CC BY
38
ной системы молекулы анилина с поверхностными соединениями кислорода кислотного и основного типа соответственно. Наибольшее значение этих параметров характерно для АУ с наивысшим суммарным количеством кислотных и основных поверхностных групп (АБГ). Образование второго слоя при полимолекулярной адсорбции (согласно значению QS) может происходить за счет диполь - дипольного взаимодействия (например, слабой водородной связи).
Проведенные исследования показали, что в исследованной области концентраций наблюдается полимолекулярная адсорбция анилина, реализуемая за счет специфического взаимодействия сорбент - сорбат. Адсорбция анилина из разбавленных растворов наилучшим образом описывается моделью БЭТ.
Список литературы
1. Kipling J.J. Adsorption from solution of non-electrolytes. London: Academic Press, 1965. - 159 p.
2. Когановский А.М., Клименко Н.А. и др. Адсорбция органических веществ из воды. Л.: Химия, 1990. -256с.
3. Парфит Г., Рочестер К. Адсорбция из растворов на поверхностях твёрдых тел: пер. с англ. М.: Мир, 1986. - 488с.
4. Котова Д.Л., Фам Тхи Гам и др. Описание изотермы сорбции гидрохлорида пиридоксина на клинопти-лолитовом туфе. / Сорбционные и хроматографиче-ские процессы. 2014. Т. 14. Вып. 4. С. 572 - 577.
ПРИМЕНЕНИЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА К ОЦЕНКЕ АНТИОКСИ-ДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ И МАСЛЯНЫХ
ФИТОПРЕПАРАТОВ
Дадали Юрий Владимирович
Кандидат химических наук, доцент кафедры профилактической медицины и охраны здоровья, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
Дадали Владимир Абдулаевич
Доктор химических наук, профессор кафедры биологической и общей химии, Северо-Западный государственный
медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
АННОТАЦИЯ
Нами предложена спектрофотометрическая методика оценки антиоксидантной активности растительных масел и индивидуальных гидрофобных антиоксидантов. Методика основана на ингибировании окисления изопропилбен-зола (кумола) антиоксидантами, содержащимися в растительных маслах. Спектрофотометрическую регистрацию процесса окисления и ингибирования окисления кумола проводили с использованием спектрофотометрического индикатора N,N'-дифенил-п-фенилендиамина, превращающегося под действием свободных алкильных и пероксильныхрадикалов кумола в N,N-дифенил-п-бензохинондиимин (поглощение при 450 нм). Инициация свободных радикалов кумола осуществлялась в ходе термического разложения на радикалы инициатора азо-бис-изобутиронитрила (АИБН). Предложенный метод может быть использован для исследования и оценки антиоксидантной активности in vitro различных растительных масел и масляных фитопрепаратов.
Ключевые слова: спектрофотометрическая методика, ингибирование окисления, изопропилбензол, кумол, кинетические кривые, антиоксидантная активность, константы скорости реакций, растительные масла. ABSTRACT
We propose spectrophotometry method of determination of antioxidative activity of vegetable oils and individual hydrophobe antioxidants. Method is based on inhibition by the oils antioxidants of isopropylbenzene. Spectrophotometric registration have been performed by using indicator N,N'-diphenil-p-phenylendiamine transformation to N,N'-diphenil-p-benzochinonediimine (absorbtion of light by 450 nm) under influence offree alkyl and peroxy radicals of isopropylbenzene is generated by decomposition of azo-bis(isobutironitrile). This method may be used for the investigation and estimating antioxidative activity in vitro of different vegetable oils and oils complex drugs.
Keywords: spectrophotometry method, inhibition of oxidation, isopropylbenzene, cumene, kinetic curves, antioxidant activity, velocity constants of reactions, vegetable oils.
Введение. В связи с разработкой рядом фирм целой серии фитопрепаратов на масляной основе и их выходом на фармацевтический рынок в настоящее время возникает насущная необходимость в разработке экспрессных методов оценки антиоксидантной активности и их стандартизации. Наиболее используемой в подобных исследованиях является газометрическая методика [1-2], применение которой затруднительно из-за отсутствия выпуска специального стандартного оборудования. Поэтому, целью настоящего сообщения явилась разработка более доступной, спектрофотометрической методики оценки in vitro анти-оксидантной активности растительных масел для их стандартизации.
