CC BY
4
хроматон-супер + 5 % ОУ-17, и хроматон —ОМСБ
(фракция 0,315—0,400 мм) + 15% апиезона Ь. Концентрирование проводили при комнатной температуре (20—25°С).
Исследуемый воздух или воздушный выброс (0,1—2,0 л) отбирали со скоростью 0,1—0,2 л/мин с помощью аспиратора.
Термодесорбцию сконцентрированных алкилбензоатов осуществляли в испарителе хроматографа «Хром-5» (можно и в хроматографах серии «Цвет» 100 и 500) нагреванием до 250—270 °С. Фор-колонку вводили сверху в испаритель хроматографа через мембрану (обычная резиновая прокладка из силиконовой резины для ввода проб с отверстием, укрепленная в верхней части испарителя накидной гайкой). Перед анализом фор-колонку устанавливали в верхней части испарителя и пропускали газ-носитель (расход 5—10 мл/мин) снизу вверх в течение 1 мин. Затем полностью вводили фор-колонку в испаритель хроматографа, прекращая подачу газа, нагревали ее в течение 60 с, подавали газ-носитель сверху вниз для ввода анализируемых веществ в хромато-графическую колонку со скоростью 60—70 мл/мин. Наиболее воспроизводимые результаты на фор-колонке, заполненной насадками, были получены на хроматоне Ы-АШ—ОМСБ (фракция 0,250,0—0,315 мм) с 5 % БЕ-ЗО. Скорость аспирации
0,1 л/мин, время отбора 10 мин. Степень поглощения алкилбензоатов 97—99,5 %, извлечения термодесорбцией — 94,7—97,6 %, что соответствует требованиям санитарно-хими-ческого анализа [5, 9].
Концентрацию сложных эфиров бензойной кислоты в воздухе при отборе в фор-колонки рассчитывали по формуле
^ > V
где С — концентрация алкилбензоата, мг/м'3, а — количество определяемого вещества, найденное по калибровочному графику, мкг; V — объем воздуха, пропущенного через концентрационную трубку, л.
При определении алкилбензоатов в воздухе отбор проводили также и в жидкостные поглотители с пористой стеклянной пластинкой со скоростью 0,5—1,0 л/мин в течение 10—20 мин в зависимости от ожидаемой концентрации сложного эфира. Минимально детектируемое количество алкилбензоатов 3—6 нг., При отборе пробы (1 л) в фор-колонки чувствительность определения в воздухе МБ 3 мкг/м3, ЭБ 4 мкг/м3, ПБ 5 мкг/м , ИПБ 4 мкг/м3, ББ 6 мкг/м3, ИББ 5 мкг/м3, АБ 6 мкг/м3, ИАБ 5 мкг/м3. Длительность анализа 20—30 мин. Погрешность определения ±10—12%. При отборе в жидкостные поглотители для повышения чувствительности определения АБ и ИАБ пробы упаривали на водяной бане при температуре не выше 40 °С до еще надежно измеряемого объема (порядка 0,2—0,5 мл) [2, 3, 5).
В испаритель хроматографа вводили 1—2 мкл. Чувствительность определения АБ и ИАБ при отборе 20 л воздуха 30 и 25 мкг/м3 соответственно. Количественное определение осуществляли методом абсолютной калибровки, используя серию стандартных растворов. Концентрацию алкилбензоатов в воздухе и воздушных выбросах рассчитывали по формуле
a-F
где С — концентрация алкилбензоата, мг/м3, а — количество вещества, найденное по калибровочному графику, мкг; b — объем хроматографируемой пробы, мл; F — объем поглотительного раствора без упарки или после, мл; v — объем воздуха или воздушного выброса, отобранного для анализа, л.
Разработанный метод широко использован в гигиенических исследованиях для определения сложных эфиров бензойной кислоты в воздухе и воздушных выбросах предприятий химической промышленности.
Литература
1. Горская Т. В., Ярым-Агаева И. Т. // Журн. аналит. химии.— 1965.— № 6.— С. 83.
2. Дмитриев М. Т., Китросский И. А. // Там же.— 1968.— № 7.— С. 1079.
3. Дмитриев М. Т., Мищихин В. А. // Гиг. и сан.— 1978.— № 5.— С. 59.
