Научная статья на тему 'ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕМБРАН ДЛЯ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА ТИПА 1 ШТАММ СЭБИНА'

ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕМБРАН ДЛЯ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА ТИПА 1 ШТАММ СЭБИНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
190
35
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ / КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ / ПОЛИОМИЕЛИТ / ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПОЛИОМИЕЛИТНАЯ ВАКЦИНА / ПЕРОРАЛЬНАЯ ПОЛИОМИЕЛИТНАЯ ВАКЦИНА

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ковпак А.А., Ивин Ю.Ю., Пиняева А.Н., Хапчаев Ю.Х., Ожерелков С.В.

Введение. Со времени создания инактивированных полиомиелитных вакцин различные стадии производственного процесса изменялись и совершенствовались. Современное производство вакцин на основе как диких, так и аттенуированных штаммов включает несколько технологических стадий, одной из которых является концентрирование вируссодержащей жидкости, позволяющее сконцентрировать вирус полиомиелита и очистить вируссодержащую жидкость от значительной части балластных компонентов.Целью исследования были сравнительная характеристика ультрафильтрационных мембран и подбор мембраны, обеспечивающей оптимальные показатели очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 (штамм Сэбина).Материалы и методы. Для проведения работ по концентрированию использовали лабораторные ультрафильтрационные системы двух производителей с мембранами 50, 100 и 300 кДа. Полученные результаты оценивали по содержанию общего белка, составляющего основную нагрузку на последующие стадии очистки, количеству инфекционного титра вируса в концентрате и содержанию D-антигена как целевого продукта. Оценивали также фактическое отсечение компонентов вируссодержащей жидкости различными мембранами для определения состава белковой нагрузки на целевой продукт.Результаты и обсуждение. Содержание D-антигена и очистка от примесных белков (содержание общего белка в концентрате) были наиболее оптимальными при концентрировании с использованием мембраны с отсечением 300 кДа. Вне зависимости от показателя отсечения мембраны, подавляющая часть клеточных компонентов вируссодержащей жидкости не отсекается на стадии осветляющей и стерилизующей фильтрации, а концентрируется и составляет основную белковую нагрузку на целевой продукт.Заключение. С точки зрения качества получаемого целевого продукта и технологичности производственного процесса использование мембраны 300 кДа является наиболее целесообразным при отработке технологии изготовления инактивированных полиомиелитных вакцин с использованием штаммов Сэбина вируса полиомиелита и культуры клеток линии Vero в качестве культуры-продуцента.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ковпак А.А., Ивин Ю.Ю., Пиняева А.Н., Хапчаев Ю.Х., Ожерелков С.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

APPLICATION OF ULTRAFILTRATION MEMBRANES FOR PURIFICATION AND CONCENTRATION OF SABIN POLIOVIRUS TYPE 1

Introduction. Since the development of inactivated polio vaccines, different stages of the production process have been changed and improved. Current production of inactivated polio vaccines based on both wild and attenuated strains includes several technological stages, one of which is the concentration of the virus-containing liquid, which ensures poliovirus concentration, and purification of the virus-containing liquid from a significant part of the ballast components.Research objective is to compare the characteristics of ultrafiltration membranes and select the membranes that provide optimal value of purification and concentration of poliovirus type 1 (Sabin strain).Materials and methods. Laboratory ultrafiltration systems from two manufacturers with 50, 100, and 300 kDa membranes were used for the concentration. Results were evaluated by the content of total protein, which is the main stress for the subsequent purification stages, the value of infectious virus titer in the concentrate, and the content of D-antigen as the target product.Results and discussion. Obtained results demonstrated that the content of the target product (the highest D-antigen content) and purification from impurity proteins (the total protein content in the concentrate) were most optimal when a membrane with a cut-off of 300 kDa was used for concentration. The study also evaluated the real cut-off components by various membranes to determine the composition of the protein load on the target product.Conclusion. In terms of quality of the resulting target product and the manufacturability of the production process, the use of a 300 kDa membrane is the most appropriate when working out the technology for manufacturing inactivated polio vaccine based on Sabin strains of poliovirus and the Vero line as a producing culture.

Текст научной работы на тему «ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕМБРАН ДЛЯ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА ТИПА 1 ШТАММ СЭБИНА»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Научная статья

https://doi.org/10.36233/0372-9311-94

Щ Check for updates

Применение ультрафильтрационных мембран для очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 штамм Сэбина

Ковпак А.А.1Н, Ивин Ю.Ю.1, Пиняева А.Н.1, Хапчаев Ю.Х.1, Ожерелков С.В.1, Белякова А.В.1, Ишмухаметов А.А.1,2

Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия;

2Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), Москва, Россия

Введение. Со времени создания инактивированных полиомиелитных вакцин различные стадии производственного процесса изменялись и совершенствовались. Современное производство вакцин на основе как диких, так и аттенуированных штаммов включает несколько технологических стадий, одной из которых является концентрирование вируссодержащей жидкости, позволяющее сконцентрировать вирус полиомиелита и очистить вируссодержащую жидкость от значительной части балластных компонентов. Целью исследования были сравнительная характеристика ультрафильтрационных мембран и подбор мембраны, обеспечивающей оптимальные показатели очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 (штамм Сэбина).

Материалы и методы. Для проведения работ по концентрированию использовали лабораторные ультрафильтрационные системы двух производителей с мембранами 50, 100 и 300 кДа. Полученные результаты оценивали по содержанию общего белка, составляющего основную нагрузку на последующие стадии очистки, количеству инфекционного титра вируса в концентрате и содержанию D-антигена как целевого продукта. Оценивали также фактическое отсечение компонентов вируссодержащей жидкости различными мембранами для определения состава белковой нагрузки на целевой продукт.

