CC BY
17
главная тема: спектральные методы анализа в экспертизе лекарственных средств
main topic: spectroscopic methods used in medicine evaluation
УДК 615.322:54.061
https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-12-1-56-64 Оригинальная статья | Original Article
Ц) Check for updates
m# л л
Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных метаболитов, выделенных из надземной части хохлатки крупноприцветниковой
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ул. Проф. Попова, д. 14а, Санкт-Петербург, 197376, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ул. Екатерининская, д. 110, Пермь, 614990, Российская Федерация
H Понкратова Анастасия Олеговна; [email protected]
резюме Растения рода Corydalis (Papaveraceae) широко используются в восточной медицине и отличаются богатым содержанием биологически активных веществ. Один из представителей рода во флоре России - хохлатка крупноприцветни-ковая (Corydalis bracteata (Steph. ex Willd.) Pers.) распространена на территории Западной и Восточной Сибири, однако ее химический состав недостаточно изучен. Цель работы: проведение фитохимического анализа травы хохлатки крупноприцветниковой (Corydalis bracteata (Steph. ex Willd.) Pers.) путем выделения в индивидуальном виде и определения структуры основных вторичных метаболитов современными хроматографическими методами анализа и ЯМР-спектро-скопией. Материалы и методы: высушенная надземная часть культивируемого растения C. bracteata. Выделение индивидуальных соединений осуществлялось методом колоночной хроматографии на открытых стеклянных колонках с сорбентами различной селективности - Dianion® HP-20 (Supelco) и Sephadex® LH-20 (GE Healthcare), а также методом препаративной ВЭЖХ на колонке Kromasil® C18 с детектированием при 235 нм. В качестве элюента использовали смеси вода-ацетонитрил в соотношениях от 5:95 до 50:50 по объему с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. Анализ фракций перед объединением проводили методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках Silica gel 60 F254 (Merck). Анализ растворов полученных индивидуальных соединений проводили методом ВЭЖХ на приборе Prominence LC-20 (Shimadzu) с колонкой SUPELCOSIL™ LC-18 и детектированием при 235 и 280 нм. Структуры выделенных индивидуальных соединений устанавливали методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии на приборе Bruker Avance III 400 МГц. Результаты: из надземной части С. bracteata выделены и охарактеризованы четыре индивидуальных соединения: алкалоид изохинолинового ряда - коптизин, флавоно-иды - рутин, кверцетин-3-О-р^-глюкопиранозид и кемпферол-3-О-р^-глю-копиранозид. Выводы: при проведении фитохимического анализа надземной части хохлатки крупноприцветниковой впервые были выделены соединения как алкалоидной, так и флавоноидной природы, структура которых была доказана с помощью ЯМР-спектроскопии. C. bracteata следует рассматривать в качестве перспективного потенциального источника биологически активных веществ.
© В.И. Топоркова, А.О. Понкратова, А.К. Уэйли, В.Г. Лужанин, М.Ю. Гончаров, 2022
В.И. Топоркова1 О А.О. Понкратова1 H , А.К. Уэйли1 , В.Г. Лужанин2 О М.Ю. Гончаров1
Топоркова В.И, Понкратова А.О., Уэйли А.К., Лужанин В.Г., Гончаров М.Ю. Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных...
Ключевые слова: хохлатка крупноприцветниковая; Corydalis bracteata; флавоноиды; алкалоиды; вторичные метаболиты; селективное выделение; ЯМР-спектроскопия
Для цитирования: Топоркова В.И., Понкратова А.О., Уэйли А.К., Лужанин В.Г., Гончаров М.Ю. Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных метаболитов, выделенных из надземной части хохлатки крупноприцветниковой. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. Регуляторные исследования и экспертиза лекарственных средств. 2022;12(1):56-64. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-12-l-56-64
The Use of Spectroscopic Methods
for Structural Elucidation of Individual
Secondary Metabolites Isolated
from the Aerial Parts of Corydalis bracteata
1 St. Petersburg State Chemical Pharmaceutical University,
14A, Prof. Popov St., Saint Petersburg 197376, Russian Federation
2 Perm State Pharmaceutical Academy,
101, Ekaterininskaya St., Perm 614990, Russian Federation
IS Anastasiia O. Ponkratova; [email protected]
Plants of the Corydalis (Papaveraceae) genus are widely used in oriental medicine and are known for their particularly rich content of biologically active substances. One of the species encountered in Russia, the large-flowered corydalis (Corydalis bracteata (Steph. ex Willd.) Pers.), is widespread in Western and Eastern Siberia, but none the less its chemical composition has not been properly studied yet. The aim of the study was to perform phytochemical analysis of Corydalis bracteata herb through isolation of the main secondary metabolites and elucidation of their structure, using modern chromatographic methods of analysis and NMR spectroscopy. Materials and methods: the analysis was performed for dried aerial parts of C. bracteata. The isolation of individual compounds was performed using open-column chromatography and glass columns packed with sorbents with different selectivity characteristics— Dianion® HP-20 (Supelco) and Sephadex® LH-20 (GE Healthcare)-as well as preparative-scale chromatography with a Kromasil® C18 column and detection at 235 nm. Water and acetonitrile mixed in the ratios 5:95-50:50 v/v with the addition of 0.1% trifluoroacetic acid were used as the eluents. The analysis of fractions before pooling was performed by high-performance thin-layer chromatography with Silica gel 60 F254 plates (Merck). The analysis of the individual compound solutions was performed by HPLC using a Prominence LC-20 (Shimadzu) instrument, a SUPELCOSIL™ LC-18 column, and detection at 235 nm. The structures of the isolated individual compounds were elucidated by one- and two-dimensional NMR spectroscopy using a Bruker Avance III 400 MHz NMR spectrometer. Results: four individual compounds from the C bracteata aerial parts were isolated and analysed: an isoquinoline alkaloid— coptisine (1) and three flavonoids—rutin (2), quercetin-3-O-p-D-glucopyranoside (3), and kaempferol-3-O-p-D-glucopyranoside (4). Conclusions: as a result of the phytochemical analysis of the C bracteata aerial parts, compounds of both alkaloid and flavonoid nature were isolated for the first time, and their structures were elucidated using NMR spectroscopy. C bracteata should be considered as a promising potential source of biologically active substances.