4. Дмитриев М. Т., Комракова Е. А., Тихомиров Ю. П. // Там же.— 1984.— № П.— С. 59.
5. Дмитриев М. Т., Комракова Е. А. // Там же.— 1986.— № 12.— С. 44.
6. Качмар Е. Г., Пинигина И. А. // Там же.— 1969.— № 8.— С. 74.
7. Коренман И. М. Фотометрический анализ.— М., 1970.
8. Кузьмичева М. Н. // Гиг. труда.— 1961.— № 5.— С. 58.
9. Перегуд Е. А., Гернет Е. В. Химический анализ воздуха промышленных предприятий.— Л., 1970.
10. Сборник методик по определению концентраций загрязняющих веществ в промышленных выбросах.— М., 1984.— Ч. 1.
11. Сборник отраслевых методик измерений концентраций загрязняющих веществ в промышленных выбросах.— М., 1985.— Ч. 2.
12. Actnan R. Q. // U. Chromatogr.— 1972.— Vol. 10.— Р. 560.
13. Geddes D. A., Jilmour M. N. // J. chromatogr. Sei.— 1970.— Vol. 8, N 7.— P. 394.
Поступила 01.02.89
В. С. БОГОРАД, М. Ю. AHTOMOHOB, 1990
УДК 614.7:615.9|-07:519.24
В. С. Богорад, М. Ю. Антомонов
ПРИМЕНЕНИЕ УГЛУБЛЕННОГО МАТЕМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ РАСЧЕТА ПОРОГОВЫХ УРОВНЕЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА МОДЕЛИ
ДОЗА — ВРЕМЯ — ЭФФЕКТ
ВНИИ гигиены и токсикологии, пестицидов, полимеров и пластических масс Минздрава СССР, Киев; Республиканский научный
гигиенический центр Минздрава УССР, Киев
В настоящее время в гигиене для описания исследуемых закономерностей все чаще применяется углубленный математический анализ, включающий построение достаточно сложных математических моделей зависимости биоэффектов от уровня и времени действия факторов. Зачастую эти модели используются для расчета тех или иных параметров токсичности, например ЬО50, порогов острого и хронического действия и т. д. [5, 10]. Точность этих расчетов в значительной степени определяется качеством исходной математической об-
работки, адекватностью модели, совершенством используемого математического аппарата. В немалой степени результат вычислений зависит и от выбора показателей, отражающих уровень функциональной активности организма и его систем [12]. Вместе с тем сложный характер ответных реакций организма на воздействие ксенобиотика требует возможно более полного их учета для установления минимальных, пороговых изменений. В этой связи целью настоящей работы явились разработка новых методических подходов к построению и анализу
Таблица 1
Изменение показателей состояния организма белых крыс при остром воздействии торнадо в зависимости от дозы и сроков
после воздействия
188,5 мг/кг 94,7 мг/кг 47,1 мк/кг
Показатель срок после воздействия, ч
1 24 72 168 1 24 72 168 1 24 72 168
СДА - - О О - - О О - О О О
СПП + + + О О + + О О О О О
ПЕР о О О + + О О О О О О О
АЛТ о О О О О + + О О О О
ACT о О О О О + О О О + О
АЛД + + О О О О О О О О О
ХОЛ о - О О О + + О О О
р-л - - - О О О О О О О О О
ОЛ - О О О + О + О О О + О
Примечани е.— достоверное снижение, -}- достоверное повышение, о — отсутствие достоверных изменений относительно контроля. Здесь и в табл. 2, 3: СДА — спонтанная двигательная активность, СПИ — суммационно-пороговый показатель, ПЕР — активность пероксидазы крови, АЛТ, АСТ — активность аналин- и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови, АЛД — активность альдолазы в сыворотке, ХОЛ — содержание холестерина в сыворотке крови, р-Л — содержание липидов в сыворотке, ОЛ — содержание общих липидов в сыворотке.
математических моделей зависимости доза — время — эффект для получения вероятностных характеристик порогов и проверка их при установлении порога острого действия гербицида торнадо.
