CC BY
30
УДК 619:612.017.1:616-006.446:636.22/.28
применение теста с нитросиним тетразолием для выявления животных с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции
A.И. ИВАНОВ, аспирант
B.C. ВЛАСЕНКО, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, Омск, 644001, Россия
E-mail: [email protected]
Резюме. В работе приводятся результаты, свидетельствующие о возможности применения теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) для выявления животных не только с явной инфекционной патологией, но и с предрасположенностью к лейкозной инфекции. В опыте исследовано 100 гол. крупного рогатого скота разных возрастных групп (молоднякдо 2-х мес, 5-6 мес., 12 мес., 17-18 мес. и коровы от 3-х до 5-и лет) из неблагополучного по лейкозу хозяйства. Низкие величины коэффициента стимуляции НСТ(от 0,95 и меньше), определяемого как соотношение между индуцированным и спонтанным вариантом, главный признак, отражающий истощение противоинфекционного потенциала нейтрофилов. Снижение коэффициента стимуляции НСТ-теста было выявлено у всех животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в возрасте 12 и 17-18 мес., а также у 86,9% коров. Исходно низкая величина этого показателя отмечена и у большинства РИД-отрицательных животных с 12-месячного возраста (от 57,1 до 73,7% в зависимости от возраста) из неблагополучного по лейкозу стада, что свидетельствовало об уменьшении резистентности и низкой микробицидной активности нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к лейкозной инфекции. Одновременно чрезмерное повышение образования активных форм кислорода у больныхлейкозом коров указывает на недостаточность антиоксидантной системы, что связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Ключевые слова: лейкоз, крупный рогатый скот, НСТ-тест, животные-вирусоносители.
Для цитирования:ИвановА.И., ВласенкоВ.С. Применение теста с нитросиним тетразолием для выявленияживотных с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. С. 61-62.
Одна из традиционных проблем высокопродуктивного молочного скотоводства - лейкоз крупного рогатого скота, который относится к болезням вирусно-опухолевой природы и проявляется в поражении кроветворных органов и лимфоидных клеток крови.
На сегодняшний день сложилось комплексное представление об иммунофагоцитарной системе периферической крови как о центральном исполнительном инструменте всего каскада антиинфекционного клиренса макроорганизма, при этом заключительные итоги фагоцитарного процесса определяют степень его неспецифической резистентности. Однако, несмотря на это, отсутствует целостная картина, характеризующая изменения компонентов неспецифической резистентности в течение и исходе патологических процессов, лежащих в основе вирусных заболеваний [1, 2].
Первую линию неспецифической противомикробной защиты, фоновое состояние которой во многом предопре-
Таблица 1. Значения коэффициентов стимуляции нитросинего тетразолия (кС нСТ) у инфицированных влкрС и рид-отрицательных животных разного возраста
Возраст
до 2-х мес. 5-6 мес. 12 мес. 17-18 мес. Коровы
РИД
РИД (-)
15
15 19
16 7
КС<0,95 I КС>1,11
1
14 11 4
15 13
4
5 3
РИД
1 4
23
' больная в гематологической стадии.
деляет развитие и исход любого инфекционного процесса, составляют нейтрофилы. Одна из наиболее важных их особенностей - генерация активных форм кислорода («респираторный взрыв»), от которых зависит эффективная внутриклеточная гибель микробов, поглощенных фагоцитами. Способность к генерации активных форм кислорода характеризует функциональную активность нейтрофилов, а именно возможность осуществления завершенного фагоцитоза. Информативный метод, отражающий итоговую реакцию этой ключевой ферментной системы, - тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) [3].
Цель исследований - изучить значимость показателей НСТ-теста in vitro для прогнозирования повышенного риска развития заболевания лейкозом крупного рогатого скота.
Условия, материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом ВНИИБТЖ.
Объект исследования - крупный рогатый скот черно-пестрой и симментальской породы разного возраста (до 2-х мес., 5-6 мес., 12 мес., 17-18 мес. и коровы от 3-х до 5-и лет).