V.I. Toporkova1 , A.O. Ponkratova1 H , A.K. Whaley1 , V.G. Luzhanin2 , M.Yu. Goncharov1 ©
Toporkova V.I, Ponkratova A.O., WhaleyA.K, Luzhanin V.G., Goncharov M.Yu.
The use of spectroscopic methods for structural elucidation of individual secondary metabolites isolated..
Key words: large-flowered corydalis; Corydalis bracteata; flavonoids; alkaloids; secondary metabolites; selective isolation; NMR spectroscopy
For citation: Toporkova V.l., Ponkratova A.O., Whaley A.K., Luzhanin V.G., Goncharov M.Yu. The use of spectroscopic methods for structural elucidation of individual secondary metabolites isolated from the aerial parts of Corydalis bracteata. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya. Regulyatornye issledovaniya i ek-spertiza lekarstvennykh sredstv = Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. Regulatory Research and Medicine Evaluation. 2022;12(l):56-64. https://doi.org/10.30895/1991-2919-2022-12-l-56-64
Введение
Растения рода Corydalis (Papaveraceae) широко используются в восточной медицине благодаря содержанию большого количества биологически активных веществ [1, 2]. В результате ранее проведенных исследований химического состава [2-8] из различных видов Corydalis были выделены изохинолиновые алкалоиды следующих классов: протобербериновые, бензофенантре-диновые, апорфиновые, протопиновые, бензи-лизохинолиновые, морфинаны и спиробензи-лизохинолиновые. Наиболее изученные виды хохлатки, такие как Corydalis yanhusuo, описанная в Европейской и Китайской фармакопеях, и Corydalis decumbens, описанная в Китайской фармакопее [9], наряду с другими видами Corydalis применяются как болеутоляющие средства в виде таблеток, гранул, порошков и экстрактов для облегчения боли при гастралгии, мигрени и дисменорее, как противовоспалительные средства для лечения ревматизма и заболеваний печени, а также для лечения сердечной аритмии [2, 10-13]. В то же время информация по применению вида ^rydalis bracteatа в народной и традиционной медицине отсутствует.
Хохлатка крупноприцветниковая (Corydalis bracteata (Steph. ex Willd.) Pers.) представляет собой многолетнее травянистое растение с длинными черешковыми тройчато рассеченными листьями и дуговидно изогнутыми крупными цветками желтого цвета с восходящим шпор-цем, собранными в соцветие кисть. C. bracteata произрастает в Азии и широко распространена в Западной и Восточной Сибири и Монголии. Ранее в C. bracteata методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектро-метрическим детектированием (ВЭЖХ-МС) были идентифицированы 12 алкалоидов, однако выделение их в индивидуальном виде из C. bracteata, наряду с изучением химического состава соединений, относящихся к другим классам, в данном растении ранее не проводилось [1].
Актуальность данного исследования обусловлена широким спектром биологической активности изохинолиновых алкалоидов, а также отсутствием
данных о вторичных метаболитах растения, относящихся к другим классам [2, 10, 11, 14-19].
Цель работы - проведение фитохимического анализа травы хохлатки крупноприцветниковой (Corydalis bracteata (Steph. ex Willd.) Pers.) путем выделения в индивидуальном виде и определения структуры основных вторичных метаболитов современными хроматографическими методами анализа и ЯМР-спектроскопией.
