CC BY
371
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ПРИМЕНЕНИЕ ВАЛИДАЦИОНННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДИК
О.В. Гунар, И.А. Буйлова, Л.В. Колосова, А.В. Доренская
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
gunar@expmed.ru
Резюме: В статье представлены параметры валидации, рекомендуемые для микробиологических методов оценки качества лекарственных средств. Подтверждены сроки хранения инокулятов фармакопейного тест-штамма B. cereus АТСС10702, используемого для работы в лаборатории микробиологии. Представлены экспериментальные данные и рассчитаны параметры валидации, которые доказывают и обосновывают возможность применения изучаемого микробиологического метода для определения количественного содержания цианокобаламина в диапазоне от 0,025 до 0,075мкг/мл в многокомпонентных поливитаминных препаратах.
Ключевые слова: микробиологические методы, параметры валидации, тест-штамм микроорганизма, количественное содержание цианокобаламина.
VALIDATION STUDIES FOR THE ASSESSMENT OF MICROBIOLOGICAL METHODS
O.V. Gunar, I.A. Builova, L.V. Kolosova, A.V. Dorenskaya
Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow Abstract: The present article describes the validation parameters recommended for microbiological methods of drug quality assessment. The shelf-life for pharmacopoeia test strain inoculum of B. cereus ATCC10702, used in the Laboratory of microbiology, has been confirmed. It also adduces experimental and calculated data validation parameters which prove and justify the possibility of using microbiological method under study for the assay of cyanocobalamin content in a range from
0.025 to 0.075 mg/ mL in compound multivitamin preparations.
Key words: microbiological methods, validation parameters, microorganism test strain, cyanocobalamin assay content.
К основным требованиям GMP при оценке процессов и процедур, выполняемым как в производственных лабораториях испытания качества лекарственных средств (ЛС), так и в экспертных организациях, относится валидация.
Любое валидационное исследование предполагает создание документально оформленной доказательной базы, которая с высокой степенью убедительности подтверждала бы, что тот или иной запланированный
процесс неуклонно способствует достижению намеченных конкретных результатов, а используемые методы применяются обоснованно в полном соответствии с установленными требованиями. Среди используемых методов оценки качества ЛС выделяются микробиологические. Ввиду того, что с помощью микробиологических методов выявляют, идентифицируют микроорганизмы-контаминанты ЛС или используют стандартные тест-штаммы микроорганиз-
Таблица 1
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВАЛИДАЦИОННЫХ ПАРАМЕТРОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ И КАЧЕСТВЕННОМ ИСПЫТАНИЯХ
Валидационные параметры Микробиологические методы
качественные количественные
Правильность нет да
Прецизионность нет да
Специфичность да да
Предел обнаружения да да
Количественное определение предела обнаружения нет да
Линейность нет да
Диапазон применения нет да
Надежность да да
Устойчивость да да
мов, указанные методы принципиально отличаются от физико-химических и биохимических. Поэтому недостаточно использовать известные процедуры валидации аналитических методик с утвержденными параметрами.
Для микробиологических методов оценки качества ЛС рекомендуются следующие параметры валидации: правильность, прецизионность, специфичность, надежность, устойчивость методик [1, 2, 3]. При этом количественные и качественные микробиологические методы требуют различных подходов при выполнении валидационных процедур. Прежде всего, это касается перечня валидационных параметров. В таблице 1 приводится сравнение количественных и качественных методов с точки зрения необходимых и достаточных параметров валидации.
Целью настоящей работы было провести отдельные валидационные процедуры и представить с помощью некоторых из вышеуказанных параметров обоснование определенных микробиологических (количественных) методов, то есть показать на примерах значение валидации микробиологических методов.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.
1. С помощью валидационной процедуры подтвердить сроки лабораторного хранения инокулятов с различными концентрациями фармакопейного тест-штамма B. cereus, в течение которых сохраняется их жизнеспособность.
2. На основании рассчитанных валидационных параметров оценить микробиологический метод количественного определения содержания витамина В12 (цианокобаламина).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Тест-штаммы микроорганизмов: Bacillus cereus ATCC 10702 (ГФ XII изд., ч.1, ОФС «Микробиологическая чистота»), Esherichia coli 113-3 (ГФ XI изд., вып.2, 1990 г., стр. 49-52, раздел 6 «Определение цианокобаламина (витамина В)»).
Статистическую обработку полученных результатов и построение контрольных карт Шухарта проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6.1.478.
