение данных
ЛИТЕРАТУРА
1.АрушанянЭ.Б., БейерЭ.В., БулгаковаА.С. Сравнительная оценка антистрессорной активности эпифизарного гормона мелатонина и диазепама. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - М., 2007. - Т. 70. №6. - С.9-12.
2. Майборода А.А., Калягин А.Н., Зобнин Ю.В., Щербатых А.В. Современные подходы к подготовке оригинальной статьи в журнал медико-биологической направленности в свете концепции «доказательной медицины» // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). - 2008. - Т. 76. №1. - С.5-8.
3. Delavoie F., Li H., Hardwick M., et al. In vivo and in vitro peripheral-type benzodiazepine receptor polymerization: functional significance in drug ligand and cholesterol binding //
параметров регистрировалось в группе, подвергшейся воздействию УФИ (а=0,05). В участках кожи, где применялся диазепам, данные показатели клеток оставались на уровне контроля (а=0,05).
Таким образом, в кератиноцитах крыс уровни TsPO и PCNA модулируются УФИ. В дозе 600 Дж/м2 ультрафиолетовое излучение вызывало снижение экспрессии TsPO и PCNA. Как указывалось выше, ультрафиолетовое излучение с длиной волны 254 нм вызывает полимеризацию TsPO. Авторы полагали, что индуктором образования полимеров выступали активные формы кислорода, тем более что была обнаружена корреляция между их уровнем и степенью образования полимеров [2]. Таким образом, стоит предположить, что эффект ультрафиолетового излучения на экспрессию TsPO также связан с изменением конформации рецептора и может быть обусловлен повышением уровня активных форм кислорода в коже при воздействии ультрафиолетовым излучением. В таком случае, TsPO может являться мишенью для активных форм кислорода, под воздействием которых изменяется структура рецептора, его функциональная активность и, как следствие, интенсивность клеточной пролиферации. Можно предположить, что диазепам, связываясь с TsPO, препятствует изменению конформации рецептора в результате действия активных форм кислорода после УФИ, в результате чего TsPO, а следовательно, и PCNA остаются на уровне контроля.
Морфофункциональные изменения в дерме, в частности увеличение скорости кровотока, увеличение диаметра капилляров, лимфоцитарная инфильтрация дермы могут быть объяснены развитием воспалительного процесса в коже. Увеличение пролиферации эндотелиальных клеток, регистрируемое по изменению уровня экспрессии PCNA, свидетельствует об активации нео-ангиогенеза, характерного также для воспаления. После облучения при применении лиганда TsPO диазепама все данные показатели оставались на уровне контроля, что может свидетельствовать о подавлении развития воспаления в коже данным агентом.
Таким образом, можно предположить, что диазепам посредством взаимодействия с TsPO реализует противовоспалительный эффект в коже, нивелируя действие активных форм кислорода, возникающих в результате действия УФИ. Выявленные данные могут быть использованы для определения новых молекулярных мишеней для терапии состояний, вызванных воздействием УФИ.
Biochemistry. - 2003. - Vol. 42. - P.4506-4519.
4. Stoebner P.E., Carayon P., Penarier G. The expression of peripheral benzodiazepine receptors in human skin the relationship with epidermal cell differentiation // British Journal of Dermatology. - 1999. - Vol. 140. - P.1010-1016.
5. Stoebner P.E., Carayon P., Casellas P., Portier M., et al. Transient protection by peripheral benzodiazepine receptors during the early events of UV light-induced apoptosis // Cell Death Differ. - 2001. - Vol. 8. - P.747-753.
6. Veenman L., Papadopoulos V., Gavish M. Channel-like functions of the 18kDa translocator protein (TsPO): regulation of apoptosis and steroidogenesis as part of the host-defense response // Current Pharmaceutical Design. - 2007. - Vol. 13. - P2385-2405.
Таблица 2
Особенности морфологии сосудов дермы после воздействия УФИ и воздействия диазепамом
Количество сосудов D, мкм PCNA+ в эндотелии Лимфоциты в поле зрения
Контроль 3,7±1,2 15,3±3,4 3,5±G,4 5,9±G,6
УФИ 4,3±1,3 24,9±1,9* 4,9±G,5* 8,1±1,1*
УФИ+диазепам 4,3±G,6 17±3,3# 3,6±G,4# 5,9±1,9#
Примечание:* - статистически значимо по отношению к контролю, а=0,05; # - статистически значимо по отношению к УФИ, а=0,05.
Информация об авторах: 660022, г. Красноярск, ул. П. Железняка, 1; тел. (3912)283649; e-mail: irina_savchenko2@mail.ru, Савченко Ирина Алексеевна — ассистент; Рукша Татьяна Геннадьевна — заведующий кафедрой, д.м.н.