Материалы и методы
Надземная часть C. bracteata собрана в фазу цветения на территории Ботанического института им. В. Л. Комарова Российской академии наук (Санкт-Петербург). Поскольку хохлатка круп-ноприцветниковая занесена в Красные книги Бурятской АССР и Иркутской области, а также включена в списки редких и исчезающих растений Сибири, для дальнейших исследований следует использовать культивируемое растение.
Сырье перед экстракцией подвергали воздушно-теневой сушке, измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 1 мм. Предварительно осуществляли выбор оптимального экстрагента. В пять колб вместимостью 200 мл помещали по 10 г сырья C. bracteata и добавляли 100 мл соответствующего экстрагента: гексана, дихлорметана, бутанола, 70 или 96% этилового спирта. Экстракцию проводили в плотно закрытых колбах при комнатной температуре в течение 48 ч. Полученные экстракты анализировали методом ВЭЖХ на приборе Prominence LC-2 0 (Shimadzu) с диодно-матричным детектором при длинах волн 235 и 280 нм. Использовали колонку SUPELCOSIL™ LC-18 (250*4,6 мм) с размером частиц сорбента 5 мкм. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура колонки - 4 0 °C. Объем вводимой пробы - 10 мкл. В качестве элюента использовали смеси вода-ацетонит-рил в соотношениях от 5:95 до 0:100 по объему с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты. Время анализа - 50 мин. Было установлено, что использование 96% этилового спирта позволяет получить экстракт из С. bracteata
Топоркова В.И, Понкратова А.О., Уэйли А.К., Лужанин В.Г., Гончаров М.Ю. Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных...
с наибольшим качественным и количественным содержанием производных флавоноидов и алкалоидов, поэтому данный экстрагент был выбран для дальнейшей работы.
B00 г измельченного сырья подвергали многократной экстракции 96% этиловым спиртом (7500 мл) при комнатной температуре с использованием механической мешалки (Heidolph). Экстракция проводилась до того момента, пока полученный экстракт не становился бледным по сравнению с первоначальным. Все полученные спиртовые экстракты объединяли и выпаривали на вакуумно-ротационном испарителе (Heidolph) при 60 °C до объема 350 мл. К 350 мл экстракта добавляли 100 мл воды очищенной и проводили исчерпывающую жидкостно-жид-костную (ЖЖ) экстракцию с равными объемом н-гексана. После чего к водно-спиртовому остатку добавляли 200 мл воды очищенной и проводили исчерпывающую ЖЖ экстракцию с равным объемом дихлорметана. В заключение проводили ЖЖ экстракцию водно-спиртового остатка с равным объемом бутанола.
Дихлорметановую фракцию выпаривали досуха на вакуумно-ротационном испарителе, после чего сухой остаток растворяли в 96% этиловом спирте. Образовавшийся нерастворимый в 96% этаноле осадок отфильтровывали, промывали 96% этанолом и затем растворяли в 10 мл воды очищенной. Таким образом было получено соединение 1 массой (m1) = 24,15, (время удерживания на колонке SUPELCOSIL™ LC-1B в описанных выше условиях анализа (tR1) = 27,445).
Бутанольную фракцию выпаривали на ваку-умно-ротационном испарителе при 60 °С до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 50% этаноле и загружали на колонку, заполненную сорбентом Dianion® HP20 (Supelco, CAS 9052-95-3). Проводили градиентное элюирование с постепенным понижением полярности изначального элюента с шагом 10% (соотношение вода - 96% этанол от 100:0 до 0:100 по объему). Собранные фракции анализировали методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии ^TCX) с целью выявления фракций со схожими компонентами. ВЭTСX выполняли на приборе CAMAG® (аппликатор для полуавтоматического нанесения образцов Linomat 5, автоматическая камера для хроматографирования пластин Automatic Developing Chamber 2, изображения получали при помощи TLC Vizualizer 2), с использованием пластин для ВЭTСX Silica gel 60 F254 с размером частиц сорбента 4-B мкм (Merck, кат. № 105642)
в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2).
Фракции, которым на хроматограмме соответствовали пятна с одинаковыми факторами удерживания (Rf) и окраской, - объединяли. Объединенные фракции выпаривали на вакуум-но-ротационном испарителе при 60 °C до объема 20 мл и анализировали методом ВЭЖХ на колонке SUPELCOSIL™ LC-18 в описанных выше условиях для выбора фракций с наибольшим содержанием определяемых веществ.
Фракцию, полученную при элюировании колонки 40% этанолом, загружали на открытую колонку, заполненную сорбентом Sephadex® LH-20 (GE Healthcare), и подвергали изократиче-скому элюированию 50% этанолом. Полученные фракции анализировали методом ВЭТСХ с целью выявления фракций со схожими компонентами. Фракции, которым на хроматограмме соответствовали пятна с одинаковыми факторами удерживания (Rf) и окраской, - объединяли. Объединенные фракции выпаривали на вакуумно-ротационном испарителе при 60 °C до объема 20 мл. Таким образом было получено 12 фракций. Полученные фракции анализировали методом ВЭЖХ для выбора фракций с наибольшим содержанием определяемых веществ. Выбранные фракции 8 и 10 подвергали хрома-тографическому разделению на препаративном высокоэффективном жидкостном хроматографе Smartlina (Knauer) со спектрофотометрическим детектором при длине волны 235 нм. Применяли препаративную хроматографическую колонку Kromasil® C18 (250*30 мм) с размером частиц сорбента 5 мкм. Скорость потока подвижной фазы составляла 40 мл/мин. В качестве элюента использовали смеси вода-ацетонитрил в соотношениях от 5:95 до 50:50 по объему с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты.
