CC BY
27
ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 619:618.7:616.084:636.2
Применение УФ-спектрофотометрии для количественного определения фуразолидона в маточном содержимом коров
Бледных Лариса Валентиновна, кандидат вет. наук, ст. преподаватель ФГБОУ ВПО Вятская ГСХА, г. Киров, Россия
E-mail: e600mc@gmail.com
Объект исследований - новая лекарственная форма - антисептическая губка с фуразолидоном. Ее вводили однократно внутриматочно коровам для профилактики послеродового эндометрита после самопроизвольного и оперативного отделения последа. Антисептическая губка представляет собой сухую пористую массу желтого цвета в виде пластины размером 30х10х2 см. В качестве основы содержит желатин пищевой, в качестве антимикробного компонента при изготовлении губки использовали фуразолидон. К нему предварительно определяли чувствительность микроорганизмов, выделенных из экссудата больных острым эндометритом коров: гемолитической E.coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и гемолитических дипло- и стрептококков. Цель исследований - установить у антисептической губки пролонгированное действие с использованием метода УФ-спектрофотометрии. В течение 14 дней после введения губки из цервикального канала брали пробы содержимого матки. Проводили количественный анализ фуразолидона в пробах спектрофотометрическим методом. Бактерицидная концентрация антисептика сохранялась на протяжении 7 дней. Она составила от 125,4 до 134,3 мкг/мл. Снижение концентрации отмечалось с 8-го по 10-й день - с 26,4 до 3,4 мкг/мл, на 11-й день фуразолидона в пробах не обнаружено. Параллельно на другой группе коров проводили опыт с использованием фуразолидоновых суппозиториев. Их вводили однократно внутриматочно сразу после отделения последа также с профилактической целью. Концентрация нитрофурана через 4 часа после введения препарата составила 121,2 мкг/мл, на второй день она снизилась до 53,4 мкг/мл, на третьи сутки - до 28,7 мкг/мл. На четвертый день фуразолидон в пробах не обнаружен. Таким образом, антисептическая губка по сравнению с фуразолидоновыми палочками обладает пролонгированным действием и, следовательно, обеспечивает рациональный подход в профилактике и лечении воспалительных заболеваний матки коров.
Ключевые слова: антисептическая губка, спектрофотометрия, количественный анализ, пролонгированное действие
Кратность применения внутриматоч-ных этиотропных средств при акушерско-гинекологической патологии у самок с целью профилактики или терапии имеет большое значение для достижения максимальной эффективности проводимых мероприятий. Она определяется продолжительностью действия фармакологически активных веществ в полости репродуктивных органов после введения препарата. Изучение фармакокине-тики лекарственных веществ занимает главное место при установлении оптимальных схем их применения.
Использование спектрофотометрии дает возможность проводить количественный анализ лекарственных веществ не только на всех этапах фармацевтического производства, но и устанавливать их содержание в биологических объектах. Главным преимуществом спектрофотометрии, как наиболее простого и широко применяемого в фарма-
ции абсорбционного метода, является то, что предельные концентрации обнаруживаемых веществ значительно меньше, чем при применении, например, химических методов. Этим и объясняется высокая чувствительность методик. В основе анализа лежит использование монохроматических излучений, что позволяет получать наиболее точные и достоверные результаты, повышает селективность методик, дает возможность проводить измерения в присутствии посторонних веществ, поглощающих свет в областях спектра, близких к максимуму поглощения определяемого компонента.
Цель исследований - установление у антисептической губки пролонгированного действия с помощью УФ-спектрофотометрии.
Материал и методы. Объектом исследований была антисептическая губка с фуразолидоном, которую впервые применили для профилактики послеродового эндо-
метрита у коров в случаях самопроизвольного и оперативного отделения последа [1]. Вводили ее коровам однократно внутрима-точно в первые часы после отела.
Антисептическая губка представляет собой сухую пористую массу желтого цвета в виде пластины размером 30х10х2 см. В качестве основы содержит желатин пищевой.
