ПРИМЕНЕНИЕ С14 ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ В ВОДЕ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

При этом в процессе поглощения происходит образование ртутьорганическо-го соединения. Анализ проводят на следующий день, так как более полная меркуризация достигается лишь с течением времени.

ЛИТЕРАТУРА

Анашкина Н. П. и др. Труды Уфимск. ин-та гигиены и профзаболеваний. Уфа, 1930, т. 1, с. 311. — К а з н и н а Н. И. Гиг. и сан., 1968, № 5, с. 65. — М а к а -р о в а А- Г., Несмеянов А. П. Методы элементо-органической химии. М., 1965. — Ф ь ю з о н Р. Рзакции органических соединений. М., 1962.

Поступила 27/У 196а г.

УДК 613.32:576.851.48]-073.»1в

ПРИМЕНЕНИЕ С14 ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ В ВОДЕ

Л. Е. Корил, В. Ф. Жевержеева, Е. П. Никифорова Инстнэуг общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва

Экспериментальными исследованиями подтверждена возможность использования изотопа С14 для определения кишечной палочки в воде за 5—6 часов (Л. Е. Корш и соавт.). Однако исследования, проведенные в экспериментальных условиях на чистых культурах кишечной палочки с выращиванием на мясо-пептонном бульоне, не дают еще возможности судить о специфичности метода. В литературе также нет соответствующих данных.

Нашей задачей'было изучение специфичности радиоизотопного метода, разрабатываемого для ускоренного определения кишечной палочки в воде с применением С14. Сущностью этого метода является оценка наличия бактерий кишечной палочки в воде по метаболически выделяемой ими углекислоте, меченной изотопом С14. Изотоп вводится в питательную среду, на которой выращивается кишечная палочка. Углекислоту (С14Ог) улавливают специальными прокладками, смоченными насыщенным водным раствором гидроокиси бария, активность ее подсчитывают на счетчике и выражают счет в импульсах в минуту.

При методе в том виде, как он был разработан, т. е. с использованием в качестве питательной среды глюкозного мясо-пептонного бульона, почти любой микроорганизм, находящийся в испытуемой пробе воды, имеет все условия для роста, размножения и метаболического выделения С14Ог. Таким образом, сам метод не является специфическим и пригодным для выделения какого-либо определенного микроорганизма. Чтобы сделать метод специфичным, например для выделения бактерий группы кишечной палочки, необходимо проверить его в определенных условиях и внести соответствующие усовершенствования.

Известно, что различные штаммы микроорганизмов при выращивании их на питательной среде вырабатывают различное количество углекислоты в зависимости от условий культивирования и фазы логарифмического развития, при которой они взяты в опыт. Это связано со многими факторами и в первую очередь с различной степенью усвоения клетками тех продуктов, которые находятся в питательной среде: чем легче усваивается среда, тем быстрее происходит рост бактерий и тем значительнее проявляется их биохимическая активность, больше потребляется кислорода и выделяется углекислоты. В разрабатываемом нами методе это должно выражаться увеличением числа импульсов в минуту.

Отсюда вытекает, что специфичность радиоизотопного метода в основном должна заключаться в использовании строго элективной питательной среды и по возможности оптимальных условий для роста кишечной палочки и угнетения при этом других водных микроорганизмов или в крайнем случае подавления их метаболической активности.

По разработке элективной среды для выделения из воды бактерий группы кишечной палочки предложено много питательных сред, характеристика которых дается в специальных руководствах. Наилучшей и общеупотреб-ляемой является среда Эндо (международный стандарт питьевой воды, 1964). В Советском Союзе наряду со средой Эндо применяется розоловый агар, который обладает рядом преимуществ по сравнению со средой Эндо.