Из фракции 8 было выделено соединение 2 (m2 = 45,15 мг, tR2 = 19,347 мин), а из фракции 10 соединения 3 (m3 = 16,15 мг, tR3 = 19,819 мин) и 4 (m4 = 12,65 мг, tR4 = 20,965 мин).
Структуры выделенных индивидуальных соединений устанавливали методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии на приборе Bruker Avance III 400 МГц (Bruker NMR Technology). Растворитель - ДМСО-а^. Параметры Ж-ЯМР анализа: ширина спектра - 24,9917 ppm (10 000 Гц), угол поворота намагниченности -30°, задержка на релаксацию - 1 с, количество накоплений сигнала свободной индукции - 16,
Toporkova V.I., Ponkratova A.O., WhaleyA.K., Luzhanin V.G., Goncharov M.Yu.
The use of spectroscopic methods for structural elucidation of individual secondary metabolites isolated..
число точек аналого-цифрового преобразования - 64к, способ калибровки шкалы химических сдвигов - относительно остаточных сигналов дейтерорастворителя. Параметры NOESY анализа: задержка на релаксацию - 1,93 с, количество накоплений сигнала свободной индукции на 1 инкремент - 8, число точек аналого-цифрового преобразования 2к на 128, время смешивания 0,7 с.
Результаты и обсуждение
Соединение 1 представляет собой оранжевое кристаллическое вещество, УФ-спектр которого имеет максимумы поглощения при 265, 358 и 484 нм. 1Н-ЯМР спектр соединения содержал сигналы 14 протонов, среди которых присутствовали две спиновые системы. Первая спиновая система состояла из двух дублет-дублетов в алифатической области спектра, каждый из которых интегрировался на два протона и соответствовал двум соседним СН2 группам при 5H 4,88 (2Н, дд, J = 7,2; 6,0 Гц) и 3,20 (2Н, дд, J = 7,2; 6,0 Гц) м.д. Сильный химический сдвиг метиленовой группы при 4,88 м.д. может быть обусловлен только наличием в соседнем положении от него положительно заряженного атома азота дегидроизохинолиновой системы. Вторая спиновая система состояла из двух дублетов
Таблица 1. 'Н-ЯМР данные соединения 1 - коптизин Table 1. 'Н NMR data of compound 1-coptisine
Положениие Position SH (J, Гц/Hz)
1 7,80 (1H, с) 7.80 (LH, s)
4 7,09 (1H, с) 7.09 (LH, s)
5 3,20 (2H, т, J = 7,2; 6,0) 3.20 (2H, t, J = 7.2, 6.0)
6 4,88 (2H, т, J = 7,2; 6,0) 4.88 (2H, t, J = 7.2, 6.0)
8 9,95 (1H, c) 9.95 (LH, s)
11 7,83 (1H, д, J = 8,7) 7.83 (LH, d, J = 8.7)
12 8,05 (1H, д, J = 8,7) 8.05 (LH, d, J = 8.7)
13 8,96 (1H, с) 8.96 (LH, s)
2,3-OCH2O 6,18 (2H, с) 6.L8 (2H, s)
9,10-OCH2O 6,54 (2H, с) 6.54 (2H, s)
в ароматической области спектра при 5Н 8,05 (1Н, d, ] = 8,7 Гц) и 7,83 (1Н, d, ] = 8,7 Гц) м.д. Исходя из константы спин-спинового взаимодействия в 8,7 Гц очевидно, что данные ароматические протоны расположены в ортоположении относительно друг друга. Все остальные 8 протонов, представленные в 1Н-ЯМР спектре, являются синглетами, интегрирующимися на 1 или 2 протона при 5Н 6,18 (2Н, с), 6,54 (2Н, с), 7,09 (1Н, с), 7,80 (1Н, с), 8,96 (1Н, с) и 9,95 (1Н, с) м.д. Наличие ароматических синглетов, сдвинутых в область более слабого поля при 8,96 (1Н, с) и 9,95 (1Н, с) м.д., и положительно заряженного атома азота указывает на то, что данные протоны находятся в электронодефицитной ^замещенной пиридиновой системе. Синглеты при 5Н 6,18 (2Н, с) и 6,54 (2Н, с) м.д. указывают на наличие двух метилендиокси-групп в молекуле. Исходя из вышеперечисленных спектральных данных было установлено, что соединение 1 является представителем протобербериновых алкалоидов, но в зависимости от расположения двух метилендиокси-групп в протобербериновой системе наблюдаемые спектральные характеристики могут потенциально соответствовать, по крайней мере, четырем возможным изомерам. В результате структура соединения 1 была установлена как коптизин на основе анализа 1Н-ЯМР данных (табл. 1) и анализа соответствующих NOESY корреляций.