Для выявления серопозитивных животных - носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) использовали реакцию иммунодиффузии (РИД), для выявления особей больных лейкозом - гематологический метод исследования. Лейкограмму выводили по результатам дифференцированного подсчета 100 клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой. Абсолютное количество лимфоидных элементов в 1 мкл крови определяли путем умножения количества лейкоцитов на общий процент лимфоцитов в лейкоцитарной формуле и деления полученного произведения на 100. Показатель абсолютного количества лимфоцитов оценивали по «лейкозному ключу» [4].
Функциональное состояние нейтрофилов оценивали в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ) фотометрическим методом [5], результаты реакции фиксировали с помощью иммунохимического анализатора «Fluorofot STD Less-486 -M» и выражали в условных единицах (у.е.) - единицах оптической плотности х1000. Оптическую плотность определяли по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, затем вычисляли коэффициент стимуляции (КС). КС определялся отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС<0,95 считали, что животное характеризуется повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.
Математическая обработка цифровых данных включала определение средней арифметической (М) и ошибки средней арифметической (m). Для оценки существенности различий между двумя средними величинами Мх и Му использовали t-критерий Стьюдента. Различие между контролем и опытом считали достоверным только для р<0,05.
результаты и обсуждение. У 15-и гол. молодняка крупного рогатого скота в возрасте до 2 мес., 15-и - в возрасте 5-6 мес., 20-и -12 мес., 20-и - 17-18 мес и
КС<0,95
РИД (+)
КС>1,11
1 4 20
1*
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4
61
Таблица 2. результаты оценки функционально-метаболической активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у молодняка 17-18-месячного возраста и коров, М±m
Группа животных
Молодняк
РИД-позитивные
РИД-отрицательные (КС<0,95)
РИД-отрицательные (КС>1,11)
Инфицированные ВЛКРС
РИД-отрицательные (КС<0,95)
РИД-отрицательные (КС>1,11)_
Спонтанный НСТ-тест, У*
Индуцированный Нст-тест, у.е.
в возрасте 17-18 мес.
191,75±42,32 17,50±8,88
р<0,001 р>0,05
141,27±31,10 11,45±1,40 р<0,01 р<0,05
10,40±1,80 Коровы
241,61±21,40
р<0,05 289,50±13,86 р<0,05
25,60±5,11
201,15±16,65
р>0,05 226,50±2,21 р>0,05
159,66±29,4 213,33±24,06
30-и коров в периферической крови определили функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте в спонтанном и индуцированном варианте и произвели подсчет коэффициента стимуляции, который рассматривается как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу (полному уничтожению объекта) и называется функциональным резервом.
Значения КС сопоставили с результатами диагностических исследований на лейкоз в реакции иммунной диффузии (РИД).
Среди РИД-отрицательных животных снижение резистентности и низкую микробицидную активность нейтрофилов (КС<0,95) наблюдали у 14-и из 19-и (73,7%) гол. молодняка крупного рогатого скота в возрасте 12 мес. и у 11-и из 16-и животных (68,75%) в 17-18-месячном возрасте (табл. 1). При этом у 100% животных этих же возрастных групп с положительной РИД также отмечен низкий коэффициент стимуляции.
У инфицированных ВЛКРС коров снижение коэффициента стимуляции ниже 0,95 отмечено у 20 из 23-и животных (86,9%), а превышение отметки 1,11 - у одной коровы больной лейкозом в гематологической стадии (КС=16,1), что указывало на недостаточность антиокси-дантной системы и, по нашему мнению, было связано с
развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Из 7-и РИД-отрицательных взрослых животных низкая микробицидная активность отмечена у 4-х (57,1%).
При сравнительном анализе изучаемых показателей у крупного рогатого скота с 12-месячного возраста и старше установлено, что у носителей ВЛКРС и у животных с повышенным риском развития заболеванием лейкозом (КС<0,95) наблюдается достоверное увеличение спонтанной активности нейтрофилов и уменьшение результатов индуцированного НСТ-теста, что свидетельствует о снижении функциональных резервов иммунитета.