Цепная реакция свободно-радикального окисления кумола, обычно применяемая для изучения антиоксидант-ных свойств веществ в газометрической методике [1-2], может быть положена в основу оценки АОА неполярных гидрофобных антиоксидантов и растительных масел спек-трофотометрическим методом, если в качестве СФ-инди-катора использовать ловушку радикалов ^№-дифенил-п-фенилендиамин (ДФФД) [3]. Одна молекула ДФФД способна быстро восстанавливать два алкильных R• или пероксильных радикала кумола RO2•, окисляясь до дифенил-п-бензохинондиимина (ДФБХД) с максимумом поглощения при 450 нм [4].
Материалы и методы. Реакцию окисления кумола («1,84 моль/л) в смеси с олеиновой кислотой, взятой в концентрации 2,17 моль/л и объемном соотношении 2:1(ку-мол), инициировали в стеклянной нестандартной 2 мм термостатируемой кювете с помощью азо-бис(изобутиро-нитрила) (АИБН) концентрацией «190 ммоль/л при температуре (60,0+0,2)° С. Концентрация индикатора ДФФД, достаточная для проведения реакции, составляла 2,7 ммоль/л. В качестве раствора сравнения был взят исходный раствор ДФФД и антиоксиданта в кумоле без АИБН. О скорости окисления судили по возрастанию концентрации ДФБХД в реакционном растворе. Регистрацию кинетических кривых накопления ДФБХД осуществляли на
двулучевом спектрофотометре '^ресоМ М-40" в автоматическом режиме при 450 нм.
Результаты и их обсуждение. Схема модельной реакции окисления кумола в присутствии ДФФД без анти-оксидантов представлена на рис. 1, где в качестве алкиль-ных радикалов R• и пероксильных RO2• выступают радикалы собственно кумола. Лимитирующей стадией всего процесса окисления является наиболее медленная стадия с константой скорости образования пероксильных радикалов к1 [1].
2 —
Рис. 1 Схема модельной реакции окисления кумола в отсутствие антиоксидантов.
Как можно было ожидать, кривые накопления ДФБХД в реакциях окисления кумола в отсутствие анти-оксидантов не имеют особенностей, характерных для ин-гибированного окисления [3]. В то же время, кривые накопления ДФБХД в присутствии антиоксидантов, например, аскорбилпальмитата, кверцетина и др., имеют характерные для ингибированного окисления особенности - индукционный период и/или более низкие скорости окисления (Рис. 2) [3].
Для оценки антиоксидантной активности растительных масел, в систему с кумолом вводилось масло в объемном соотношении 2 (масло):1 (кумол), при этом молярная концентрация кумола также составляла 1,84
моль/л, то есть взята избытке по отношению к концентрациям действующих антиоксидантов и азоинициатора. Оценка концентрации масла в реакционной смеси по три-олеоилглицерину дает 0,69 моль/л. Достаточно большое количество введенного в реакционную смесь масла позволило сделать ощутимыми для спектрофотометрического метода концентрации действующих антиоксидантных веществ. Так, по данным ВЭЖХ в 1 кг соевого масла сумма токоферолов составляет «1400 мг (2,98 ммоль/л), а в реакционной смеси - 1,53 ммоль/л. Реакцию окисления кумола в присутствие растительных масел проводили аналогично описанному выше.
Рис. 2. Кинетические кривые накопления ДФБХД в цепной реакции окисления кумола: 1- без антиоксиданта; 2- в присутствии 0,85 ммоль/л аскорбилпальмитата.
Модельную реакцию окисления кумола в присутствии антиоксидантов и растительных масел можно представить в виде схемы конкурентного ингибирования ДФФД и антиоксидантов 1п§Н (рис.3). Отметим, что разветвлением цепи (к3) можно пренебречь, поскольку в результате использования азоинициатора обеспечивается постоянная скорость зарождения цепи, значительно превышающая скорость распада гидроперекисей ROOH.