Доказательством структуры коптизина являются NOESY корреляции от 4-Н (5Н 7,09 м.д.) к протонам 5-СН2 группы (5Н 3,20 м.д.), от протонов 6-СН2 группы (5Н 4,88 м.д.) к 8-Н (5Н 9,95 м.д.) и от 13-Н (5Н 8,96 м.д.) к 12-Н (5Н 8,05 м.д.) и 1-Н (5Н 7,80 м.д.) (рис. 1).
Соединение 2 - желтое кристаллическое вещество, имеющее максимумы УФ-поглощения
O
O
>
Рис. 1. Ключевые NOESY корреляции коптизина Fig. 1. Key NOESY correlations of coptisine
Топоркова В.И, Понкратова А.О., Уэйли А.К., Лужанин В.Г., Гончаров М.Ю. Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных...
при 255 и 351 нм. В 1Н-ЯМР спектре (табл. 2) присутствовали сигналы, характерные для рутина -наличие спиновой системы кольца А, состоящей из протонов 6-Н при 5H 6,20 (1Н, д, J = 2,0 Гц), и 8-Н 6,40 (1Н, д, J = 2,0 Гц) м.д., и спиновой системы кольца B, состоящей из протонов 2'-Н при 5H 7,54 (1Н, уш. с), 5'-Н 6,85 (1Н, д, J = 8,6 Гц) и 6'-H 7,55 (1H, дд, J = 8,6; 2,0 Гц) м.д. Сигналы аномерных протонов остатков глюкозы 1''-Н и рамнозы 1'''-Н находились при 5H 5,35 (1Н, д, J = 7,3 Гц) и 4,39 (1H, д, J = 1,2 Гц) м.д. соответственно. Таким образом, на основании анализа спектральных данных и сравнения их с литературными данными, предполагается, что соединение 2 является рутином [20].
Соединение 3 представляет собой желтое кристаллическое вещество с максимумами УФ-поглощения при 254 и 351 нм. В 1Н-ЯМР
спектре присутствовали сигналы, характерные для остатков кверцетина и глюкозы (табл. 2). В ароматической области спектра наблюдались сигналы спиновой системы кольца А, состоящей из протонов 6-Н при 6Н 6,21 (1Н, д, ] = 1,9 Гц) и 8-Н 6,41 (1Н, д, ] = 1,9 Гц) м.д., и спиновой системы кольца В, состоящей из протонов 2'-Н при 5Н 7,58 (1Н, д, ] = 2,1 Гц), 5'-Н 6,85 (1Н, д, ] = 9,0 Гц) и 6'-Н 7,55 (1Н, дд, ] = 9,0; 2,1 Гц) м.д. Сигнал аномерного протона остатка глюкозы 1''-Н наблюдался при 5Н 5,47 (1Н, д, ] = 7,3 Гц) м.д. В результате анализа полученных спектральных данных и сравнения их с литературными данными предполагается, что соединение 3 представляет собой кверце-тин-3-О-р^-глюкопиранозид [21].