При выборе антимикробного компонента при изготовлении губки учитывали чувствительность к нему микроорганизмов, а также ряд его положительных свойств. Фуразолидон обладает низкой водораство-римостью, а, следовательно, слабой резорбцией, что важно при лечении местного воспалительного процесса. Нитрофураны имеют более узкий спектр побочных действий, и к ним медленнее развивается устойчивость микроорганизмов.
На первом этапе эксперимента определяли антимикробную активность фуразоли-дона к микроорганизмам, выделенным из экссудата больных острым эндометритом коров: гемолитической E.coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и гемолитических дипло- и стрептококков.
На каждый микроорганизм готовили 10 стерильных пробирок, куда вносили рабочие растворы фуразолидона в убывающей концентрации (от 100 до 0,2 мкг/мл), приготовленные из основного раствора фуразоли-дона (10 мг/мл) и мясопептонного бульона (МПБ) [2]. В приготовленные ряды пробирок серийных разведений фуразолидона вносили суточные бульонные культуры испытуемых микроорганизмов в объеме 0,5 мл. Пробирки тщательно встряхивали, выдерживали в термостате в течение 24 часов при температуре 37°С, учитывали рост микроорганизмов по изменению МПБ. На основании этого определяли бактериостатическую концентрацию фуразолидона, которая была в тех пробирках, где при наименьшем разведении не обнаруживали изменения МПБ.
Для определения бактерицидной концентрации делали посевы на мясопептонный агар в чашках Петри из пробирки, в которой был установлен рост изучаемых микроорганизмов в МПБ, и двух предыдущих, в которых роста не отмечали. Чашки с посевами выдерживали в термостате при температуре 37°С
в течение 24 часов и учитывали рост микрофлоры. Бактерицидной считали ту концентрацию препарата, при которой не установлен рост микробов на агаровой среде в чашках Петри на протяжении не менее 72 часов.
На втором этапе научных исследований определяли период освобождения ак-тивнодействующего вещества из носителя и, следовательно, продолжительность рассасывания антисептической губки в полости матки. Для этого проводили спектрофотометри-ческий мониторинг концентрации фуразо-лидона в маточных выделениях после однократного внутриматочного введения препарата. В качестве контроля использовали фу-разолидоновые суппозитории.
Для проведения эксперимента по принципу аналогов сформировали две группы коров черно-пестрой породы - опытную (п = 5) и контрольную (п = 5). Коровам опытной группы после оперативного отделения последа однократно внутриматочно вводили антисептическую губку, а коровам контрольной группы - пять фуразолидоно-вых палочек также однократно. Ежедневно из цервикального канала брали пробы содержимого матки в количестве 5,0 мл: первый раз - спустя 4 часа после введения препаратов, а затем на протяжении последующих 14 дней послеродового периода. Пробы замораживали при температуре -18оС и в дальнейшем все исследования осуществляли при постоянной низкой температуре, используя охлажденные реактивы [3, 4].
Количественный анализ проводили по методике определения концентрации нитро-фуранов в органах и тканях по Бузарду в модификации Сонина [3]. Данная методика основана на химическом превращении 5-нитрофурановых производных в 5-нитро-2-фурфулиден-фенилгидразоны путем обменной реакции с хлористоводородным фенил-гидразином при нагревании субстрата до 75°С в течение 30 минут. Полученный компонент экстрагировали толуолом и спектро-фотометрировали в УФ области при длине волны 310 нм [4].
В основе спектрофотометрического анализа лежит сравнение оптических плотностей исследуемого и стандартного растворов. С этой целью готовили ряд рабочих
стандартных образцов фуразолидона в десяти пробирках в концентрациях предполагаемого диапазона от 0,2 до 100 мкг/мл.
Методика приготовления рабочих стандартных образцов состояла в следующем. Сначала готовили ряд серийных разведений фуразолидона на дистиллированной воде с использованием диметилсульфокси-да. После чего каждое разведение соединяли с комплексом реагентов, используемых в методике, нагревали при температуре 75оС в течение 30 минут, экстрагировали толуо-
лом и определяли оптическую плотность толуоловых экстрактов.
Результаты спектрофотометрии стандартных образцов представлены в таблице 1 , по данным которой строили калибровочный график (рис. 1). Количественное содержание фуразолидона в пробах маточного содержимого определяли по формуле: Х = А х 10, где А - содержание препарата в пробе, найденное по калибровочному графику (мкг/мл); 10 - разведение проб тканей и органов.