Гербицид торнадо (фентиапроп-этил) относится к группе производных 2,4-Д [8]. По внешнему виду он представляет собой порошок коричневого цвета с характерным запахом, нерастворимый в воде и хорошо растворимый в ряде органических растворителей. Использованный нами технический продукт торнадо содержал 90 % действующего вещества.
Опыты проведены на 250 беспородных белых крысах-самках массой 180—200 г. Изучали 3 дозовых уровня воздействия: 188,5, 94,7 и 47,1 мг/кг, что соответствует 'Д, 1 /ю и '/20 LD50. Снятие показателей проводили через 1, 24, 72 и 168 ч после однократного внутри желудочного воздействия торнадо в виде раствора в растительном масле. Контрольной группе животных вводили чистый растворитель.
Всего было исследовано 32 показателя, характеризующих общетоксическое действие, функциональную активность печени, почек, органов кроветворения и др.
На первом этапе достоверность различий показателей опытной и контрольной групп оценивали методами вариационной статистики по критерию t Стьюдента. Выявленные при этом изменения свидетельствуют о том, что наиболее выраженные сдвиги происходили со стороны ряда биохимических показателей, отражающих нарушение функции печени-(активность аланин- и аспартатаминотрансферазы,альдолазы), липидного обмена (содержание общих липидов, ^-липидов и холестерина в сыворотке крови), а также со стороны ряда интегральных показателей (спонтанная двигательная активность, сумма-
ционно-пороговыи показатель, активность пероксидазы в крови). Выраженность этих изменений соответствовала действующей дозе и изменялась с течением времени. Вместе с тем характер их был неоднозначен. Так, если группа интегральных показателей изменялась на разных уровнях и в разные сроки однонаправленно — в сторону увеличения, то в это же время показатели остальных двух групп претерпевали значимые изменения как в сторону увеличения, так и в сторону снижения их средних значений (табл. 1). Более того, время наступления значимых изменений и сроки их нормализации для разных показателей не совпадали, а у некоторых из них (например, активность ферментов печени) достоверные различия с контролем появлялись только в конце периода наблюдения, когда остальные показатели приходили в норму.
Следовательно, острое воздействие торнадо как сложный фазовый процесс взаимодействия организма с данным соединением определило достаточно сложный характер последующей математической обработки.
В качестве выходной функции использовали статистические критерии различий опытной и контрольной групп по анализируемым показателям. Это позволило сопоставлять между собой различные показатели, объединять их в интегральные оценки, учитывать статистический характер исследуемых процессов, а также рассчитывать уровни, вызывающие тот или иной эффект, непосредственно по конструируемой модели. При этом важным моментом во всей процедуре получения расчетной величины порога по такой модели является выбор критерия пороговости действия. Поскольку используемые нами статистические критерии имеют определенный критический уровень (табличное значение), позволяющий
Таблица 2
Максимальные значения статистических критериев на разных уровнях воздействия торнадо
Доза, мг/кг Интегральные показатели Активность ферментов печени в сыворотке крови Содержание липидов в сыворотке крови
критерий t критерий F интегралы критерий t критерий F интегралы критерий / критерий F интегралы
СДА СПП ПЕР АЛТ ACT АЛД ОЛ р-л ХОЛ
188,5 4,74 3,02 4,84 7,81 14,75 4,21 3,33
2,04* 2,04 2,04 2,95* 6,56** 2,10 2,10
94,3 4,08 4,22 2,39 8,23 12,54 4,01 2,48
2,04 2,04 2,04 2,95 6,56 2,11 2,11
47.1 # 2,29 1,84 2,14 7,09 5,13 1,84 2,68
2,04 2,04 2,04 2,95 6,56 2,10 2,10
Примечание. Одной звездочкой отмечены табличные вычисленные по табличному значению И.