Соединение 4 представляет собой желтое кристаллическое вещество, имеющее максимумы
Таблица 2. 1Н-ЯМР данные соединений 2-4 - рутин, KBepufimuH-S-O-ß-D-глюкопиранозид, кемnферол-3-О-ß-D-глюкоnиранозид Table 2.1H NMR data of compounds 2-4: rutine, quercetin-3-O-ß-D-glucopyranoside, and kaempferol-3-O-ß-D-glucopyranoside
Положение Position Соединение 2 Compound 2 SH (J, Гц/Hz) Положение Position Соединение 3 Compound 3 SH (J, Гц/Hz) Положение Position Соединение 4 Compound 4 SH (J, Гц/Hz)
6 6,20 (1H, д, J = 2,0) 6.20 (1H, d, J = 2.0) 6 6,21 (1H, д, J = 1,9) 6.21 (1H, d, J = 1.9) 6 6,22 (1H, д, J = 2,0) 6.22 (1H, d, J = 2.0)
8 6,40 (1H, д, J = 2,0) 6.40 (1H, d, J = 2.0) 8 6,41 (1H, д, J = 1,9) 6.41 (1H, d, J = 1.9) 8 6,45 (1H, д, J = 2,0) 6.45 (1H, d, J = 2.0)
2' 7,54 (1H, уш. с) 7.54 (1H, brs) 2' 7,58 (1H, д, J = 2,1) 7.58 (1H, d, J = 2.1) 2', 6' 8,04 (2H, д, J = 8,9) 8.04 (2H, d, J = 8.9)
5' 6,85 (1H, д, J = 8,6) 6.85 (1H, d, J = 8.6) 5' 6,85 (1H, д, J = 9,0) 6.85 (1H, d, J = 9.0) 3', 5' 6,89 (2H, д, J = 8,9) 6.89 (2H, d, J = 8.9)
6' 7,55 (1H, дд, J = 8,6; 2,0) 7.55 (1H, dd, J = 8.6, 2.0) 6' 7,58 (1H, дд, J = 9,0; 2,1) 7.58 (1H, dd, J = 9.0, 2.1) 1'' 5,46 (1H, д, J = 7,3) 5.46 (1H, d, J = 7.3)
1'' 5,35 (1H, д, J = 7,3) 5.35 (1H, d, J = 7.3) 1'' 5,47 (1H, д, J = 7,3) 5.47 (1H, d, J = 7.3) 2''- 6'' 3,09-3,57 (6H, м) 3.09-3.57 (6H, m)
2''- 6'' 3,08-3,73 (6H, м) 3.08-3.73 (6H, m) 2''- 6'' 3,09-3,59 (6H, м) 3.09-3.59 (6H, m) 5-OH 12,62 (1H, с) 12.62 (1H, s)
I'- 4,39 (1H, д, J = 1,2) 4.39 (1H, d, J = 1.2) 5-OH 12,65 (1H, с) 12.65 (1H, s) 7-OH 10,89 (1H, с) 10.89 (1H, s)
2'''- 5''' 3,08-3,72 (5H, м) 3.08-3.72 (5H, m) 7-OH 10,86 (1H, с) 10.86 (1H, s)
6''' 1,0 (3H, д, J = 6,2) 1.0 (3H, d, J = 6.2) 3''-OH 9,21 (1H, с) 9.21 (1H, s)
5-OH 12,60 (1H, с) 12.60 (1H, s) 4''-OH 10,20 (1H, с) 10.20 (1H, s)
7-OH 10,84 (1H, с) 10.84 (1H, s) 4''-OH 9,81 (1H, с) 9.81 (1H, s)
3''-OH 9,17 (1H, с) 9.17 (1H, s)
4''-OH 9,67 (1H, с) 9.67 (1H, s)
Toporkova V.I, Ponkratova A.O., WhaleyA.K., Luzhanin V.G., Goncharov M.Yu.
The use of spectroscopic methods for structural elucidation of individual secondary metabolites isolated..
поглощения в УФ-спектре при 265 и 347 нм. В 1Н-ЯМР спектре соединения 4 присутствовали сигналы, характерные для остатков кемпфе-рола и глюкозы (табл. 2). В ароматической области спектра наблюдались сигналы спиновой системы кольца А, состоящей из протонов 6-Н при 5Н 6,22 (1Н, д, ] = 2,0 Гц) и 8-Н 6,45 (1Н, д, ] = 2,0 Гц) м.д., и спиновой системы кольца В, состоящей из протонов 2',6' при 5Н 8,04 (2Н, д, I = 8,9 Гц) и 3',5'-Н при 5Н 6,89 (2Н, д, I = 8,9 Гц) м.д. Сигнал аномерного протона остатка глюкозы 1''-Н наблюдался при 5Н 5,46 (1Н, д, I = 7,3 Гц)
м.д. В результате анализа спектральных данных и сравнения их с литературными данными предполагается, что соединение 4 представляет собой кемпферол-3-О-р^-глюкопиранозид [22].
В результате исследования из надземной части С. bracteata были выделены и охарактеризованы четыре индивидуальных соединения: коптизин (1) [23], рутин (2) [20], кверцетин-3-О-р^-глюко-пиранозид (3) [21] и кемпферол-3-О-р^-глюко-пиранозид (4) [22], структуры которых представлены ниже:
O
<
O
HO
11
12 | ^-jpO
O
4 5
>
OH
OH
oh о A. .OH о
OH
HO
OH O
6''
6"^oi;,o oh ho^t 'oh
2 OH
HO
OH OH
OH OH
OH
OH O л .OH
о
OH
OH OH
OH OH
1
3
4
Заключение
В результате фитохимического изучения надземной части Corydalis bracteata ^ерК ех WiLLd.) Ре^. методом колоночной хроматографии на открытых стеклянных колонках с сорбентами различной селективности, а также методом препаративной ВЭЖХ было выделено одно соединение, относящееся к классу алкалоидов, и три соединения, относящихся к классу флавоноидов. Структура выделенных соединений была охарактеризована с помощью ЯМР-спектроскопии. Соединение 1 представ-
ляет собой алкалоид изохинолинового ряда -коптизин, соединение 2 - рутин, соединение 3 - кверцетин-3-О-р^-глюкопиранозид, соединение 4 - кемпферол-3-О-р^-глюкопиранозид. Соединения 2-4 обнаружены в растениях рода Corydalis впервые, а также все соединения выделены впервые из вида С. bracteata. Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что надземная часть С. bracteatа является перспективным источником биологически активных веществ как алкалоидной, так и флавоноидной природы.