Для ускорения роста бактерий группы кишечной палочки на питательных средах рядом исследователей было испытано много приемов, принципов, а также и сред. Судя по результатам многих исследований, одним из существенных факторов, влияющих на рост бактерий, является температура, при которой они выращиваются. Стимулирующее действие температуры проявляется как в более интенсивном размножении бактерий, так и в более быстром проявлении некоторых биохимических признаков: кислотообра-зование, газообразование, выделение индола и др. И. Е. Минкевич установил, что температура 43° стимулирует развитие кишечной палочки, выделяемой из воды, и не вредит даже единичным клеткам. К такому же выводу пришли В. А. Страхова, М. Г. Киченко и соавт. и др.

Исходя из сказанного и тех задач, которые были поставлены перед нами для установления специфичности радиоизотопного метода, мы выделили из воды открытых водоемов чистые культуры бактерий, вырастающих на мембранных фильтрах на среде Эндо и розоловом агаре при 37° в течение 24 часов, и определили их принадлежность к родам и видам по общепринятым биохимическим и тинкториальным свойствам; испытали элективные и ингибиторные свойства розоловой среды на рост выделенных микроорганизмов при 37 и 42°, изучили возможность использования элективных сред (Эндо и розоловой) и температуры 42° для радиоизотопного метода. В результате исследований установлено, что при инкубации посевов воды открытых водоемов на элективных средах для кишечной палочки (Эндо и розоловая) при 37° в течение 24 часов вырастает в среднем только около 35% колоний, относящихся к Е. coli, т. е. к показателям свежего фекального загрязнения; около 35% составляют лактозодефективные бактерии, а остальные не являются санитарно-показательными микроорганизмами.

Испытание выделенных штаммов Е. coli и лактозодефективных на газообразование при 42—43° в глюкозной среде через 4 и 24 часа инкубации посевов показало, что бактерии, типируемые как Е. coli, ферментировали глюкозу с газообразованием за 24 часа в 100% и за 4 часа в 86% случаев. Остальные 14% штаммов этих микроорганизмов за 4-часовой период инкубации ферментировали глюкозу, но без видимых пузырьков газа, которые образовывались к 6 часам. Лактозодефективные штаммы только в 40% случаев дали газообразование за 24 часа и лишь в 6,5% случаев за 4 часа. Газообразующие лактозодефективные штаммы в 22% случаев имели отрицательную реакцию Козера и вырабатывали индол. Согласно последней классификации бактерий семейства Enterobacteriaceae и исследований Минкевича, только эти бактерии можно было отнести к Е. coli.

Для подтверждения данных о стимулирующем действии температуры 42° на рост и размножение санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки и торможении при этом роста других водных микроорганизмов был проведен ряд опытов. Испытаны глюкозный мясо-пептонный бульон, хоттингеровский бульон и розоловая жидкая среда Испытание различных сред показало, что на розоловой среде за 4 часа при 42° вырастает в 172—2 раза больше бактерий Е. coli, чем на хоттингеровском бульоне и на 1% глюкозном мясо-пептонном бульоне.

Сравнение выращивания Е. coli на розоловой среде при 37 и 42° дано на рис. 1, из которого видно, что в первые часы инкубации при 42° создаются наилучшие условия для роста и размножения Е. coli. При 37° также идет размножение Е. coli, но оно значительно отстает во времени (в опыт брали единицы клеток на 1 мл).

Опыт, поставленный с целью выяснения влияния температуры 42° и розоловой среды на рост Е. coli совместно с другими водными микроорганизмами, показал, что при этих условиях в первые 4 часа размножается Е. coli, рост других водных бактерий подавлен (рис. 2). Эти опыты под-

_1_

_ 4

в 10 12 М 16 Часы

lg 20 22

Юмлн.

I

§ ^ 1Л1ЛП i ^ 100000 10000

S ^ юоо

>3

^ 100

Ч асы

Рис. 1. Динамика размножения Е. coli в Рис. 2. Динамика размножения жидкой розоловой среде при различной Е. coli и других водных микроорганиз-температуре. мов в жидкой розоловой среде при

температуре 43°.

/ — Е. coli; 2 — неспоровые палочки; 3 — споровые палочки.

твердили данные, полученные ранее другими исследователями, о том, что наилучшие условия роста Е. coli в первые 4—6 часов инкубации посевов воды создаются при температуре выращивания 42°. При этих условиях рост водных микроорганизмов значительно подавляется.