Контрольные карты Шухарта [4]:
■ это линейные графики, построенные на основании данных измерений показателей процесса (в частности хранения), оцениваемых на основании данных, получаемых выборочно через примерно равные интервалы времени;
■ инструмент, позволяющий отслеживать ход протекания процесса и воздействовать на него, предупреждая отклонения от предъявленных к процессу требований (или реагируя на отклонения). Карты количественных определений обычно отражают состояние процесса через разброс (изменчивость от наблюдения к наблюдению) и через располо-
жение центра (среднее значение). Поэтому контрольные карты для количественных данных почти всегда применяют и анализируют парами — одна карта для расположения, другая — для размахов. Наиболее часто используют пару X- и R-карту. На оси абсцисс отложены интервалы времени, через которые производили определение количества жизнеспособных клеток тест-микроорганизма, на оси ординат — средние значения и размах от среднего (для Х- и R-карт соответственно).
Для решения первой задачи валидационное исследование проводили следующим образом. Стандартизованную по оптическому стандарту мутности взвесь тест-штамма в растворе натрия хлорида изотоническом с концентрацией клеток B.cereus 107 и 103 КОЕ/ мл хранили при температуре 5 оС. Через определенные интервалы времени выполняли посев чашечным агаровым методом для определения количества микроорганизмов в инокуляте. Подсчет микроорганизмов проводили после посева на соево-казеиновый агар и инкубации в стандартных условиях в течение 24—48 ч в соответствии с ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота» [5]. Максимально допустимым временем хранения считали момент времени, в который наблюдали снижение концентрации микробных клеток на 0,51о§ [6]. Полученные результаты представляли в виде карт Шухарта типа Х^.
В рамках валидации оценивали показатели: правильность, прецизионность и специфичность. При исследовании специфичности показывали, что в ходе эксперимента определяли концентрацию клеток именно исследуемого тест-штамма, для чего производили посев на селективные среды и учитывали типичные колонии. Для анализа повторяемости выполняли не менее 6 параллельных определений.
В ходе исследования проводили мониторинг температуры хранения. Отклонений от заданных значений выявлено не было.
Для подтверждения правильности по результатам исследования после статистической обработки были построены контрольные карты Шухарта для суспензий B. cereus с концентрациями клеток 107, 103 КОЕ/мл во взвесях (рис. 1, 2). На оси ординат представлено количество жизнеспособных клеток микроорганизмов. Точки на оси абсцисс соответствуют определенному времени хранения, указанному в примечании к графикам. По данным на рисунках 1 и 2 видно, что количество микроорганизмов выходит за установленные пределы через 14 и 2 суток хранения для суспензий с концентрациями клеток 107 и 103 КОЕ/мл, соответственно.
При анализе повторяемости выявлено, что рассчитанная стандартная ошибка составляла от 2,66 до 7,31% для всех случаев, удовлетворяющих условиям правильности. После получения всех результатов проводили сравнение их с установленными критериями валидации. Результаты представлены в таблице 2. Отклонения параметров правильности и преци-
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Ведомости НЦЭСМП
зионности указывают максимально возможное время хранения взвесей с различными концентрациями.
Для решения второй задачи -обоснования применения микробиологических методов количественного определения некоторых витаминов, также были выполнены валидационные исследования. При этом наиболее важным параметром валидации считали точность. В соответствии с 1СН 02 [2, 3] точность может быть доказана, если рассчитаны такие параметры как прецизионность, линейность, специфичность. Выполненная процедура валидации включала оценку методики по основным параметрам, представленным в таблице 3.
На рис. 3 представлена выявленная зависимость диаметра зон роста витаминозависимого тест-штамма E. соИ 113/3 от концентрации циа-нокобаламина, определяемого в многокомпонентных витаминных препаратах. На графике (рис. 3) видно, что линейность наблюдается во всех исследованных диапазонах концентрации цианокобаламина. При этом коэффициент корреляции составлял 0,9883.
В ходе исследования учитывали рабочий диапазон (с учетом предела обнаружения) исследуемого микробиологического метода определения цианокобаламина, который находился в диапазоне от 0,025 до 0,075 мкг/мл. В этой области полученные значения параметров оценки для рассматриваемого метода на всех уровнях концентрации отвечало критериям приемлемости.