Топоркова В.И., Понкратова А.О., Уэйли А.К, Лужанин В.Г., Гончаров М.Ю.
Применение спектральных методов анализа для установления структуры индивидуальных вторичных...
ЛИТЕРАТУРА/ REFERENCES
1. Khodorova NV, Shavarda AL, Lequart-PiUon M, La-berche JC, Voitsekhovskaja OV, Boitel-Conti M. Biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids in Corydalis bracteata: compartmentation and seasonal dynamics. Phytochemistry. 2013;92:60-70. https://doi.org/10.1016/j~.phytochem.2013.04.008
2. Iranshahy M, Ouinn RJ, Iranshahi M. Biologically active isoquinoline alkaloids with drug-like properties from the genus Corydalis. RSCAdv. 2014;4(31):15900-13. https://doi.org/10.1039/C3RA47944G
3. Jha RN, Pandey MB, Singh AK, Singh S, Singh VP. New alkaloids from Corydalis species. Nat Prod Res. 2009;23(3):250-5. https://doi.org/10.1080/14786410801996390
4. Xiao HT, Peng J, Liang Y, Yang J, Bai X, Hao XY, et al. Acetylcholinesterase inhibitors from Cory-dalis yanhusuo. Nat Prod Res. 2011;25(15):1418-22. https://doi.org/10.1080/14786410802496911
5. Liu Z, Mi Z, Wang P, Chang S, Han N, Yin J. Two new alkaloids from the tubers of Corydalis ambigua subsp. amurensis and their anti-prolifera-tive activity. Nat Prod Res. 2020;34(23):3305-12. https://doi.org/10.1080/14786419.2019.1566821
6. Yao HN, Peng ZT, Zhang YF, Liu DF, Huang BF, Tu PF, et al. Alkaloids with acetylcholinesterase inhibitory activity from Corydalis racemosa (Thunb.) Pers. Nat Prod Res 2021;35(22):4272-8. https://doi.org/10.1080/14786419.2019.1696796
7. Muhammad N, Lal Shrestha R, Adhikari A, Wadood A, Khan H, Khan AZ, et al. First evidence of the analgesic activity of govaniadine, an alkaloid isolated from Corydalis govaniana Wall. Nat Prod Res. 2015;29(5):430-7. https://doi.org/10.1080/14786419.2014.951933
8. Tong S, Yan J, Lou J. Preparative isolation and purification of alkaloids from Corydalis yanhusuo W. T. Wang by high-speed counter-current chromatogra-phy. J Liq Chrom Relat Technol. 2005;28(18):2979-89. https://doi.org/10.1080/10826070500274638
9. Jiang L, Li M, Zhao F, Chu S, Zha L, Xu T, et al. Molecular identification and taxonomic implication of herbal species in genus Corydalis (Papaveraceae). Molecules. 2018;23(6):1393. https://doi.org/10.3390/molecules23061393
10. Khodorova NV, Miroslavov EA, Shavarda AL, La-berche J, Boitel-Conti M. Bud development in corydalis (Corydalis bracteata) requires low temperature: a study of developmental and carbohydrate changes. Ann Bot. 2010;105(6):891-903. https://doi.org/10.1093/aob/mcq076
11. Wang L, Zhang Y, Wang Z, Gong N, Kweon TD, Vo B, et al. The antinociceptive properties of the Corydalis yanhusuo extract. PLoS One. 2016;11(9):e0162875. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0162875
12. Zhang J, He S, Wang J, Wang C, Wu J, Wang W, et al. A review of the traditional uses, botany, phytochemistry, pharmacology, pharmacokinet-ics, and toxicology of Corydalis yanhusuo. Nat
Prod Commun. 2020;15(9):1934578X2095775. https://doi.org/10.1177/1934578X20957752
13. Zhang S, Ouyang F, Wang C, Gu M. Fingerprint of tablet of Corydalis tuber for alleviating pain by HPLC. J Liq Chromatogr Relat Technol. 2007;31(3):452-64. https://doi.org/10.1080/10826070701780870
14. Chlebek J, Korabecny J, Dolezal R, Stepankova S, Perez DI, Hostalkova A, et al. In vitro and in silico acetylcholinesterase inhibitory activity of thalictricavine and canadine and their predicted penetration across the blood-brain barrier. Molecules. 2019;24(7):1340. https://doi.org/10.3390/molecules24071340
15. Kim YJ, Lim HS, Kim Y, Lee J, Kim BY, Jeong S-J. Neuroprotective effect of Corydalis ternata extract and its phytochemical quantitative analysis. Chem Pharm Bull. 2017;65(9):826-32. https://doi.org/10.1248/cpb.c17-00300
16. Kim KH, Lee IK, Choi SU, Lee JH, Moon E, Kim SY, et al. New triterpenoids from the tubers of Cory-dalis ternata: structural elucidation and bioactiv-ity evaluation. Planta Med. 2011;77(13):1555-8. https://doi.org/10.1055/s-0030-1270781
17. Guo J, Wang SB, Yuan TY, Wu YJ, Yan Y, Li L, et al. Coptisine protects rat heart against myo-cardial ischemia/reperfusion injury by suppressing myocardial apoptosis and inflammation. Atherosclerosis. 2013;231(2):384-91. https://doi.org/10.1016/j~.atherosclerosis.2013.10.003