Таблица 1
Концентрация фуразолидона и оптическая плотность рабочих стандартных образцов
Показатели № пробирки
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Концентрация, мкг/мл 100 50 25 12,5 6,25 3,13 1,5 0,75 0,38 0,2
Оптическая плотность, усл. ед. 1,533 1,045 0,661 0,452 0,392 0,343 0,284 0,254 0,246 0,222
1,8 -| 1,6 -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0
0 20 40 60 80
концентрация, мкг/мл
100
120
Рис. 1. Калибровочная кривая зависимости оптической плотности от концентрации фуразолидона при серийных разведениях
Результаты и их обсуждение.
Антимикробная активность фуразолидона показана в таблице 2. Результаты анализа концентрации фуразолидона в пробах маточного содержимого после введения губки и фуразолидоновых палочек представлены на рисунке 2. После введения антисептической губки средняя концентрация фуразоли-дона в пробах маточного содержимого с 1-го по 7-й дни после отела была приблизительно одинакова и находилась в пределах от 125,4±2,61 до 134,3±2,17 мкг/мл. Начиная с 8-го дня, концентрация резко снизилась до 26,4±2,8 мкг/мл, на 9-й день она со-
ставила 11,9±1,92 мкг/мл, а на 10-й день послеродового периода - 3,4±1,06 мкг/мл. На 11 -й день следов производного нитро-фурана в пробах не обнаружено.
Анализ содержания фуразолидона в пробах, взятых после применения фуразо-лидоновых палочек, показал, что средняя концентрация нитрофурана спустя 4 часа после введения препарата составила 121,2±2,42 мкг/мл, на второй день она снизилась до 53,4±1,73 мкг/мл, а на третьи сутки -до 28,7±0,50 мкг/мл. На четвертый день фура-золидон в пробах не был обнаружен.
Таблица 2
Антимикробная активность фуразолидона к микроорганизмам, выделенным из содержимого матки коров при эндометрите
Микроорганизмы Антимикробная активность, мкг/мл
бактериостатическая бактерицидная
E.coli 6,25 12,5
Staphylococcus aureus 0,38 0,38
Streptococcus hаemolyticus 12,5 25,0
Proteus vulgaris 100,0 100,0
антисептическая губка;---
фуразодидоновые палочки
Рис. 2. Динамика концентрации фуразолидона в маточных выделениях при однократном введении антисептической губки и фуразолидоновых палочек
Выводы. На основании проведенных исследований можно сделать заключение о том, что предложенная нами лекарственная форма способствует сохранению бактерицидных концентраций фуразолидона в полости матки в течение 7-ми дней, а, значит, обладает пролонгированным действием. Это объясняется тем, что в результате набухания желатина во влажной среде и сужения канала шейки матки затрудняется преждевременная эвакуация губки из полости матки, а постепенное освобождение лекарственного вещества обеспечивает более полный контакт его с эндометрием.
Применение лекарственных средств с пролонгированным действием создает рациональный подход в профилактике и лечении воспалительных заболеваний матки коров, и исключает риск случайного инфицирования и травматизации родовых путей, который может возникать при повторных внутриматочных введениях препаратов [5,
6]. Кроме того, стабильная концентрация антисептика в полости матки и влагалища длительное время препятствует размножению микроорганизмов, что является одним из благоприятных условий для регенерации поврежденных тканей матки.
Список литературы
1. Конопельцев И.Г., Бледных Л.В. Антисептическая, гемостатическая губка для профилактики эндометрита у коров // Ветеринария. 2011. №2. С.45-48.
2. Слободяник В.И. Производные 5-нит-рофурана в ветеринарии. Учебно-методическое пособие. Воронеж, 2004. 55 с.
3. Сонин Б.В. Всасывание, распределение, биотрансформация и выделение производных 5-нитрофурана в животном организме // Фармакология и токсикология. 1968. № 1. С. 116-120.
