CC BY
6
тайного способа не мешают определению пестицидов, так как на хромато-грамме они не проявляются.
Предлагаемый способ идентификации может быть применен также для обнаружения на тонкослойных хроматограммах п-нитрофенола, 2,4-динит-рофенола и динока, которые после обработки нингидриновым реактивом имеют соответственно красный, серо-зеленый и серо-черный цвета пятен.
Величины Rf некоторых нитрофенольных пестицидов на силикагеле марки КСК
и окраска пятен
Величина Rf Чувствительность реакции (в мкг)
Пестицид хлороформ н-гексан — ацетон (4:1) Окраска пятна
Акрекс..... Каратан .... Диносеб .... 0,78—0,03 0,79—0,03 0,28—0,03 0,48^0,02 0,49—0,02 0,03±0,01 1 2 2 Малиновая Сиреневая Серо-черная
Пластинки для хроматографирования в случае применения указанного способа приготовляют следующим образом. Стеклянные пластинки размером 9x12 см2 тщательно моют раствором соды и хромовой смесью, а затем водой, сушат и протирают органическим растворителем (эфир, ацетон, спирт). 14 г силикагеля марки КСК, размолотого и просеянного через сито 100 меш (размер пор 0,15 мм), смешивают в ступке с 1,5 г сернокислого кальция (CaS04-2H20), предварительно просушенного при 180° в течение 24 часов и просеянного, прибавляют 1 г просеянной цинковой пыли и суспендируют смесь в ступке в 40 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию, периодически помешивая, равномерно наносят на 6—7 пластинок. Сушат их при комнатной температуре в течение 17—18 часов, а хранят в эксикаторе над слоем осушителя.
Перед приготовлением раствора продажный нингидрин перекристал-лизовывают. Для этого 5 г препарата растворяют в 25 мл 2 н. раствора соляной кислоты и добавляют 1 г активированного древесного угля марки БАУ. Раствор с углем нагревают до кипения, горячим фильтруют через стеклянный фильтр №2, 3. Фильтрат оставляют для кристаллизации на 4 часа при комнатной температуре, затем на ночь в холодильнике. Кристаллы собирают на стеклянном фильтре, промывают водой и высушивают на воздухе. Перекристаллизованный нингидрин хранят в темной склянке. Чувствительность реакции составляет 1—2 мкг препарата.
ЛИТЕРАТУРА
Беленький Б. Г. Физико-химические методы изучения анализа и фракционирования биополимеров. М.— Л., 1966, с. 136.— Шмигндина А. М. В кн.: Гигиена и токсикология. Киев, 1967, с. 298.— Boggs Н. М., J. Ass. off. agrie. Chem., 1964, v. 47, p. 346.
Поступила 27/XI 1969 г.
УДК 628.312.3:628.445]:543.3
ПРИМЕНЕНИЕ С14 ДЛЯ УСКОРЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК В ВОДЕ
Канд. мед. наук Л. Е. Корш. и О. И. Юрасова, А. Г. Никонова, М. А. Мо-
това
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Практика санитарной службы настоятельно требует разработки таких методов определения числа кишечных палочек в воде, которые резко сократили бы сроки исследований. Разработанный нами метод ускоренной оцен-
ки числа кишечных палочек в сточной воде принципиально отличается от методов, используемых повседневно лабораториями санэпидстанций. В основу его положен принцип оценки числа кишечных палочек в пробе по количеству метаболической двуокиси углерода, выделяемой в результате их жизнедеятельности из элективных сред, меченных С14. Этот принцип заимствован нами из работ Levin и соавт. Как известно, при определении количества кишечных палочек в воде этим методом необходимо учитывать величину не только метаболической, но и неметаболической двуокиси углерода (J1. Е. Корш и соавт.; Scott и соавт.).
Целью наших исследований являлось построение калибровочных графиков, при помощи которых было бы возможно быстро оценить количество кишечных палочек, содержащихся в пробе. Мы находили зависимость величины метаболической двуокиси углерода от количества бактерий Е. coli, внесенных в пробу. При этом учитывалась и неметаболическая двуокись углерода.