Результаты оценки функционального состояния нейтрофилов в НСТ-тесте у молодняка 17-18-месячного возраста и коров, которых разделили на 3 группы: инфицированные ВЛКРС, с повышенным риском развития заболевания лейкозом крупного рогатого скота (КС<0,95) и здоровые животные (КС> 1,11), показали, что у носителей ВЛКРС, также как и у РИД-отрицательного крупного рогатого скота со сниженной микробицидной активностью нейтрофилов (КС<0,95) происходит усиление спонтанного уровня генерации кислородных радикалов в нейтрофильных гранулоцитах (табл. 2), по сравнению со здоровыми животными (КС>1,11). Такую реакцию, на наш взгляд, можно расценивать как защитно-приспособительный механизм возмещения дефекта бактерицидной функции клеток. При постановке НСТ в индуцированном варианте наблюдается снижение результатов, особенно у РИД-отрицательного молодняка в возрасте 17-18 мес. с КС ниже 0,95 (соответственно 11,45±1,40 и 25,60±5,11 у. е.; р<0,05).
выводы. У большинства коров с инфекцией, вызванной вирусом лейкоза крупного рогатого скота, нарушен синтез активных форм кислорода. У86,9-100,0% инфицированных ВЛКРС животных разного возраста выявлено уменьшение коэффициента стимуляции НСТ-теста, что свидетельствует о снижении резервной способности кислородзависимой бактерицидности нейтрофилов. В то же время чрезмерное повышение образования активных форм кислорода указывает на недостаточность антиоксидантной системы.
Низкие величины коэффициента стимуляции НСТ (от 0,95 и менее) у РИД-отрицательных животных свидетельствуют об истощении противоинфекционного потенциала нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.
Литература.
1. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань: Магариф, 1993. 192 с.
2. Saito M., Kiyokawa N., Taguchi T. et al. Granulocyte colony-stimulating factor directly affects human monocytes and modulates cytokine secretion //Exp. Hematol. 2002. Vol. 30. №10. P. 1115.
3. Нагоев Б.С., Камбачокова З.А. функционально-метаболическая активность нейтрофильных гранулоцитов у больных рецидивирующей герпетической инфекцией //Журнал инфектологии. 2011. Т. 3. №3. С. 38-41.
4. Методические указания по диагностике лейкоза крупного скота/Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. 2000. №13-7-2/2130.
5. Методы оценки функциональной активности лейкоцитов при туберкулезе и лейкозе животных: методическое пособие/В. С. Вла -сенко, Н.А. Донченко, Ю.И. Пацула, М.А. Бажин, А.И. Иванов, О.В. Морозова, Т.С. Дудоладова. Омск: ФГБНУВНИИБТЖ, 2015. 16с.
test with nitroblue tetrazolium administration for detection of animals with hypersusceptibility to the leucosis infection
A.I. Ivanov, V.S. Vlasenko
All-Russian Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals, Lermontov str., 93, Omsk, 644001, Russia Summary. In this paper there are presented the results of studies indicating the possibility of administration ofthe test with nitroblue tetrazolium (NBT-test) to identify animals not only with the explicit infectious pathologies, but also with a susceptibility to leukemic infection. In the experiment there were tested 100 head of cattle of different age (young animals up to 2 months, 5.. .6 months, 12 months, 17.. .18 months and cows at the age from 3 to 5 years) from problem in leucosis farm. Low value of the coefficient stimulation of NBT-test (0.95 and below), defined as the ratio between the induced and spontaneous variants, is the main feature reflecting the depletion of anti-infective potential of neutrophils. The reduction in the coefficient of stimulation of NBT-test was detected in all animals, infected with bovine leukemia virus at the age of 12 and 17.18 months, as well as in 86.9 % of cows. Initially low value of this index was observed in the majority of RID-negative animals since the age of 12 months (from 57.1 to 73.7 % depending on the age) from the problem herd, that testified the reducing resistance and low microbicidal activity of neutrophils and, as a consequence, the high sensitivity to leukemic infection. At the same time, the excessive increase in the formation of reactive oxygen intermediates in ill cows indicates the insufficiency of the antioxidant system, which is associated with the development of infectious and inflammatory complications. Keywords: leucosis, cattle, NBT test, animals-virus carriers.
Author Details: A.I. Ivanov, Post-graduate Student (e-mail: [email protected]); V.S. Vlasenko, Dr. Sc. (Biol.), Head of Laboratory For citation: Ivanov A.I., Vlasenko V.S. Test with nitroblue tetrazolium administration for detection of animals with hypersusceptibility to the leucosis infection. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 61-62 (In Russ)
62
Достижения науки и техники АПК. 2015. Т 29. № 4