2,79 10,24 14,53 5,70 4,85 3,03 78,78 64,13
2,10 3,24 7,21 2,10 2,10 2,10 3,24 7,21
1,69 8,38 4,45 3,94 2,05 4,78 11,08 14,53
2,11 3,29 7,32 2,11 2,11 2,11 3,29 7,32
1,29 2,40 1,74 2,42 1,72 2,44 4,28 4,09
2,10 3,24 7,21 2,10 2,10 2,10 3,24 7,21
значения t и F, двумя — интегралы функций время — эффект,
Таблица 3
Величины порогов и их доверительные границы (в мг/кг), полученные для отдельных показателей и при объединении их по
группам
• Интегральные показатели Активность ферментов печени в сыворотке крови Содержание липидов крови в сыворотке
Показатель
СДА спп ПЕР критерий И интегралы АЛТ АСТ АЛД критерий Р интегралы О Л р-л хол критерий Р интегралы
Пороговая доза Нижняя граница порога 47,5 44,3 61,4 52,6 59,0 52,5 32,9 28,8 54,9 49,9 75,3 44,5 67,6 53,5 119,2 108,4 47,5 36,7 172,5 85,3 45,3 43,2 70,4 62,9 55,0 45,5 23,0 21,0 41,4 гг ч 31,4
Верхняя граница порога Величина ошибки модели, % 51,2 0,87 73,1 1,84 67,0 1,41 38,1 1,84 60,8 1,15 173,4 7,06 89,3 2,87 131,9 1,0 53,0 2,28 685,8 10,25 47,5 0,59 79,6 1,30 68,5 2,36 25,5 1,64 60,2 4,63
разграничить достоверные и недостоверные эффекты с позиций статистики, то целесообразно применять его для нахождения порога, имея в виду, что, по определению И. В. Саноц-кого [7], пороговые изменения в значительной части случаев можно зарегистрировать именно как минимальные статистически значимые. Поэтому под порогом действия химического соединения на организм будем понимать такие величины эффекта, которые являются статистически достоверными при выбранном уровне значимости.
Удобным представлением выходной функции, помимо статистических критериев, служат величины достоверности различий р, поскольку они нормированы в диапазоне от О до 1 [2, 5]. В наших исследованиях, однако, в некоторых случаях получение значений р и аппроксимация экспериментальных точек были сопряжены с рядом трудностей. Так, например, высокой степени различий отдельных сравниваемых групп соответствовали такие значения критериев, которые выходили далеко за рамки табличных (табл. 2). Результатом явилось то, что достоверность различий нередко оказывалась близкой к абсолютной (р-+1) и сложность ее расчета не оправдывала себя из-за сравнительно больших ошибок модели. Поэтому, для того чтобы получить нормированную величину зависимой переменной, мы использовали следующее преобразование найденных величин критериев:
— табл/20^выч)>
выч
(1)
где Ктабл — табличное значение критерия; /Свыч — расчетное его значение; у — нормированная величина зависимой переменной.
Из формулы (1) видно, что пороговому уровню, когда /СВЬ1Ч=/(табл, всегда соответствует величина у, равная 0,95, при этом уровень значимости определяется выбором величи-ны Ктгбл.
Наличие удобного выражения зависимой переменной позволяет перейти непосредственно к выбору формы математической модели.
Исходя из принципов адекватности математической модели и ее минимальной сложности, в качестве аппроксимирующей функции была выбрана экспонента следующего вида:
У=Усо(1-еа(х-Хо)),
(2)
где у — зависимая переменная; у— нормировочный коэффициент; х—уровень, воздействия; х0—значение действующего фактора при величине Эффекта, равном нулю; а — параметр модели.
В зависимости от характера эмпирической зависимости мы использовали различные модификации формулы (2), в которых х0 могло быть приравнено к нулю, а у^ — к единице.
Для полноценного описания наблюдаемых закономерностей при построении модели доза — эффект необходимо учитывать изменения выходной функции во времени с применением нескольких способов. При одном из них учитываются некоторые определенные характеристики биопроцесса, зависимые от времени, например положение и величина максимума функ-
ции. Другой способ предусматривает расчет таких обобщающих показателей, как интегралы функции во времени за весь период наблюдения [15]. Оба приведенных способа использованы нами для вычисления величин порогов.