В качестве метки избирательных сред использовали глюкозу-1-6, меченную С14, вносимую в количестве МО~ь мг на 1 мл среды. Избирательными средами были жидкие среды — розоловая и Эндо, для которых основным углеводным компонентом является лактоза, вносимая в количестве 4 мг на 1 мл этих сред.
Перед постановкой опыта стерильную, меченную С14 розоловую среду или среду Эндо с pH 7,4-^-7,8 и удельной активностью 1-Ю"7 кюри/мл готовили к опыту, встряхивая на механической качалке в течение 2 часов. Подготовленную среду стерильно разливали по 2 мл в стальные чашки, куда сеяли десятки, сотни, тысячи или десятки тысяч клеток Е. coli чистой культуры 1. Чашки с посевом закрывали стерильными стеклами и ставили в термостат для подращивания бактерий при 42°. Через bxlz часов чашки вынимали из термостата, заменяли стекла стальными крышками. При этом на крышке закрепляли фильтр из хроматографической бумаги, смоченной насыщенным раствором ВА (ОН)2. Затем чашки с фильтрами ставили в термостат снова, через 30 мин. нх вынимали, а фильтры подсушивали под инфракрасной лампой в течение 15 мин.
С целью контроля неметаболической двуокиси углерода ставили параллельный опыт на стерильной среде с меткой. Кроме того, контролировали обсемененность опытных чашек до подращивания бактерий, используя метод засева на чашки. Подсушенные фильтры во всех вариантах опыта поступали на измерение скорости счета на пересчетное устройство типа Б-3 со счетчиком Т-25-БФЛ. Для этой аппаратуры эффективность счета по С14 равна 5%, а коэффициент, характеризующий ослабление изучения в слое фильтра, равен 3.
Каждый вариант опыта имел 5—6 повторностей, а всю серию опытов отдельно для розоловой среды и среды Эндо повторяли 2—3 раза. Результаты исследования обрабатывали вариационно-статистическим методом с вероятностью 90%; в возможных случаях выводили средние величины, опредедяли доверительные интервалы средних.
Установленные для каждого варианта опытов скорости счета фильтров за вычетом фона в неметаболической двуокиси углерода сравнивали с количеством бактерий Е. coli, внесенных в пробу. Результаты оценки величин метаболической двоукиси углерода в зависимости от количества бактерий, внесенных в пробу, представлены в табл. 1 и на рисунке. При построении графика использовали двойной логарифмический масштаб, на оси ординат откладывали количество метаболической двуокиси углерода на фильтре, а на оси абсцисс — количество клеток Е. coli, внесенных в пробу.
Результаты исследования, представленные на рисунке и в табл. 1, свидетельствуют о возрастании количества метаболической двуокиси угле-
1 Как правило, чистая культура была выделена из естественных водоемов и сохранялась в лаборатории в течение 2—3 месяцев.
Таблица 1
Количество метаболической двуокиси углерода на фильтре при различном количестве бактерий Е. coli в пробе
Розоловая среда Среда Эндо
количество клеток Е. coll, вносимых в пробу величина метаболического С14 (в имп/мин) тср±4шм количество клеток E-coll, вносимых в пробу величина метаболического с» (в имп/мин) тср±!тм
30-Н34 76 170-г 180 430-г 730 9004-2 000 16—5,9 38,6—7 1292:32 4342:180 1 360—333 « 10 23-7-70 440-г 770 460-Т-510 3 000 3 500-^5 400 17 000 9,2^: 1,3 39,52: 10,6 130,9—17,3 209—63 880—137 1 420^153 1 755^123
У и МП/мин Ю3
рода на фильтре при увеличении количества бактерий Е. coli в пробе. Видно также, что установленные зависимости прямолинейны и почти аналогичны для розоловой среды и среды Эндо. Однако начальные уровни зависимостей для 2 сред различны. В частности, начальные величины метаболической двуокиси углерода для среды Эндо установлены при наличии 10 бактерий в пробе, а для розоловой среды — при количестве бактерий, большем в 3—4 раза.