Результаты и обсуждение. Содержание D-антигена и очистка от примесных белков (содержание общего белка в концентрате) были наиболее оптимальными при концентрировании с использованием мембраны с отсечением 300 кДа. Вне зависимости от показателя отсечения мембраны, подавляющая часть клеточных компонентов вируссодержащей жидкости не отсекается на стадии осветляющей и стерилизующей фильтрации, а концентрируется и составляет основную белковую нагрузку на целевой продукт. Заключение. С точки зрения качества получаемого целевого продукта и технологичности производственного процесса использование мембраны 300 кДа является наиболее целесообразным при отработке технологии изготовления инактивированных полиомиелитных вакцин с использованием штаммов Сэбина вируса полиомиелита и культуры клеток линии Vero в качестве культуры-продуцента.

Ключевые слова: ультрафильтрация, концентрирование, полиомиелит, инактивированная полиомие-литная вакцина, пероральная полиомиелитная вакцина

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Для цитирования: Ковпак А.А., Ивин Ю.Ю., Пиняева А.Н., Хапчаев Ю.Х., Ожерелков С.В., Белякова А.В., Ишмухаметов А.А. Применение ультрафильтрационных мембран для очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 штамм Сэбин. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98(2): 135-143. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-94

Application of ultrafiltration membranes for purification and concentration of Sabin poliovirus type 1

Anastasia A. Kovpak1H, Yury Y. Ivin1, Anastasia N. Piniaeva1, Yusuf Kh. Khapchaev1, Sergey V. Ozherelkov1, Alla V. Belyakova1, Aydar A. Ishmukhametov12

Аннотация

Original article

https://doi.org/10.36233/0372-9311-94

© Коллектив авторов, 202i

ORIGINAL RESEARCHES

1Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia;

2I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia

Abstract

Introduction. Since the development of inactivated polio vaccines, different stages of the production process have been changed and improved. Current production of inactivated polio vaccines based on both wild and attenuated strains includes several technological stages, one of which is the concentration of the virus-containing liquid, which ensures poliovirus concentration, and purification of the virus-containing liquid from a significant part of the ballast components.

Research objective is to compare the characteristics of ultrafiltration membranes and select the membranes that provide optimal value of purification and concentration of poliovirus type 1 (Sabin strain). Materials and methods. Laboratory ultrafiltration systems from two manufacturers with 50, 100, and 300 kDa membranes were used for the concentration. Results were evaluated by the content of total protein, which is the main stress for the subsequent purification stages, the value of infectious virus titer in the concentrate, and the content of D-antigen as the target product.

Results and discussion. Obtained results demonstrated that the content of the target product (the highest D-antigen content) and purification from impurity proteins (the total protein content in the concentrate) were most optimal when a membrane with a cut-off of 300 kDa was used for concentration. The study also evaluated the real cut-off components by various membranes to determine the composition of the protein load on the target product. Conclusion. In terms of quality of the resulting target product and the manufacturability of the production process, the use of a 300 kDa membrane is the most appropriate when working out the technology for manufacturing inactivated polio vaccine based on Sabin strains of poliovirus and the Vero line as a producing culture.

Keywords: ultrafiltration, concentration, inactivated polio vaccine, oral polio vaccine, poliomyelitis Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

For citation: Kovpak A.A., Ivin Yu.Yu, Piniaeva A.N., Khapchaev Yu.Kh., Ozherelkov S.V., Belyakova A.V., Ishmu-khametov A.A. Application of ultrafiltration membranes for purification and concentration of Sabin poliovirus type 1. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2021;98(2): 135-143.

DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-94

Введение

История результативной борьбы с полиомиелитом насчитывает более 60 лет со времени создания моно-, би- и трехвалентных инактивированных и живых вакцин [1].

Использование этих вакцин с середины 19501960-х гг. позволило не только снизить заболеваемость полиомиелитом по всему миру, но и начать реализацию программы по искоренению этого заболевания [1]. Наиболее широко оба вида вакцин применялись в форме трехвалентных препаратов.

Присутствие в пероральной полиомиелитной вакцине живых аттенуированных штаммов полио-вируса в редких случаях приводит к возникновению вакциноассоциированного паралитического полиомиелита или к вспышкам циркулирующего вакцинно-родственного полиовируса [2]. Для исключения подобных рисков большинство экономически развитых стран либо полностью перешли на использование только инактивированной полиомиелитной вакцины (ИПВ), либо применяют её в комбинации с пероральной полиомиелитной вакциной [1].

Для производства ИПВ до сих пор многие производители используют высоковирулентные (дикие) штаммы полиовируса. Всемирная организация здравоохранения в целях повышения биобезопасности

процесса приготовления ИПВ рекомендует использовать в качестве вакцинных штаммов аттенуиро-ванные штаммы полиовируса, которые способны индуцировать нейтрализующие антитела как к ат-тенуированным, так и к диким штаммам вируса [3].

Производство ИПВ включает несколько стадий:

• наработка клеточной и вирусной биомассы из чувствительных к вакцинным штаммам полиовируса культур клеток;

• фильтрация и концентрирование вируссодер-жащей жидкости (ВСЖ);

• очистка и инактивация вируса формальдегидом [4].

Традиционно для культивирования клеточных линий используют различные питательные среды с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в качестве ростового фактора. Это приводит к тому, что в составе ВСЖ находятся различные белки сывороточного происхождения, клеточные компоненты и производные питательной среды, составляющие основную белковую нагрузку на дальнейшую стадию очистки вакцинного полуфабриката.