Первоначально построение моделей производили по максимальным значениям функций. По исходным данным, приведенным в табл. 2, были построены модели доза — эффект, рассчитаны их параметры и для каждого из полученных показателей вычислены пороги острого действия по формуле:
л:
пор
1
а
и
1
У
У
оо
Результаты расчетов, приведенные в табл. 3, показывают, что величины этих порогов и их границы (а'ПО[)±5) не совпадают между собой. В этой ситуации за величину порога острого действия можно принять ту из доз, которая вызывает минимально значимые изменения наиболее чувствительного показателя, т. е. наименьшую величину порога. Для торнадо эта доза составила 45,3 мг/кг; при воздействии ее наблюдается изменение содержания общих липидов в сыворотке крови.
Но такой подход в полной мере может быть оправдан только тогда, когда наиболее чувствительный показатель выбран с учетом механизма действия ксенобиотика, как в случае с фосфорорганическими соединениями, избирательно инги-бирующими холинэстеразу [3]. В тех же случаях, когда конкретный механизм биотрансформации и токсического действия ксенобиотика неизвестен, как и в рассматриваемом примере с торнадо, это может привести к получению искаженной оценки величины порога, так как показатели в этих условиях выбирают в значительной степени случайно.
В этой связи для более объективной оценки состояния организма некоторыми авторами [4—6, 9] было предложено использовать различные интегральные характеристики, отражающие изменения в целом ряде органов и систем. Одной из таких характеристик является, в частности, расстояние О2 Махаланобиса [1, 5, 14]. В нашей работе с этой целью применен один из методов дискриминантного анализа, позволяющий производить построение дискриминантной функции с объединением ряда показателей, расчетом критерия Т7 Фишера для объединенных групп и на этой основе получать аналогичным образом обобщенную оценку эффекта [11].
Некоторые исследователи [5] предлагают объединять одним из описанных выше способов показатели, которые в минимальной степени зависимы друг от друга. При этом в одну группу неизбежно попадут показатели, как отражающие общетоксические изменения, так и характеризующие избирательность действия вещества. Очевидно, что чувствительность таких показателей будет различна, как различны будут и величины порогов. Следовательно, объединение этих показателей приведет к заведомому огрублению величины порога, а раздельная их оценка, напротив, позволит выявить избирательность действия [4, 13].
Руководствуясь приведенными соображениями, мы рассчи-
тывали пороги раздельно по группам показателей общетоксического и избирательного действия.
Используя данные табл. 2, где указаны критерии У7 для обобщенных групп, взятые по максимальным значениям функции, мы построили модели и рассчитали соответствующие пороги, представленные в табл. 3.
Сравнивая полученные величины порогов, можно прийти к выводу, что наиболее чувствительной к воздействию торнадо является группа показателей, характеризующих липидный обмен, для которых пороговые изменения, согласно расчету, должны наблюдаться уже при воздействии дозы 23 мг/кг. При этом можно отметить, что величина порога, рассчитанная с объединением показателей в группу, значительно ниже, чем по каждому из них.
С целью экспериментальной проверки полученного расчетного значения порога был поставлен дополнительный опыт, в котором животных подвергли однократному внутрижелудоч-ному воздействию торнадо в дозе 23 мг/кг. Обработка полученных результатов показала, что этот уровень воздействия приводит к появлению минимально значимых изменений со стороны показателей липидного обмена.
Во втором случае для построения модели мы использовали интегралы функций во времени, полученные на основе критериев Т7 для объединенных групп показателей. При этом в качестве зависимой переменной мы принимали величину у, в которой /Свыч представлял собой площадь кривой, образованной величинами критериев Т7 в разные сроки после воздействия одной и той же дозы, а Ктабл — площадь прямоугольника, одной из сторон которого служила прямая, проведенная параллельно оси абсцисс на уровне табличного значения критерия.
Рассчитанные по этим данным величины порогов позволяют установить, что и в этом случае наиболее низкий пороговый уровень (41 мг/кг) наблюдается в группе показателей липидного обмена (см. табл. 3).
Изученный в этом же эксперименте близкий к расчетному дозовый уровень 47,1 мг/кг, как это видно из рисунка, можно считать пороговым, что, таким образом, свидетельствует о правильности расчетной величины.