4. Берлянд А.С., Книжник А.З., Федоров В.А., Утлинская М.Г., Куперман А.В. Количественное определение фурагина в биологиче-
ских жидкостях // Фармакология и токсиколо- 6. Ветра Я.А., Дубинский Е.А., Шус-
гия. 1977. №3. С. 349-350. тер Я.Я. Пролонгация действия лекарственных
5. Гавриш В.Г., Родин В.П. Гистерофур веществ // Ветеринария. 1981. № 1. С. 71-72. для лечения при эндометрите коров // Ветеринария. 1996. №5. С. 40-43.
Use of UV-spectrophotometry for the quantitative determination of furazolidone in uterine contents of cows
Blednikh L.V., PhD, Senior teacher
Vyatka State Agricultural Academy, Kirov, Russia
The object of our research - a new medicinal form - the antiseptic sponge with furazolidone. It was administered once intrauterine in cows for the prophylaxis of the postnatal endometritis after spontaneous or surgical separation of placenta. Antiseptic sponge is a dry porous mass of yellow in the form of plates in the size 30 x 10 x 2 cm. As the basis it contains food gelatin. Furazolidone is used as antimicrobial component in the manufacture of sponges. Sensitivity of microorganisms allocated from the exudate of patient cows with acute endometritis was pre-determined: hemolytic E.coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, and hemolytic Diplo - and Streptococcus spp. The aim of the research is to establish the antiseptic sponge's prolonged effect using the method of UV-spectrophotometry. Samples of lochia were taking from the cervical canal within 14 days after the introduction of the sponge. a quantitative analysis of furazolidone was conducted in samples eith spectrophotometry method. Bactericidal concentrations of antiseptics was kept for 7 days. It was from 134.3 to 125.4 mcg/ml. Lower concentrations were observed from 8 to 10 day from 26.4 to 3.4 mcg/ml. On the 11-th day furazolidone is not detected in the samples. In parallel in another group of cows experience using furazolidone suppositories was conducted. They were introduced once intrauterine immediately after separation of the placenta as a preventive measure. The concentration of nitrofuran 4 hours after the drug introducing was 121.2 mcg/ml. On the second day it fell to 53.4 mcg/ml, on the third day - to 28.7 mcg/ml. On the fourth day furazolidone was not detected in the samples. The antiseptic sponge compared to furazolidone suppositories has a prolonged effect and provides a rational approach in the prevention and treatment of inflammatory diseases in the uterus cows.
Key words: antiseptic sponge, spectrophotometry, quantitative analysis, prolonged action
References
1. Konopel'cev I.G., Blednykh L.V.
Antisepticheskaya, gemostaticheskaya gubka dlya profilaktiki endometrita u korov. [The antiseptic, hemostatic sponge for the prophylaxis of the postnatal endometritis cows]. Veterinariya. 2011. no. 2. pp. 45-48.
2. Slobodyanik V.I. Proizvodnye 5-nitrofu-rana v veterinarii. [Derivative 5-nitrofurana in veterinary medicine]. Methodical manual, Voronezh, 2004.55 p.
3. Sonin B.V. Vsasyvanie, raspredelenie, biotransformaciya i vydelenie proizvodnykh 5-nitrofurana v zhivotnom organizme. [The absorption, distribution, biotransformation and the allocation of the derivatives of 5-nitrofuran in the an-
imal organism]. Farmakologiya i toksikologiya. 1968. no. 1. pp.116-120.
4. Berlyand A.S., Knizhnik A.Z., Fedorov V.A., Utlinskaya M.G., Kuperman A.V. Koli-chestvennoe opredelenie furagina v biologi-cheskikh zhidkostyakh. [Quantitative determination furagin in biological fluids]. Farmakologiya i toksikologiya. 1977. no. 3. pp. 349-350.
5. Gavrish V.G., Rodin V.P. Gisterofur dlya lecheniya pri endometrite korov. [Gisterofur for treatment of endometritis cows]. Veterinariya. 1996. no. 5. pp. 40-43.
6. Vetra Ya.A., Dubinskij E.A., Shuster Ya.Ya. Prolongaciya dejstviya lekarstvennykh veshhestv. [Prolongation of action of medicinal substances]. Veterinariya. 1981. no. 1. pp. 71-72.