Для грубой очистки ВСЖ от вышеперечисленного балласта применяют осветляющую и стерилизующую фильтрации [4].

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученный фильтрат концентрируют. Процесс концентрирования проводят с использованием тангенциальной ультрафильтрации (УФ). Эта стадия получения вакцины является одной из основных стадий производства ИПВ, поскольку позволяет не только сконцентрировать вирус полиомиелита, но и очистить ВСЖ от значительной части балластных компонентов. Принципиальная схема установки для ультрафильтрации и пример потоков жидкости в мембранах кассетного типа представлены на рис. 1.

Для УФ различных биопродуктов используют мембраны с широким диапазоном по НОММ (номинальное отсечение по молекулярной массе), которое определяет мельчайший белок, отсекаемый мембраной: от 5 до 300 кДа, однако для концентрирования вируса полиомиелита как в лабораторных, так и в промышленных масштабах применяют УФ-мембраны с отсечением 100 кДа [5-7].

Нами не обнаружены исследования в области подбора современного УФ-оборудования для концентрирования вируса полиомиелита. В зарубежной научной литературе имеются публикации, связанные с концентрированием вируса полиомиелита с помощью центрифугирования [8] или с применением устаревших методов ультрафильтрации, без подробного описания и анализа [9-11]. В отечественной научной литературе встречаются обзоры [12] и публикации о сравнительном анализе УФ-мембран для очистки и концентрирования других вирусов, например вируса гриппа [13].

Цель настоящей работы — подбор УФ-мем-браны, обеспечивающей оптимальные показатели очистки и концентрирования вируса полиомиелита типа 1 (штамм Сэбина). Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

• провести сравнительную оценку характеристик УФ-мембран разных производителей;

• оценить влияние на качество целевого продукта мембран с разными показателями по отсечению;

• сравнить фактическое отсечение компонентов ВСЖ различными мембранами для определения состава белковой нагрузки на целевой продукт.

Качество получаемого концентрата оценивали:

• по количеству общего белка, составляющего основную нагрузку на последующие стадии очистки;

• по количеству инфекционного титра вируса в концентрате, позволяющего определить степень концентрирования;

• по содержанию D-антигена (специфические структуры на поверхности вирусной частицы [14], способные вызывать индукцию нейтрализующих антител) как целевого продукта, определяющего потенциал ИПВ.

а / а

3

г-Х-

нх-4

1

б / b

•t ШофЛ

шм

4441

3

Рис. 1. Схема ультрафильтрации.

a — принципиальная схема установки для ультрафильтрации:

1 — питающий насос; 2 — рециркуляционный насос;

3 — линия фильтрата; 4 — линия концентрата. б — направление потоков жидкости в кассете: 1 — исходная жидкость; 2 — концентрат; 3 — фильтрат.

Fig. 1. Ultrafiltration scheme.

a — schematic diagram of the ultrafiltration system: 1 — feed pump;

2 — recirculation pump; 3 — filtrate; 4 — concentrate. b — example of cassette flow path: 1 — initial liquid;

2 — concentrate; 3 — filtrate.

Материалы и методы

Для проведения работ по концентрированию использовали две лабораторные УФ-системы двух производителей: кассеты немецкой фирмы (I) с мембранами 100 кДа и автоматизированную систему американской фирмы (II) с мембранами 50, 100 и 300 кДа. Сравнительная характеристика УФ-мем-бран представлена в табл. 1. Процессы концентрирования вирусного сбора проводили в соответствии с условиями производителей.

Для репродукции вируса полиомиелита использовали перевиваемую культуру клеток линии Vero (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). Наработку культуры-продуцента проводили в спиннер-ных колбах («Bellco») рабочим объемом 3 л в условиях псевдосуспензии. В качестве микроносителей использовали «Cytodex 1» («GE Healthcare») в концентрации 3 г/л.

Клетки выращивали в питательной среде Игла МЕМ (ФНЦИРИП им. МП. Чумакова РАН) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот»). Для получения вирусной суспензии использовали аттенуированный штамм Сэбина полиовируса типа 1 — LSc, 2аЬ (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). Множественность заражения клеток составляла 0,02 ТЦД50 (тканевая цитопато-генная доза) на клетку. Получены две серии ВСЖ (титры 5,0 и 7,52 ТЦД50/мл) для достижения целей работ, описанных выше.

5

1

2

2

ORIGINAL RESEARCHES

Таблица 1. Характеристика УФ-мембран Table 1. Characteristics of ultrafiltration membranes

Показатель Parameter УФ-мембранаI Membrane I УФ-мембрана II Membrane II

Площадь фильтрующей поверхности, см2 Surface area of the filtration, cm2 200 50

Минимальный рабочий объем, мл Minimal working volume, ml 20 15

Мёртвый объем мембраны, мл Dead volume of the membrane, ml 5,3 3,2

Материал Material Полиэфирсульфон Polyethersulfone Полиэфирсульфон Polyethersulfone

Размер пор мембран, мкм Pore size of the membrane, micron ~0,1 ~0,1

Таблица 2. Характеристика первичных и вторичных антител Table 2. Characteristics of primary and secondary antibodies

Молекулярная Вторичные антитела,

Первичные антитела масса, кДа конъюгированные с пероксидазои хрена

Primary antibodies Molecular Secondary antibodies conjugated with

weight, kD horseradish peroxidase

Кроличьи моноклональные антитела к гамма-актину (разведение 1 : 2500)

Anti-actin rabbit monoclonal antibodies (dilution 1 : 2,500)