Таблица 2
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ КРИТЕРИИ ВАЛИДАЦИИ В СРАВНЕНИИ С РЕЗУЛЬТАТАМИ ИСПЫТАНИЙ
Гистограмма средних
Х-Ьаг: 57,024 (76,300); Сигма: 10,822 (10,311); п: 6,
Гистограмма размахов Размах 27,429 (27,400); Сигма: 9,1779 (9,1683); п: 6,
■......................j....................................................+........................................................+...........................................................................................
77-t-----------
119,40
76,300
33,200
142,48
27,400
5,4800
Рис 1. Карты сохранения жизнеспособности B. cereus с концентрацией 107 КОЕ/мл
Рис 2. Карты сохранения жизнеспособности Б. cereus с концентрацией 103 КОЕ/мл Примечание: точка на оси абсцисс 1 соответствует началу исследования, 2 - время хранения 1 сут; 3-2 сут, 4-7сут, 5-14 сут, 6-21 сут, 7-28сут, 8-50сут.
Критерии Результаты I
Специфичность Необходимо показать, что определяется сохранение жизнеспособности определенных тест-штаммов Тинкториальные свойства клеток после окрашивания по Граму и морфологический вид колоний на питательных средах характерны для Bacillus cereus
Правильность 107КОЕ/мл 103КОЕ/мл
Значения не должны выходить за установленные пределы. При выходе за контрольную границу считают этот момент времени конечным временем хранения B.cereus — 14 сут B.cereus — 2 сут
Прецизионность Стандартная ошибка должна быть не более 15% от 2,66 до 7,31%
б
Таблица З
ПАРАМЕТРЫ ВАЛИДАЦИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЦИАНОКОБАЛАМИНА
Параметр Определение термина Параметр оценки Критерий приемлемости
Прецизионность рассеяние результатов относительно величины среднего результата коэффициент вариации (СУ) коэффициент вариации не выше 15%
Линейность наличие прямой зависимости исследуемого параметра от концентрации определяемого вещества коэффициент корреляции № коэффициент корреляции должен быть не ниже 0,9
Специфичность способность метода давать правильный результат определения количества витамина в присутствии сопутствующих компонентов характеризуется использованием стандартных витаминозависимых штаммов близость результатов к стандартному образцу
Рабочий диапазон с учетом предела обнаружения интервал между верхним и нижним значением количественных характеристик определяемого компонента - результаты должны иметь приемлемый уровень точности
Для каждой концентрации значение коэффициента вариации не превышало 15%. Таким образом, все параметры удовлетворяли установленным критериям приемлемости.
ВЫВОДЫ
1. На примере количественного микробиологического метода определения содержания цианокобала-мина в многокомпонентных поливитаминных препаратах показана целесообразность проведения вали-дационных процедур и расчета таких параметров, как прецизионность, линейность, специфичность в определенном рабочем диапазоне концентрации. Обоснована возможность применения микробиологического метода для определения минимальных концентраций (до 0,08 мкг/мл) в испытуемых растворах.
2. Процесс лабораторного хранения при температуре 5 оС инокулятов тест-штамма B.cereus с концентрациями 107 и 103 КОЕ/мл, впервые охаракте-
ЛИТЕРАТУРА________________________________________________
1. Technical report No. 33 Evaluation, validation and Implementation of new Microbiological testing methods. PDA Journal
of Pharmaceutical Science and technology, vol. 54, number 3, 2000.
2. URL: http://www.ich.org «ICH Guideline Q2A Validation and analytical procedures: definitions and terminology»
3. URL: http://www.ich.org «ICH Guideline Q2B Validation and analytical procedures: methodology»
Диаметр іон роста, мм
16,5 п
13,5 -I---------------Т---------------Т---------------Т----------------1
О 0,02 0,04 0,06 0,08
Концентрация, мкг/мл
Рис. 3. Зависимость диаметра зон роста от концентрации цианокобаламина
ризованный с помощью контрольных карт Шухарта, показал возможность использовать приготовленные взвеси в течение не более 14 суток и не более 2 суток (соответственно).
4. Щукин О.С. Самооценка организации. Кросс-диагностика. Семь инструментов качества. Учебное пособие по курсу «Управление качеством». Воронеж, 2005. 58 с.
5. Государственная фармакопея РФ XII издание, часть 1. М: «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения». 2008. 704 с.
6. Lucia Clontz. Microbial limit and bioburden tests: validation approaches and global requirements. 2nd ed. CRC Press Taylor & Francis Group. 2009. 326 с.
ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