При сравнении величин порогов, полученных двумя способами, заметно почти двукратное превышение второго над первым (23 и 41 мг/кг). Очевидно, что учет фактора времени внес в величину порога определенные коррективы, и большее его значение можно объяснить, по-видимому, проявлением с течением времени действия компенсаторных процессов. Последний способ расчета представляется наиболее целесообразным для обработки результатов изучения хронического воздействия соединений, поскольку именно в этих условиях
1
24
72 168
Изменение величины критерия Т7 для показателей липидного обмена (суммарно) в зависимости от действующей дозы и
времени регистрации.
наблюдается многократная смена процессов компенсации и декомпенсации, и оценка порогового уровня представляет наибольшие трудности. Вместе с тем отсутствие достаточного фактического материала не позволяет провести в этом направлении более глубокий анализ, что требует осторожности при окончательных выводах.
Исходя из вышеизложенного, за величину порога острого действия торнадо можно принять 23 мг/кг по показателям липидного обмена как наиболее низкую из двух расчетных величин.
Таким образом, методику расчета пороговых величин можно представить в виде последовательности следующих операций: 1) первичная статистическая обработка экспериментальных данных методами вариационной статистики с расчетом критерия / Стыодента, направленная на выявление статистически значимых показателей; 2) конструирование выходной функции биопроцесса, в частности с объединением отдельных показателей в группы методами многомерного и дискриминантного анализа; 3) исследование динамики процесса и включение временного параметра в выходную функцию; 4) выбор на данном этапе наиболее оптимальной математической модели на основе оценки соответствия экспериментальных и теоретических величин выходной функции, рассчитанных по формуле (2), где параметры х0 и у^ поочередно приравниваются соответственно к нулю и единице. Выбирается та из моделей, которая имеет наименьшую величину относительной ошибки; 5) расчет пороговых уровней и диапазонов их изменения; б) анализ результатов и принятие решения о величине порога.
Подводя итог, можно утверждать, что предполагаемые подходы дают возможность с большой эффективностью производить расчет пороговых уровней воздействия химических веществ на организм. При этом достигается более полное использование фактического материала, расчетная величина порога приобретает вероятностный смысл, сокращается объем экспериментальных работ и появляется возможность более надежно оценить избирательность действия изучаемого соединения. Проверка предлагаемых подходов на экспериментальных данных по изучению острой токсичности гербицида торнадо позволяет сделать вывод о возможности использования их для целей гигиенического нормирования.
Литература
1. 2.
3.
4.
5.
6.
7.
8'.
9. 10. И.
12.
По оси абсцисс — логарифм времени регистрации (в ч); по оси ординат — критерий /=*: / —'/5 ЬЭ50; 2 — '/,<> Ю50; 3— '/20 ЬО50; 4-
значение /\
13.
14.
15.
критическое
Айвазян С. А., Енюков И. СМешалкин Л. Д. Прикладная статистика.— М., 1983.
Антомонов М. Ю., Русакова Л. Т. // Гиг. и сан.— 1988.— № 6.— С. 42—44.
Каган Ю. С. Токсикология фосфорорганических пестицидов.—М., 1977.
Ковязин В. Г. Ц Гиг. и сан.— 1987.— № 12.— С. 50—52. Копанев В. А., Гинзбург Э. X., Семенова В. И. Метод вероятностной оценки токсичности.— Новосибирск, 1988. Красовский Г. И., Сильвестров А. Е., Жолдакова 3. И., Михайловский Н. #. // Гиг. и сан.— 1987.— № 4.— С. 57—59.
Саноцкий И. В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ.— М., 1970. Мельников И. Н. Пестициды: Химия, технология и применение.— М., 1987.
Минченко В. А. // Гиг. и сан.— 1984.— № 8.— С. 52—55. Новиков С. М. // Там же.— С. 65—68. Сепетлиев Д. Статистические методы в научных медицинских исследованиях: Пер. с болг.— М., 1968. Трахтенберг И. М., Тимофиевская Л. Ф. Методы изучения хронического действия химических и биологических загрязнителей.— Рига, 1987.
Трахтенберг И. М., Копанев В. А. // Гиг. и сан.— 1988.— № 9.— С. 53—56.
Фролова А. Д., Дворкин Э. А., Лисман М. Б. // Там же.— 1987.—№ 2.— С. 67—69. '
Шандала М. Г., Антомонов М. Ю. // Там же.— 1988.— № 12.—С. 10—13.
Поступила 31.08.89