Поликлональные козьи антитела к a-Nup 96 (C-20) sc 27400 (разведение 1 : 1000)

a-Nup 96 (C-20) sc 27400 goat polyclonal antibodies (dilution 1 : 1,000)

Кроличьи моноклональные антитела к eiF4G (разведение 1 : 1000) eiF4G rabbit monoclonal antibodies (dilution 1 : 1,000)

Мышиные моноклональные антитела к Nup 153 [QE6] (разведение 1 : 2500)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Nup 153 [QE6] mouse monoclonal antibodies (dilution 1 : 2,500)

42 Антикролик (разведение 1 : 25 000)

Anti-rabbit (dilution 1 : 25,000)

96 Курица-антикоза (разведение 1 : 1000)

Chicken anti-goat (dilution 1 : 1,000)

170 Антикролик (разведение 1 : 25,000)

Anti-rabbit (dilution 1 : 25,000)

153 Антимышь (разведение 1 : 2500)

Anti-mouse (dilution 1 : 2,500)

Осветляющую и стерилизующую фильтрацию вирусного сбора проводили через 50-55 ч после заражения с использованием вакуумных бутылочных фильтров <^егйор» («Мегск МИНроге») с диаметром пор 0,45 и 0,22 мкм. Перед проведением фильтрации ВСЖ отделяли от осадка частиц микроносителя декантированием.

Специфическую активность вируса определяли по стандартной методике на культуре клеток Нер-2 Цинциннати. Выражали титр в ^ ТЦД^/мл1.

Концентрацию общего белка определяли по методике Лоури без осаждения2.

Присутствие бычьего сывороточного альбумина в образцах определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по общепринятой ме-тодике3.

Образцы концентратов и фильтратов с каждого этапа концентрирования (50, 100, 300 кДа) подвергали электрофорезу по методу Лэмли в присутствии

1 МУК 4.2.2410-08 Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП).

2 0ФС.1.2.3.0012.15. Определение белка. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV, том I.

додецилсульфата натрия3. Разделённые в 12% поли-акриламидном геле белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида («GE Healthcare»). Для предотвращения неспецифического связывания антител мембрану промывали блокирующим раствором (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,05% Твин 20, 5% сухое молоко), затем инкубировали с первичными антителами (табл. 2), которые связываются с исследуемым белком. Мембрану промывали для удаления всех несвязанных первичных антител и инкубировали с конъюгированными вторичными антителами (табл. 2), которые связываются с первичными антителами. Мембрану промывали для удаления всех несвязанных вторичных антител и инкубировали с субстратом ECL-Plus («GE Healthcare»), который реагирует с конъюгированными вторичными антителами для обнаружения расположения белка. Хемилюминесцентное излучение экспонировали на рентгеновскую пленку («Kodak»).

В настоящее время главным способом определения содержания D-антигена в ИПВ является

3 0ФС.1.2.3.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV, том I.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

иммуноферментный анализ [15]. Для количественного определения целевого продукта использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа в «сэндвич»-варианте на основе специфических антител класса Y яичных желтков [16].

Результаты и обсуждение

На первом этапе работ была проведена ультрафильтрация с использованием мембран двух производителей с одинаковыми показателями по отсечению.

Фильтрацию и концентрирование ВСЖ (5,0 ТЦД50/мл) проводили с использованием кассет с отсечением 100 кДа двух производителей: Германии (I) и США (II). В фильтратах, полученных в результате концентрирования, инфекционных вирусных частиц и D-антигена не обнаружено. Результаты анализов полученных концентратов представлены в табл. 3.

Титры вируса и содержание общего белка в концентратах, полученных с использованием обоих мембранных фильтров, статистически достоверно не различались. Разница в содержании D-антигена составляла не более 10%.

Полученные результаты показывают, что оба типа мембранных кассет могут быть использованы для концентрирования ВСЖ вируса полиомиелита типа 1.

На втором этапе исследований была проведена ультрафильтрация ВСЖ (7,52 ТЦД50/мл) вируса полиомиелита типа 1 с использованием мембран с отсечением 50, 100 и 300 кДа (I). Содержание D-анти-гена в концентрате, полученном с использованием мембраны с отсечением 100 кДа, было статистически достоверно выше показателей, полученных при использовании кассет с отсечением 50 и 300 кДа (табл. 4). Титры вируса в концентратах, полученных с использованием всех трёх типов мембран, достоверно не различались. По содержанию общего белка минимальный показатель был у концентра-

Таблица 3. Результаты анализов концентратов вируса полиомиелита типа 1, полученных при использовании кассет I и II с отсечением 100 кДа (M ± m) Table 3. Results of analyses of poliovirus type 1 concentrates obtained using cassettes I and II with 100 kDa cut-off (M ± m)

Показатель Кассета I Кассета II

Parameter Cassette I Cassette II

Титры вируса, lg ТЦД50/мл Virus titers, lg TCID50/ml

D-антиген, DU/мл D-antigen, DU/ml

5,85 ± 0,45 5,7 ± 0,07 10,5 ± 0,83 11,6 ± 0,51* 5,3 ± 1,1

Содержание общего белка, мг/мл 5,3 ± 0,5 Total protein, mg/ml

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с кассетоИ I (непарный, двухвостовоИ t-критерий Стьюдента). Note. *р < 0,05 compared to cassette I (unpaired, two-tailed Student's t-test).

та, приготовленного при использовании мембраны с отсечением 300 кДа. Аналогичные показатели в двух других концентратах не различались и были статистические достоверно выше.