Следующим этапом исследований было испытание работы элективных сред (Эндо и розоловой) и температуры выращивания 42—43° применительно к изотопному методу. Опыты поставлены по ранее разработанной схеме для изотопного метода, но с некоторым усовершенствованием: мясо-пептонный бульон заменен элективной средой, питательная среда с изотопом распределена по отдельным опытным баночкам не просто пипеткой, а шприц-пипеткой; зараженная вода первоначально внесена в общий сосуд и др. Тест-организмом для постановки опытов служила кишечная палочка. Активность 1 мл среды составляла 2,4-Ю-7 кюри. Измеренная активность с вычетом стерильного контроля и фона указывает на зараженность воды бактериями кишечной палочки. Результаты одного из ряда аналогичных опытов представлены в табл. 1.

Во всех проведенных нами опытах, как и в опыте, результаты которого представлены в табл. 1, метаболическая активность в 3 раза и более превышала неметаболическую, что позволяет считать возможным применение сред Эндо и розоловой для радиоизотопного метода. Вместе с тем опыты не показали особых преимуществ в работе той или иной среды. Учитывая, однако, тот факт, что среда Эндо очень чувствительна к свету и частично теряет при этом ингибиторные свойства, а по принятой нами методике питательная среда с изотопом перед постановкой опыта должна взбалтываться в течение 2—3 часов, мы остановили свой выбор на розоловой среде.

Следующим этапом исследований явилась апробация разрабатываемого нами метода на естественной воде водоемов различной степени загрязненности и установление зависимости между бактериальной загрязненностью исследуемых проб и выделяемой ими радиоактивностью. Для исследования чистых вод с целью концентрирования бактерий испытаны мембран-

ные фильтры (№ 3), диаметр фильтрующей поверхности которых равен 10 мм. Фильтры с осевшими на них бактериями помещают на дно баночек, куда затем вносят шприц-пипеткой изотопную среду и аккуратно перемешивают ее так, чтобы фильтры не всплывали на поверхность среды и не замокли прокладки. Контролем к пробам с мембранными фильтрами являлись посевы испытуемой воды непосредственно в баночки с изотопной средой. При исследовании бактериальной загрязненности естественной воды (р.Москва, Новодевичий пруд) и сточных вод (Кожуховская станция аэрации) получена хорошая корреляция между количеством бактерий группы кишечной палочки, содержащихся в пробе воды, и ее радиоактивностью; с увеличением количества бактерий увеличивается радиоактивность. Таким образом, присутствие других водных микроорганизмов в исследуемых пробах не оказывает существенного влияния на их радиоактивность; только с увеличением количества бактерий кишечной палочки возрастает счет импульсов в минуту, хотя и не строго прямо пропорционально. Это связано, по нашему мнению, с тем, что при значительном содержании бактерий в пробе воды метаболическая активность каждой бактериальной клетки в питательной среде несколько снижается, а за счет этого снижается и общий счет пробы.

Подобная зависимость была установлена нами и в опытах с чистыми культурами кишечной палочки (1968). Результаты исследования воды с применением мембранных фильтров представлены в табл. 2.

С повышением количества бактерий в пробе увеличивается и ее радиоактивность. Вмес-

Таблица 1

Сравнительная характеристика работы сред розоловой и Эндо в изотопном методе

Таблица 2

Зависимость метаболической активности от количества бактерий в воде с применением мембранных фильтров и с непосредственным посевом

Среда Количество бактерий в 1 мл среды1 Активность (в имп/мин)•

общая неметаболическая метаболическая

2 мл розоловой среды -(- бактерии....... 2 мл среды Эндо + бактерии .......... 1 100 1 100 203 176 73 37 130 139

1 Данные о количестве бактерий в опытных чашечках получены из контрольных посевов воды с выращиванием колоний на мембранных фильтрах и с учетом результатов роста через 18 — 20 часов.

• Величина активности является средней из 3 — 4 параллельных определений. Общая активность слагается из метаболической (активность бактерий) и неметаболической (активность изотопной среды).