В реакционной смеси в качестве показанных на схеме (Рис. 3) алкильных R• и пероксильных RO2• радикалов могут выступать радикалы кумола, а также моно- и полиненасыщенных жирных кислот (МНЖК и ПНЖК), входящих в исследуемые растительные масла. Это приводит к параллельной множественной схеме окисления: АИБН + R1H ^ Я1» + 02 ^ К102* АИБН + R2H ^ + 02 ^ И202«
АИБН + ШН ^ + 02 ^ Ш02 •, где R1H, R2H, ..., RiH - окисляемые углеводороды кумол, олеиновая, линолевая и иные ПНЖК в составе триацилг-лицеридов масел, а R1O2•, К202^,..., RiO2• - их перок-сильные радикалы. Значения констант скоростей окисления к1 кумола существенно превышают соответствующие константы Ш, к1 для МНЖК и ПНЖК, поскольку равновесие реакций окисления для кумола существенно сдвинуто к продуктам реакции по сравнению с равновесием
для МНЖК и ПНЖК [5]. Известно также [6], что для параллельных реакций можно записать соотношение концентраций веществ
[я1и]([щи]
1[^1И]0
(1)
Рис 3. Схема модельной реакции окисления кумола в присутствии антиоксидантов масел (конкурентное ингибирование ДФФД и антиоксидантов LnGH)
к
к
При условии к1 >> кИ и численно равных значениях исходных концентраций кумола [Я1Н]0 и жирных кислот [ШН]0 из уравнения (1) можно заключить, что при протекании реакций окисления кумола на незначительную глубину [Я1Н] « [Я1Н]0, например, 5%, концентрация МНЖК и ПНЖК существенно не изменяется: [ШН] = [ЖН]0. Полученная в опытах по инициированию реакций окисления кумола без ингибитора оценка глубины протекания реакции ([Я1Н]0 - [ШН]) / [R1H]0 составляет 0,114%. Действительно, при соотношении констант кИ/к1 = 0,05^0,1 и концентраций [ШН] / [R1H]0 = 0,99886, содержание в реакционной смеси жирных кислот как субстратов окисления равняется исходному. Таким образом,
в условиях проводимых опытов кинетика накопления ДФБХД отвечает окислению преимущественно кумола, тогда как параллельные реакции с МНЖК и ПНЖК не вносят ощутимого вклада в регистрируемую скорость окисления. Следовательно, различный жирнокислотный состав растительных масел в реакционной смеси качественно не изменяет принципиальную схему окисления (Рис. 3).
Полученные кинетические кривые окисления ку-мола в присутствии растительных масел, обладающих ан-тиоксидантными свойствами, также имеют характерные для процесса ингибирования особенности - индукционный период и более низкие скорости окисления (рис. 4).
I<I<I<I<I' 1 ° 2 3 1 4 »-1- 5 -
0 й 0
о д о
Д о -
° Д 0
Од 0
од °
° А о
о а о
о А о
д о
Д О -
С>2 °
9Г °
. ...
0 2 А 6 8 10 12
МИН
Рис. 4 . Кинетические кривые накопления ДФБХД в реакции окисления: 1- кумола; и в присутствии в реакционной смеси: 2- олеиновой кислоты; 3- оливкового масла; 4- масла лимонника; 5- соевого масла.
Оценку антиоксидантной активности можно проводить с учетом одновременного изменения этих параметров для различных масел, если использовать интегральный параметр - площадь под кинетической кривой в фиксированный момент времени. Отметим, что кривые накопления ДФБХД для антиоксидантов и различных масел являются существенно отличными друг от друга функ-
циями времени вследствие различий в механизмах инги-бирования для разных антиоксидантов. Использование значений площадей под кинетическими кривыми в расчетах АОА [3] позволяет, не вдаваясь в детали механизмов ингибирования и не привязываясь к форме кинетических кривых, оценить АОА для различных антиоксидантов [3] и растительных масел.
Так АОА в предлагаемой модельной системе пропорциональна разности ДС^*) концентраций алкильных и пероксильных радикалов кумола R•, образующихся в реакции (рис. 1) без ингибитора Сбланк^*) и в реакции (рис. 3) с игибитором САО^*), отнесенной к исходной концентрации антиоксиданта СО(АО), то есть
АОА( АО) =
(R) - Сао (R) Со (АО)
f С6ланк (t)dt -J САО (t)dt
АОА( АО) = ■
t ■ C0 (АО)
s' — S t
° бланк ° АО
t ■£■ С0(АО)
. (3)
АОА(АО)/АОА(ст), полученное из (3), дает уравнение для расчета относительной антиоксидантной активности (ОАА) на фиксированном промежутке времени Ю
Со(ст)
ОАА =
С"о _ С"» S бланк S АО
(ммоль радикалов R•/ ммоль АО) (2)
Здесь Сбланк(R•) и САО^*) - концентрации радикалов, равные удвоенным концентрациям 2Сбланк (ДФБХД и 2САО(ДФБХД) ^№-дифенил-п-бензохинон-диимина соответственно [4].
Величина абсолютной антиоксидантной активности АОА, таким образом, выражает уменьшение "выхода" радикалов R• при действии антиоксиданта заданной концентрации СО(АО) по сравнению с их "выходом" в реакции без ингибитора, и тем самым характеризует эффективность действия ингибитора.