Для оценки потерь целевого продукта фильтраты, полученные во время процессов концентрирования, также были проанализированы по показателям: специфическая активность вируса, содержание D-антигена и общего белка. Содержание общего белка в фильтратах также согласовалось с данными, полученными в концентратах: 0,18 ± 0,02, 0,19 ± 0,02 и 1,38 ± 0,1 мг/мл для кассет с отсечением 50, 100 и 300 кДа соответственно. Инфекционные вирусные частицы и D-антиген в фильтратах не обнаружены.

Получаемый полупродукт с использованием мембран с отсечением 300 кДа является наиболее оптимальным с точки зрения очистки концентрата от примесных белков и оценки его чистоты. По содержанию целевого продукта полученные концентраты отличаются не более чем на 15% от концентратов, полученных при использовании мембран с

Таблица 4. Результаты анализов концентратов вируса полиомиелита типа 1, полученных при использовании кассет с отсечением 50, 100 и 300 кДа в сравнении с исходной ВСЖ (M ± m)

Table 4. Results of analyses of poliovirus type 1 concentrates obtained using 50, 100 and 300 kD cut-off cassettes in comparison with the original viral suspension (M ± m)

Показатель Parameter

Исходная ВСЖ Original viral suspension

50 кДа/kD

100 кДа/kD

300 кДа/kD

Титры вируса, lg ТЦД50/мл Virus titers, lg TCID50/ml

7,52 ± 0,31

8,73 ± 0,25*

8,52 ± 0,07*

8,43 ± 0,19*

D-антиген, DU/мл D-antigen, DU/ml

11,00 ± 0,58

496,00 ± 3,05*

594,00 ± 9,07*

509,00 ± 35,3*

Содержание общего белка, мг/мл Total protein, mg/ml

0,81 ± 0,03

44,66 ± 4,37*

44,49 ± 1,44*++

29,52 ± 0,54*

Примечание. р < 0,05 по сравнению с: *исходной ВСЖ, +отсечением 100 кДа, ++отсечением 300 кДа (непарный, двухвостовоИ t-кри-терий Стьюдента).

Note. р < 0,05 compared to: *original viral suspension; +100 kD and ++300 kD cut-off cassettes (unpaired, two-tailed Student's t-test).

ORIGINAL RESEARCHES

a / a

M

705540-

50 кДа / kD ЮОкДа/kD ЗООкДа/kD C F C ^ C F

б / b

50 кДа / kD ЮОкДа/kD ЗООкДа/kD

M

554035-

50 кДа / kD ЮОкДа/kD 300 кДа / kD

50 кДа / kD ЮОкДа/kD 300 кДа / kD

в / с

M

18013010070 -

с.р.

55 -

г / d

M

180 -130 -

10070 -

55 -

с.р.

40 -

Рис. 2. Вестерн-блот-анализ концентратов (С), фильтратов (F) и вируссодержащей жидкости (S) с использованием антител к а-актину (а), фактору инициации трансляции (elF4GI) (б), нуклеопоринам Nup 96 (в) и Nup 153 (г). На рисунке указаны продукты расщепления нуклеопоринов (c.p.). Fig. 2. Western blot analysis of concentrates (C), filtrates (F), and viral suspension (S) using antibodies to а-actin (a), eIF4GI factor (b), nucleoporins Nup 96 (с) and Nup 153 (d). The figure shows the cleavage products of nucleoporins (c.p.).

S

отсечением 100 кДа, что позволяет использовать мембраны с отсечением 300 кДа.

Для оценки фактического отсечения клеточных и вирусных компонентов мембранами 50, 100 и 300 кДа в соответствующих фильтратах и концентратах, а также определения компонентов, составляющих основную белковую нагрузку концентратов, использовали электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн-блоттинг. Клеточные компоненты были выбраны на основании их масс в диапазоне 40-170 кДа. На рис. 2 представлены результаты ве-стерн-блоттинга выбранных компонентов.

Несмотря на то что актин (рис. 2, а), имеющий молекулярную массу 42 кДа и размер 4-9 нм, является глобулярным, он полностью концентрируется мембранами на 100 и 300 кДа. Вероятно, это обусловлено связыванием актина с другими компонентами ВСЖ с образованием соединений с массой, превышающей отсечения пор.

На рис. 2, в, г представлены продукты расщепления нуклеопоринов Nup 96 и Nup 153 [17] в конце полиовирусной инфекции, которые одинаково удерживаются рассматриваемыми мембранами.

Фактор инициации трансляции eIF4GI является белком, который участвует в инициации трансляции эукариот и является компонентом кэп-связыва-ющего комплекса еШ4Е На рис. 2, б представлены продукты расщепления этого белка [18]. Только при концентрировании ВСЖ кассетой с отсечением 300 кДа небольшая часть продуктов расщепления попадает в фильтрат, а основная масса, как и в случае использования мембран с отсечением 50 и 100 кДа, собирается в концентрате.

Исходя из полученных результатов ве-стерн-блоттинга, можно сделать вывод о том, что, вне зависимости от показателя отсечения мембраны, подавляющая часть клеточных компонентов ВСЖ не отсекается на стадии осветляющей и стерилизующей фильтрации, а концентрируется и составляет основную белковую нагрузку на целевой продукт.

На следующем этапе исследования для детекции вирусных белков использовали поликло-нальные кроличьи антитела (ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН). На рис. 3 представлен результат вестерн-блот-анализа исследуемых концентратов и фильтратов на капсидный белок полиовируса (УР1), имеющий молекулярную массу 32 кДа [19].