Различие в начальном уровне зависимостей оказалось не случайным. При статистической обработке мы установили достоверность разности средних величин выделения метаболической двуокиси углерода из розоловой среды и среды Эндо для десятков микробных клеток. В частности, на кривой
распределения ¿при 11 степенях свободы значение t для 2% уровня значимости должно быть 2,718, а в нашем случае оно соответствовало 2,9 (Б. Бейли). Большую чувствительность метода, установленную нами для среды Эндо по сравнению с розоловой, можно объяснить различным химическим составом той и другой, обусловливающим меньшую растворимость двуокиси углерода в среде Эндо, чем в розоловой среде. По результатам исследования, представленным в табл. 1 и на рисунке, можно рассчитать, что одной бактерии Е. coli соответствует величина метаболического С14 0,3—0,6 имп/мин.
Установленные нами калибровочные зависимости затем были проверены на сточной воде с параллельным контролем количества бактерий в анализируемой воде методом засева на чашки с розоловым агаром. Порядок работы в этих исследованиях был аналогичен схеме опытов по оценке величин метаболической двуокиси углерода. Сточную воду перед анализом разбавляли, использовали.разведения 1 : 10 и 1 : 100. В опытные чашки сеяли 0,3 или 0,5 мл различных разведений сточных вод. Весь анализ воды ускоренным методом производили в течение 6 часов.
Результаты исследования сточных вод этим методом представлены в табл. 2. Табл. 2 указывает на возрастание метаболической двуокиси углерода на фильтре при увеличении количества фекальной загрязненности стоков. Кроме того, видно, что результаты оценки количества бактерий Е. coli по градуировочным зависимостям отличаются от тех, которые получены засевом на чашки, приблизительно в 172 раза.
Несоответствие в оценке количества микроорганизмов, установленное 2 разными методами, можно объяснить неточностью микробиологического
Лол и честбо микробных клеток
Накопление метаболического С14 на фильтре при увеличении количества
бактерий Е. coli в пробе. / — розоловая среда: 2 — среда Эндо.
подсчета числа бактерий. В частности, в исследованиях Novel и др. по количественной оценке бактерий с условием предварительного разведения исходного материала показана возможность ошибки определения
до 200% за счет технических погрешностей в работе.
Учитывая неточность микробиологического подсчета бактерий, можно допустить определение их количества при данном методе по зависимостям, установленным при градуировке метода на чистой культуре. Чувствительность ускоренного метода для среды Эндо равна 10 и для розоловой среды равна 30—40 бактериям кишечной палочки в пробе.
ЛИТЕРАТУРА
Б е й л и Н. Статистические методы в биологии. М., 1963.— К о р ш Л. Е., Егорова С. Т., Жевержеева В. Ф. Гиг. и сан., 1968, № 3, с. 54 — Levin G. V., Harrison V. В., Hess W. S., J. Am. Water Works Ass., 1956, v. 41, p. 75.— Novel E., Mitt Lebensnitt. Hyg., 1969, Bd 60, S. 121,—Scott R. M., Seiz D., Shaughnessy H. J., Am. J. publ. Hlth., 1964, v. 54, c. 827.
Поступила 2/XII 1970 r.
ОБЗОРЫ
УДК 613-074:543.544(047
ПРИМЕНЕНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
В. А. Вороненке, канд. мед. наук Ю. В. Новиков Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Газовая хроматография, внедряемая в практику гигиенических исследований, открывает широкие возможности для разделения смесей веществ на отдельные компоненты, позволяет проводить идентификацию веществ, определять количественный состав и выделять отдельные фракции компонентов. С помощью капиллярных и высокоэффективных набивных колонок удается достичь такого разделения, которого нельзя получить другими методами. Поэтому газовый хроматографический анализ дает в руки гигиенисту важный инструмент, ибо в объектах внешней среды (воздух производ-
Таблица 2
Результаты исследования сточных вод ускоренным методом
Разведение Количество метаболической двуокиси углерода Количество бактерий Е. coll
объем исследуемой воды (в мл) розоловый агар по градуиро-вочным зависимостям
1 : 1 000 8,6—4 —30 40
0,3
1 : 100 11,8±2,3 — 100 60
0,3
1 : 100 330±36 —2 000 800
0,3
1 : 10 2 250^220 —8000 6000
0,3