Учитывая, что величины Сбланк^*) и САО^*) в уравнении (2) являются существенно отличными друг от друга функциями времени Сбланк^*) = Сбланк(^) и САО^*) = САО®, то можно полагать, что на промежутке времени t величина АОА определяется как
С'о _ С'о С (АО)
° бланк (А > (мкмоль стандарта кверце-
тина/ мкмоль АО). (4) Величина ОАА показывает, во сколько раз антиок-сидант с концентрацией СО(АО) эффективнее снижает "выход" радикалов на выбранном промежутке времени Ю реакции по сравнению с "выходом" радикалов при действии стандартного ингибитора концентрацией С0(ст). То есть ОАА показывает, во сколько раз 1 мкмоль антиокси-данта активнее 1 мкмоль кверцетина, и выражается в единицах мкмоль кверцетина.
Для растительных масел (РМ), обладающих анти-оксидантным действием, величину ОАА определяли по формуле
С0(ст)
ОАА(РМ) =
с 'о _ с'о бланк ° РМ
S'o — S'o
бланк ст
V
В числитель уравнения (3) входят значения площадей Stбланк и StАО под соответствующими кинетическими кривыми. При этом, величина ^бланк - StАО)/e•t отвечает концентрации израсходованного за промежуток времени t антиоксиданта, а е - величина экстинции ДФБХД в реакционной смеси.
Отношение абсолютных АОА для антиоксиданта и стандартного антиоксиданта, например, кверцетина,
(мкмоль кверцетина / г РМ ), (5) где т - масса в граммах введенного в реакционную смесь растительного масла; Vр - объем всей реакционной смеси в миллилитрах; С0(ст) - концентрация кверцетина в мкмоль/мл; SРМ, Sст, St0бланк - площади под кривыми окисления соответственно в присутствии РМ, стандартного антиоксиданта и в отсутствие РМ, но введенным в реакционную смесь таким же количеством олеиновой кислоты. Последняя в растворе с кумолом имеет близкое по величине с маслами значение экстинции.
В таблице 1 приведены значения ОАА, полученные для некоторых растительных масел на основе предлагаемого спектрофотометрического подхода. Величина ОАА показывает, во сколько раз 1 грамм растительного масла активнее 1 мкмоля кверцетина, и выражается в единицах мкмоль кверцетина / г растительного масла.
Таблица 1
Значения ОАА некоторых растительных масел in vitro, полученные с помощью СФ-методики в модельной
реакции окисления кумола
№№ Растительное масло ОАА, мкмоль кверцетина/ грамм РМ
1. Соевое масло 14,37 + 0,45
2. Оливковое масло 7,12 + 0,21
3. Масло лимонника 10,71 + 0,35
4. Масло облепихи 24,52 + 1,20
5. Масло расторопши 4,65 + 0,15
6. ю-3 ПНЖК + а-токоферол (1,15 мМ) 9,13 + 0,30
0
0
Полученная в опытах высокая активность соевого масла, очевидно, обусловлена значительно большим содержанием в нем разных свободных изомеров токоферолов по сравнению с их содержанием в оливковом масле [7]. Известно также, что ОАА масла лимонника связана содержанием в нем полифенольных соединений, главным образом, деметилированных лигнанов и флавоноидов. Последние, обусловливают также и полученное значение ОАА для масла расторопши (силибинин, силимарин). Наконец, сильный антиоксидантный эффект облепихо-вого масла вызван, в основном, совокупным действием природных каротиноидов и токоферолов, в частности высокой константой тушения р-каротином синглетного кислорода и его антирадикальной активностью в отношении пероксильных радикалов. Для сравнения в таблице приведены значения ОАА для смеси 1,15 ммоль/л природного
D-a-токоферола с ю-3 ПНЖК. Вероятно, в этом случае антиоксидантный эффект объясняется синергизмом D-a-то-коферола с ПНЖК, описанным в [8].
Заключение. Таким образом, несмотря на различный качественный состав антиоксидантных веществ, содержащихся в представленных растительных маслах, предлагаемая спектрофотометрическая методика позволяет оценить собственную абсолютную и относительную антиоксидантную активность in vitro как меру ингибиро-вания модельной реакции окисления кумола. Тем самым предлагаемый подход может быть использован для стандартизации АОА различных растительных масел и комплексных фитопрепаратов на масляной основе.
Список литературы 1. Калинкина Г.И. Метод определения антиоксидант-ной активности растительных водно-спиртовых
экстрактов. / Калинкина Г.И., Писарева С.И.// Хим. -фарм. журнал. - 1992. - №1. - С. 65 - 66.
2. Ермилова Е.В. Антиокислительная активность экстрактов водяники черной. / Ермилова Е.В., Кадырова Т.В., Краснов Е.А. и др. // Хим.-фарм. журнал. - 2000. - Т. 34, № 11. - С. 28 - 30.