На представленном вестерн-блоте отчётливо видны несколько полос: молекулярной массой 32 кДа — капсидный белок полиовируса (УР1) и полосы, характерные для неспецифического связывания вторичных антител с мембраной. Присутствие в фильтратах различных белковых продуктов вирусной природы может свидетельствовать о том, что в течение полиовирусной инфекции часть вирусных единиц могла не собраться в полный вирион и находится в ВСЖ в виде различных компонентов вируса, включая инфекционную РНК.

Производители УФ-мембран предлагают пользователю очень ограниченную информацию о свойствах УФ-мембран. В табл. 5 представлена характеристика рассматриваемых мембран одного из производителей УФ-оборудования. Производитель заявляет, что мембраны с отсечением 100 кДа задерживают менее 80% альбумина, 300 кДа не задерживают и пропускают его в фильтрат, а мембраны

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

5D кДа I kD

1DD кДа/kD

M

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

37-

VP1 25

15 1D-

S

C

3DD кДа I kD C F~

Рис. 3. Капсидный белок вируса полиомиелита VP1 в концентратах (C), фильтратах (F) и ВСЖ (S). Fig. 3. Capsid protein of the poliomyelitis virus VP1 in concentrates (C), filtrates (F) and viral suspension (S).

Таблица 5. Характеристика мембран по отсекаемым компонентам (%) Table 5. Characteristics of membranes by cut-off components (%)

Вещество Substance Приблизительная молекулярная масса, кДа Approximate molecular weight, kDa Мембрана, кДа Membrane, kD

3o 50 ioo 3oo

Витамин В12 Vitamin B12

Бычий сывороточный альбумин Bovine serum albumin

Y-Глобулин Y-Globulin

Декстран Dextran

1,2 67 169

2ooo

> 95

> 99

< so

> 98

< 7o > 95

50 кДа способны задерживать более 95% альбумина в растворе.

Исходя из полученных нами данных, можно сделать предположение, что все мембраны имеют минимальные различия по индикаторному белку — альбумину (рис. 4). Все рассматриваемые мембраны задерживают сывороточный альбумин в равной степени, незначительное отличие имеется только при использовании мембраны 300 кДа.

Заключение

Показано, что применение мембран с тем или иным отсечением не оказывает существенного влияния на основные характеристики целевого продукта. Все использованные в работе мембраны удерживали тестируемые клеточные компоненты и компоненты сыворотки вне зависимости от размера отсечения. Это может быть связано как с конформа-цией компонентов, что приводит к их удерживанию мембраной, так и с налипанием их на другие компоненты ВСЖ (вирусные частицы). Разница не видна и в отношении вирусных белков, проскок которых в фильтрат практически одинаков для каждого типа мембран.

Применение мембран с отсечением 300 кДа с точки зрения качества получаемого целевого продукта и технологичности производственного процесса является наиболее целесообразным для отработки технологии изготовления ИПВ с исполь-

зованием вируса полиомиелита штаммов Сэбина и клеток линии Vero в качестве культуры-продуцента.

При проведении процесса ультрафильтрации с мембранами с отсечением 300 кДа процесс концентрирования занимает меньше времени, чем при тех же условиях, но с применением других мембран.

Поскольку получаемый концентрат не является конечным продуктом, а только первой стадией получения ИПВ, основные требования, предъявляемые к качеству концентрата, включают в себя показатели содержания D-антигена и титр вируса, которые сильно зависят от степени концентрирования.

50 кДа / kD 100 кДа I kD 300 кДа / kD

M

250150 -100 -755037-

C

F

t • ♦

Рис. 4. Присутствие бычьего сывороточного альбумина в концентратах (C), фильтратах (F) и вируссодержащей жидкости (S).

Fig. 4. Presence of bovine serum albumin in concentrates (C), filtrates (F), and viral suspension (S).

S

Концентраты также характеризуются содержанием целевого продукта, бычьего сывороточного альбумина и общего белка. Эти компоненты составляют основную нагрузку на стадии очисток полуфабриката (гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию) и, соответственно, напрямую влияют на качество очистки получаемого полупродукта на последующих стадиях. Концентраты, полученные с использованием мембран с отсечением 300 кДа, характеризуются наименьшим содержанием бычьего сывороточного альбумина и общего белка (табл. 4). Это позволяет очистить полупродукт (после хро-матографических очисток) за меньшее количество циклов и избежать потерь целевого продукта, что является важным для производственного процесса.

Благодарности

Авторы выражают благодарность м.н.с. Л.П. Антоновой и И.О. Целых, а также н.с. А.А. Ши-шовой за помощь в выполнении исследования.

СПИСОК ИСТОЧНИКОВ

1. Бичурина М., Романенкова Н., Розаева Н., Воротникова В. Глобальная ситуация по полиомиелиту. Стратегия и тактика ВОЗ по ликвидации полиомиелита. Журнал инфектологии. 2011; 3(2): 5-14.

https://doi.org/10.22625/2072-6732-2011-3-2-5-14

2. Харит С., Покровский В., Рулёва А., Фридман И. Программа эрадикации полиомиелита ВОЗ: проблемы и решения. Педиатрическая фармакология. 2016; 13(3): 289-98. https://doi.org/10.15690/pf.v13i3.1580

3. Simizu B., Abe S., Yamamoto H., Tano Y., Ota Y., Miyazawa M., et al. Development of inactivated poliovirus vaccine derived from Sabin strains. Biologicals. 2006; 34(2): 151-4. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2006.02.010

4. Thomassen Y.E., van't Oever A.G., Vinke M., Spiekstra A., Wijffels R.H., van der Pol L.A., et al. Scale-down of the inactivated polio vaccine production process. Biotechnol. Bioeng. 2013; 10(5): 1354-65. https://doi.org/10.1002/bit.24798