Метаболичес-

кая актив-

ность

(в имп/мин)

Количество к X

бактерий в я 2

в 1 мл X СО 5 я

о-ш я ° £ ь Я л х * « * о.™ о е-■ 5

«5 о * а * я

>о ■©•

60 15 13

250 48 40

480/450 111 46

550/470 144 49

750/200 179 43

1000/950 213 163

5600/5500 821 448

7600/7500 1 064 945

Примечание. Числитель — количество бактерий в пробе с непосредственным посевом пипеткой, знаменатель — то же с применением фильтров.

те с тем отчетливо видно, что активность проб с применением фильтров несколько меньше активности проб с непосредственным посевом. В некоторых пробах разница довольно значительная; однако это всегда совпадало с всплыванием фильтров на поверхность среды во время инкубации.

На основании анализа литературных данных об изучении возможности применения мембранных фильтров при санитарно-бактериологическом исследовании качества воды и собственного опыта в этой области мы пришли к заключению, что уменьшение активности в пробах воды с применением фильтров связано в основном с некоторой токсичностью фильтров.

Эту разницу можно свести к минимуму при тщательном соблюдении следующих условий. Мембранные фильтры перед использованием должны быть обработаны строго по инструкции. Изотопную среду надо вливать в опытные баночки так, чтобы фильтры не всплывали на поверхность среды. Следует тщательно и аккуратно перемешивать среду с бактериями, для того чтобы фильтры не упали в среду, а среда не попала на адсорбирующую прокладку.

Выводы

1. Специфичность радиоизотопного метода для ускоренного определения кишечной палочки в воде обеспечивается применением элективных сред (Эндо или розоловой), использованием температуры выращивания посевов 42° и времени инкубации посевов около 4 часов. Среды Эндо и розоловая пригодны для радиоизотопного метода.

2. Проверка радиоизотопного метода на естественной воде водоемов различной степени загрязненности показала, что присутствие других водных микроорганизмов в исследуемых пробах не влияет существенно на радиоактивность пробы. Только с увеличением количества санитарно-по-казательных кишечных палочек возрастает радиоактивность пробы.

3. Радиоизотопный метод может быть использован для анализа воды водоемов'различной степени загрязненности, сточных, а также питьевых вод. При анализе малозагрязненной воды необходимо концентрирование бактерий.

4. Применение мембранных фильтров в радиоизотопном методе" для концентрирования на них бактерий требует тщательной обработки фильтров перед их использованием.

ЛИТЕРАТУРА

КоршЛ. Е., ЖевержееваВ. Ф., Егорова С. Г. Гиг. и сан., 1968, № 3, с. 54. — МинкевичИ. Е. Бактерии группы кишечной палочки, как санитарно-псказа-тельные организмы. М., 1949. — СтраховаВ. А. В кн.: Вопросы санитарной бактериологии. М., 1948, с. 126.

Поступила 31/Ш 1969;г.

УДК 614.73-07

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ САНИТАРНО-ДОЗИМЕТРИЧЕСКОГО

КОНТРОЛЯ

Е. Ф. Черкасов, И. П. Коренков, В. Ф. Кириллов

Кафедра общей гигиены I Московского медицинского института йм. И. М. Сеченова

Служба радиационной безопасности страны накопила богатый опыт организации и проведения санитарно-дозиметрического контроля в различных отраслях народного хозяйства, где применяются радиоактивные вещества и источники ионизирующих излучений. В результате значительно повысилось качество предупредительного и текущего санитарного надзора, что в свою очередь повлекло за собой дальнейшее улучшение радиационной обстановки на всех этапах использования радиоактивных веществ.

Вместе с тем непрерывно расширяющиеся сферы применения радиоактивных веществ, изменение характера их использования приводят, с одной стороны, к усложнению задач и методов санитарно-дозиметрического контроля, с другой — к росту сети радиологических групп в составе санэпидстанций, что диктует необходимость разработки единых принципов подхода к осуществлению санитарно-дозиметрического контроля.