18. Chen H, Luo C, Liang J, Zhang Z, Lin G, Wu J, et al. Anti-inflammatory activity of coptisine free base in mice through inhibition of NF-kB and MAPK signaling pathways. Eur J Pharmacol. 2017;811:222-31. https://doi.org/10.1016/j~.ejphar.2017.06.027
19. Friedemann T, Schumacher U, Tao Y, Leung AKM, Schröder S. Neuroprotective activity of coptisine from Coptis chinensis (Franch). Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:827308. https://doi.org/10.1155/2015/827308
20. Baki PA, El-Sherei MM, Khaleel AE, Motaal AA, Abdallah HI. Aquaretic activity of Solidago canaden-sis L. cultivated in Egypt and determination of the most bioactive fraction. IJPR. 2019;18(2):922-37. https://doi.org/10.22037/ijpr.2019.2390
21. Islam M, Al-Amin M, Siddiqi MMA, Akter S, Haque MM, Sultana N, et al. Isolation of quercetin-3-O-ß-D-glu-copyranoside from the leaves of Azadirachta indica and antimicrobial and cytotoxic screening of the crude extracts. Dhaka Univ J Sci. 2012;60(1):11-4. https://doi.org/10.3329/dujs.v60i1.10328
22. Bylka W, Matlawska I. Flavonoids and free phenolic acids from Phytolacca americana L. leaves. Acta Pol Pharm. 2001;58(1):69-72. PMID: 11370291
23. Colombo ML, Bugatti C, Mossa A, Pescalli N, Piaz-zoni L, Pezzoni G, et al. Cytotoxicity evaluation of natural coptisine and synthesis of coptisine from berberine. Farmaco. 2001;56(5-7):403-9. https://doi.org/10.1016/s0014-827x(01)01121-1
Toporkova V.I, Ponkratova A.O., WhaleyA.K., Luzhanin V.G., Goncharov M.Yu.
The use of spectroscopic methods for structural elucidation of individual secondary metabolites isolated..
Вклад авторов. В.И. Топоркова - выделение и анализ индивидуальных соединений из лекарственного растительного сырья; А.О. Понкратова - выделение и анализ индивидуальных соединений из лекарственного растительного сырья; А.К. Уэйли -сбор и интерпретация результатов ЯМР-спектро-скопии; В.Г. Лужанин - написание текста рукописи; М.Ю. Гончаров - идея, планирование исследования, ответственность за все аспекты работы. Все авторы участвовали в обсуждении результатов.
Благодарности. ЯМР-данные были получены с использованием оборудования ресурсного центра «Магнитно-резонансные методы исследования» Санкт-Петербургского государственного университета.
Authors' contributions. Valeria I. Toporkova-isola-tion and analysis of individual compounds from the herbal substance; Anastasiia O. Ponkratova-isola-tion and analysis of individual compounds from the herbal substance; Andrei K. Whaley-obtaining and interpretation of NMR data; Vladimir G. Luzhanin-writing of the paper; Mikhail Yu. Goncharov-elabor-ation of the idea of the study, planning of the study, carrying responsibility for all aspects of the study. All the authors took part in the discussion of the results.
Acknowledgements. NMR data were obtained using the equipment of the Magnetic Resonance Research Centre of St. Petersburg State University.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest requiring disclosure in this article.
ОБ АВТОРАХ/AUTHORS
Топоркова Валерия Игоревна.
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5985-5156
Понкратова Анастасия Олеговна.
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4879-9336
Уэйли Андрей Кеннет.
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4847-5924 [email protected]
Лужанин Владимир Геннадьевич, канд. биол. наук. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6312-2027 [email protected] Гончаров Михаил Юрьевич, д-р биол. наук. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9706-9850 [email protected]
Статья поступила 01.12.2021 После доработки 26.01.2022 Принята к печати 04.03.2022
Valeria I. Toporkova.
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5985-5156
Anastasiia O. Ponkratova.
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4879-9336
Andrei K. Whaley.
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4847-5924
Vladimir G. Luzhanin, Cand. Sci. (Biol.).
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6312-2027
Mikhail Yu. Goncharov, Dr. Sci. (Biol.).
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9706-9850
Article was received 1 December 2021 Revised 26 January 2022 Accepted for publication 4 March 2022