5. Thomassen Y.E., van't Oever A.G., van Oijen M.G.C.T., Wijffels R.H., van der Pol L.A., Bakker W.A.M., et al. Next generation inactivated polio vaccine manufacturing to support post-polio-eradication biosafety goals. PLoS One. 2013; 8(12): e83374. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083374

6. Bakker W.A.M., Thomassen Y.E., van't Oever A.G., Westdijk J., van Oijen M.G.C.T., Sundermann L.C., et al. Inactivated polio vaccine development for technology transfer using attenuated Sabin poliovirus strains to shift from Salk-IPV to Sabin-IPV. Vaccine. 2011; 29(41): 7188-96. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.05.079

7. Furtak V., Roivainen M., Mirochnichenko O., Zagorodnyaya T., Laassri M., Zaidi S.Z., et al. Environmental surveillance of viruses by tangential flow filtration and metagenomic reconstruction. Euro Surveill. 2016; 21(15): pii30193. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.15.30193

8. Guskey L.E., Wolff D.A. Concentration and purification of poliovirus by ultrafiltration and isopycnic centrifugation. Appl. Microbiol. 1972; 24(1): 13-7.

9. Van Ramshorst J.D. The concentration of poliovirus antigens for D-antigen determination. Bull. World Health Organ. 1967; 36(2): 209-18.

10. Theiler M., Bauer J.H. Ultrafiltration of the virus of poliomyelitis. J. Exp. Med. 1934; 60(6): 767-72. http://doi.org/10.1084/jem.60.6.767

ORIGINAL RESEARCHES

11. Sabin A.B., Hennessen W.A., Warren J. Ultrafiltration and electron microscopy of three types of poliomyelitis virus propagated in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954; 85(2): 35963. https://doi.org/10.3181/00379727-85-20881

12. Комиссаров А.В., Алешина Ю.А., Громова О.В., Никифоров А.К., Еремин С.А., Волох О.А. и др. Применение ультрафильтрации для концентрирования и очистки антигенов. Проблемы особо опасных инфекций. 2015; (1): 79-84.

13. Кызин А.А., Загидуллин Н.В., Гелич Л.В., Тимербаева Р.Х., Исрафилов А.Г. Очистка и концентрирование вируса гриппа методом микро и ультрафильтрации. Вестник Башкирского университета. 2014; 19(4): 1223-7.

14. Ferguson M., Wood D.J., Minor P.D. Antigenic structure of poliovirus in inactivated vaccines. J. Gen. Virol. 1993; 74 (Pt. 4): 685-90. https://doi.org/10.1099/0022-1317-74-4-685

15. Rezapkin G., Martin J., Chumakov K. Analysis of antigenic profiles of inactivated poliovirus vaccine and vaccine-derived polioviruses by block-ELISA method. Biologicals. 2005; 33(1): 29-39. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2004.11.001

16. Иванов А.П., Козлов В.Г., Клеблеева ТД., Иванова О.Е., Киктенко А.В. Система иммуноферментного анализа на основе специфических антител класса (IgY) из яичных желтков для количественного определения D-антигена в ин-активированных полиовирусных вакцинах. Вопросы вирусологии. 2014; 59(6): 39-42.

17. Park N., Katikaneni P., Skern T., Gustin K.E. Differential targeting of nuclear pore complex proteins in poliovirus-infected cells. J. Virol. 2008; 82(4): 1647-55. https://doi.org/10.1128/jvi.01670-07

18. Cardinali B., Fiore L., Campioni N., De Dominicis A., Pier-andrei-Amaldi P. Resistance of ribosomal protein mRNA translation to protein synthesis shutoff induced by poliovirus. J. Virol. 1999; 73(8): 7070-6. https://doi.org/10.1128/jvi.73.8.7070-7076.1999

19. Hogle J.M., Chow M., Filman D.J. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science. 1985; 229(4720): 1358-65. https://doi.org/10.1126/science.2994218

REFERENCES

1. Bichurina M., Romanenkova N., Rozaeva N., Vorotnikova V. Global situation for poliomyelitis. Who strategy and tactics of global polio eradication. Zhurnal infektologii. 2011; 3(2): 5-14. https://doi.org/10.22625/2072-6732-2011-3-2-5-14 (in Russian)

2. Kharit S., Pokrovskiy V., Ruleva A., Fridman I. WHO polio eradication program: problems and solutions. Pediatricheskaya farmakologiya. 2016; 13(3): 289-98. https://doi.org/10.15690/pf.v13i3.1580 (in Russian)

3. Simizu B., Abe S., Yamamoto H., Tano Y., Ota Y., Miyazawa M., et al. Development of inactivated poliovirus vaccine derived from Sabin strains. Biologicals. 2006; 34(2): 151-4. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2006.02.010

4. Thomassen Y.E., van't Oever A.G., Vinke M., Spiekstra A., Wijffels R.H., van der Pol L.A., et al. Scale-down of the inactivated polio vaccine production process. Biotechnol. Bioeng. 2013; 10(5): 1354-65. https://doi.org/10.1002/bit.24798

5. Thomassen Y.E., van't Oever A.G., van Oijen M.G.C.T., Wijffels R.H., van der Pol L.A., Bakker W.A.M., et al. Next generation inactivated polio vaccine manufacturing to support post-polio-eradication biosafety goals. PLoS One. 2013; 8(12): e83374. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083374

6. Bakker W.A.M., Thomassen Y.E., van't Oever A.G., Westdijk J., van Oijen M.G.C.T., Sundermann L.C., et al. Inactivated polio vaccine development for technology transfer using attenuated Sabin poliovirus strains to shift from Salk-IPV to Sabin-IPV. Vaccine. 2011; 29(41): 7188-96. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2011.05.079

7. Furtak V., Roivainen M., Mirochnichenko O., Zagorodnyaya T., Laassri M., Zaidi S.Z., et al. Environmental surveillance of viruses by tangential flow filtration and metagenomic reconstruc-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

tion. Euro Surveill. 2016; 21(15): pii30193. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.15.30193

8. Guskey L.E., Wolff D.A. Concentration and purification of poliovirus by ultrafiltration and isopycnic centrifugation. Appl. Microbiol. 1972; 24(1): 13-7.