3. Дадали Ю.В. Использование спектрофотометриче-ского метода оценки антиоксидантной активности in vitro для стандартизации индивидуальных и комплексных фитопрепаратов. / Дадали Ю.В., Дадали В.А., Макаров В.Г. // Материалы V Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Санкт-Петербург-Петергоф, 2001. - С. 316 - 321.
4. Noguchi N. 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvale-ronitrile), a new lipid-soluble azo initiator: application to oxidations of lipids and low-density lipoproteins in solution and aqueous dispersions. / Noguchi N.,
Yamashita H., Goton N. et. al. // Free rad. Biol. & Med. - 1998. - Vol. 24, № 2. - P. 259 - 268.
5. Рогинский В.А. Исследование ингибиторов пере-кисного окисления липидов - акцепторов алкиль-ных радикалов. / В сб. Исследование синтетических и природных антиоксидантов. Под ред. Бурлаковой Е.Б. М.: Наука, 1992. - С. 48 - 50.
6. Эмануэль Н.М. Курс химической кинетики. / Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. - М.: Высшая Школа, 1962. - С. 202.
7. Н.К.Надиров. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве./ Н.К.Надиров. -М.: Наука, 1991. - С. 127.
8. Н.М. Сторожок. Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления: Автореферат дисс. ... доктора хим. наук. / Н.М. Сторожок. - Москва: Ин.-т биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 1996. - 50 c.
СИНТЕЗ АДИПИНОВОИ КИСЛОТЫ И ЕЕ ДИЭТИЛОВОГО ЭФИРА
Падалка Сергей Дмитриевич
Старший научный сотрудник, канд. хим. наук, Всероссийский научно-исследовательский институт биологической
защиты растений, г. Краснодар
Адипиновая кислота относится к двухосновным предельным карбоновым кислотам алифатического ряда. Она является продуктом промышленного синтеза, но может также быть синтезирована в лаборатории. Поэтому ее можно использовать как доступный шестиуглеродный синтон в построении сложных молекул. С точки зрения стратегии синтеза адипиновая кислота является п-гексиль-ным эквивалентом [1, с. 289]. Например, из нее можно получить 1,6-гександиол. В свою очередь а,ю-диолы широко
примененяются в синтезе веществ биогенного происхождения, половых феромонов некоторых видов насекомых отряда Lepidoptera [2, с. 1199]. На основе половых феромонов разрабатываются видоспецифичные средства защиты растений [3, с. 3].
В промышленности адипиновую кислоту обычно синтезируют двухстадийным окислением циклогексана (рис. 1).
ОН
55% HNO
145°C
3
Рис. 1.Реакции промышленного синтеза адипиновой кислоты
На первой стадии окислением кислородом воздуха получают смесь циклогексанона и циклогесанола. Продукты разделяют ректификацией. Циклогексанон идет на синтез капролактама, а циклогексанол подвергают дальнейшему окислению азотной кислотой в присутствии катализатора, NH4VO3-ванадата аммония.
В лаборатории синтез начинают сразу из циклогек-санола. В качестве окислителей также можно использовать оксид хрома (VI), дихромат калия или натрия в присутствии серной кислоты. Реакции идут по уравнениям, представленным на рис. 2.
3 C6H11OH + 8 CrO3 + 12 H2SO4 = 3 HOOC-(CH2)4-COOH + 4 Cr2(SO4)3 + 15 H2O 3 C6H11OH + 4 K2Cr2O7 + 16 H2SO4 = 3 HOOC-(CH2)4-COOH + 4 Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 +19 H2O Рис. 2.Реакции лабораторного синтеза адипиновой кислоты
Хотя на выбор экспериментатора предоставлены различные окислители, метод с азотной кислотой является экономически и практически приемлемым для осуществления в лаборатории. Работу необходимо выполнять в хорошо действующем вытяжном шкафу, так как при реакции выделяются ядовитые окислы азота.
За основу синтеза была взята методика окисления циклогексанола азотной кислотой [4, с. 18]. Выполнение самого окисления не представляет особых трудностей. Но
на стадии выделения адипиновую кислоту необходимо очистить от янтарной и глутаровой кислот, которых особенно много присутствует во второй кристаллизационной порции адипиновой кислоты (см. представленную ниже методику синтеза адипиновой кислоты из циклогекса-нола). Авторы литературной методики использовали перекристаллизацию из концентрированной азотной кислоты. Это приводит к частичной потере адипиновой кислоты и полной потере янтарной и глутаровой кислот.
O
O
2
NH4VO3, 55°C
O