9. Van Ramshorst J.D. The concentration of poliovirus antigens for D-antigen determination. Bull. World Health Organ. 1967; 36(2): 209-18.

10. Theiler M., Bauer J.H. Ultrafiltration of the virus of poliomyelitis. J. Exp. Med. 1934; 60(6): 767-72. http://doi.org/10.1084/jem.60.6.767

11. Sabin A.B., Hennessen W.A., Warren J. Ultrafiltration and electron microscopy of three types of poliomyelitis virus propagated in tissue culture. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1954; 85(2): 359-63. https://doi.org/10.3181/00379727-85-20881

12. Komissarov A.V., Aleshina Yu.A., Gromova O.V., Nikifo-rov A.K., Eremin S.A., Volokh O.A., et al. Deployment of ultrafiltration for concentrating and purification of antigens. Prob-lemy osobo opasnykh infektsiy. 2015; (1): 79-84. (in Russian)

13. Kyzin A.A., Zagidullin N.V., Gelich L.V., Timerbaeva R.Kh., Israfilov A.G. Purification and concentration of influenza virus by micro and ultafiltration. Vestnik Bashkirskogo universiteta. 2014; 19(4): 1223-7. (in Russian)

14. Ferguson M., Wood D.J., Minor P.D. Antigenic structure of poliovirus in inactivated vaccines. J. Gen. Virol. 1993; 74(Pt. 4): 685-90. https://doi.org/10.1099/0022-1317-74-4-685

15. Rezapkin G., Martin J., Chumakov K. Analysis of antigenic profiles of inactivated poliovirus vaccine and vaccine-derived polioviruses by block-ELISA method. Biologicals. 2005; 33(1): 29-39. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2004.11.001

16. Ivanov A.P., Kozlov V.G., Klebleeva TD., Ivanova O.E., Kik-tenko A.V. An ELISA system based on the specific class Y (IgY) antibodies from egg yolks for the quantitative determination of D-antigen in inactivated poliovirus vaccines. Voprosy viruso-logii. 2014; 59(6): 39-42. (in Russian)

17. Park N., Katikaneni P., Skern T., Gustin K.E. Differential targeting of nuclear pore complex proteins in poliovirus-infected cells. J. Virol. 2008; 82(4): 1647-55. https://doi.org/10.1128/jvi.01670-07

18. Cardinali B., Fiore L., Campioni N., De Dominicis A., Pieran-drei-Amaldi P. Resistance of ribosomal protein mRNA translation to protein synthesis shutoff induced by poliovirus. J. Virol. 1999; 73(8): 7070-6.

https://doi.org/10.1128/jvi.73.8.7070-7076.1999

19. Hogle J.M., Chow M., Filman D.J. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science. 1985; 229(4720): 1358-65. https://doi.org/10.1126/science.2994218

Информация об авторах

Ковпак Анастасия Александровнаи — м.н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов, ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0003-3200-763X Ивин Юрий Юрьевич — н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов, ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https:// orcid.org/0000-0003-0995-7944

Пиняева Анастасия Николаевна — м.н.с. лаб. молекулярной биологии вирусов, ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-5381-2393

Хапчаев Юсуф Хаджи-бекович — д.б.н., начальник отделения полиомиелитной вакцины ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0003-1613-5228 Ожерелков Сергей Викторович—д.б.н., в.н.с. лаб. клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9778-0485

Алла Владимировна Белякова — к.б.н., учёный секретарь, ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия, https://orcid. org/0000-0003-4363-6394

Ишмухаметов Айдар Айратович — д.м.н., проф., член-корр. РАН, генеральный директор ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, Москва, Россия; зав. кафедрой организации и технологии иммунобиологических препаратов ПМГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-6130-4145

Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.

Статья поступила в редакцию 29.10.2020; принята к публикации 10.02.2021; опубликована 20.04.2021.

Information about the authors

Anastasia A. Kovpa№ — junior researcher, Laboratory of molecular biology of viruses, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0003-3200-763X

Yury Y. Ivin — senior researcher, Laboratory of molecular biology of viruses, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0003-0995-7944

Anastasia N. Piniaeva — junior researcher, Laboratory of molecular biology of viruses, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-5381-2393

Yusuf Kh. Khapchaev — D. Sci. (Biol.), Head, Polio vaccine department, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0003-1613-5228 Sergey Viktorovich Ozherelkov — D. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of tick-borne encephalitis and other viral encephalitis, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9778-0485

Alla Vladimirovna Belyakova — Cand. Sci. (Biol.), researcher, Laboratory of biotechnology, Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0003-4363-6394

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Aydar A. Ishmukhametov — D. Sci. (Med.), Prof., corresponding member of the Russian Academy of Sciences, General Director, Chu-makov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia; Head, Department of organization and technology of immunobiological preparations, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia, https:// orcid.org/0000-0001-6130-4145

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.

The article was submitted 29.10.2020; accepted for publication 10.02.2021;

published 20.04.2021.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.