Применение реликтовых архебактерий как потенциальных микробиологических объектов в замкнутых экосистемах Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

5РАСЕ\Л№Г

Применение

реликтовых архебактерий как потенциальных микробиологических объектов в замкнутых экосистемах

Верещак С.Н.

Беларусь, г. Минск,

бюро «Технологичные экосистемы»

управления перспективных разработок ЗАО «<Струнные технологии»»

Парфенчик М.М.

Беларусь, г. Минск,

бюро «Технологичные экосистемы»

управления перспективных разработок ЗАО «<Струнные технологии»»

424

УДК 579.695

99

Описаны открытые в конце XX в. архебактерии, обладающие уникальными для микроорганизмов строением клетки, биохимическими свойствами, а также способностью осуществлять жизнедеятельность в окружающей среде с экстремальными параметрами (высокие температура, кислотность или концентрация солей). Применение данных особенностей архебактерий целесообразно для переработки отходов в условиях замкнутых систем ЭкоКосмоДома (ЭКД). Начат отбор проб для микробиологического анализа и внесены специальные закваски в экспериментальный биоколлектор с целью изучения процессов разложения органического вещества архебактериями метаногенами.

Ключевые слова:

архебактерии, метаногенные бактерии, микроорганизмы-экстремофилы, промышленная микробиология, систематика архей, экобиотехнология, ЭкоКосмоДом (ЭКД).

Введение

Ещё в 1977 г. благодаря работам американских учёных К. Вёзе и Г. Фокса стало известно об уникальных бактериях, принципиально отличающихся по составу генома, строению и среде обитания от обычных бактерий [1, 2]. Особенные микроорганизмы назвали архебактериями (от лат. Archaea, от др.-греч. архаю^ - «извечный, древний, первозданный, старый»). Открытие произошло при изучении молекулярно-биохимических свойств биополимеров клеток различных видов бактерий. Архебактерии были выделены в отдельную группу, так как последовательность нуклеотидов в ЮБ-рРНК у них кардинально разнилась от других микроорганизмов.

Основные отличия архебактерий [1, 2]:

• среди них нет выявленных патогенных и паразитических форм;

• для питания могут использовать отходы жизнедеятельности микро- и макроорганизмов, а также человека;

• занимают необычные экологические ниши (недоступные другим организмам биосферы), по условиям окружающей среды относящиеся к экстремальным: температура воды до 110 °С при давлении в десятки и сотни атмосфер; высокие кислотность (pH 1-5), щёлочность (pH 9-11) и солёность среды (массовая доля соли в растворе может достигать 25-30 %) [3];

• имеют некоторые особенности генома и строения клеток по сравнению с истинными бактериями (эубакте-риями): отсутствие муреина в клеточной стенке; другая ли-пидная структура клеточной мембраны; иная морфология клеток; определённая система рибосомального синтеза белка; отличие тРНК и геномной ДНК от таковых у эубак-терий; сходство с геномом эукариотических организмов; уникальная биохимическая и биосинтетическая специфика группы [1, 2].

По мнению ряда учёных, архебактерии могут являться первыми живыми организмами на Земле, когда ещё в атмосфере не было свободного кислорода, а на поверхности планеты протекала активная геотермальная и вулканическая деятельность, связанная с выбросом паров серы и перегретой воды с растворёнными в ней кислотами, солями или щелочами. К таким условиям и приспособлены архебактерии - экстремально термофильные, галофильные и ацидофильные микроорганизмы.

Перечисленные свойства позволяют безопасно использовать архебактерии в ЭкоКосмоДоме (ЭКД) - замкнутой биологической системе с полным циклом превращения веществ [4] - для переработки отходов самых разных типов [5-11].

На основании вышеизложенного авторам статьи представляется перспективным направлением изучение возможности применения уникальных микроорганизмов-экстремофилов в условиях замкнутой биосферы ЭКД [4] с позиций биопереработки органических отходов. Цель данной работы - исследование особых способностей архебактерий: рост в экстремальной среде, отсутствие необходимости в кислороде для жизнедеятельности, получение органических веществ при использовании различных соединений, в том числе соединения неорганической серы. Имеет научный интерес разработка технологии задействования архебактерий в замкнутых циклах как источника новых биологически активных соединений, белков, ферментов, экзополисахаридов, а также в качестве биодегра-дантов в условиях ЭКД.

Классификация архебактерий

Согласно второму изданию «Руководства Берджи по систематической бактериологии» [12] для классификации прокариот применяется система, основанная на сравнении последовательности нуклеотидов в lüS-рРНК. В указанном справочнике учитывается также организация геномов прокариот в сочетании с фенотипическими особенностями; в итоге прокариоты отнесены к доменам Bacteria и Archaea [12].

В соответствии с наиболее признанной и используемой искусственной классификацией, представленной

в девятом издании «Определителя бактерий Берджи» [13], бактерии разделены на четыре отдела: вгасШмез - грам-отрицательные эубактерии; ТепепШеБ - эубактерии, лишённые клеточной стенки; РгтюМеБ- грамположитель-ные эубактерии; МепбожМез - архебактерии, клеточные стенки которых принципиально отличаются от аналогичных структур других прокариот (клеточная стенка не содержит муреин).

В настоящее время к архебактериям отнесены экстремальные термофилы, термоацидофильные микоплазмы, экстремально галофильные бактерии, метаногенные, анаэробные серовосстанавливающие бактерии, метаболизиру-ющие молекулярную серу, а также некоторые малоизученные некультивируемые термофильные архебактерии [1, 2].

Систематика архей отражена в таблице 1.

Из данных групп микроорганизмов наибольший интерес представляют метаногенные бактерии и галофильные архебактерии, обладающие уникальной способностью бесхлорофильного фотосинтеза. По мнению некоторых учёных, это сохранённая древняя форма фотосинтеза, основанная на светозависимых превращениях каротиноидных пигментов [1, 2].

Микроорганизмы-экстремофилы в промышленной биотехнологии служат источником новых биологически активных соединений, белков и ферментов, экзополисаха-ридов с уникальными свойствами. В промышленной биотехнологии нашли своё применение ацидофильные серо-восстанавливающие и алкалифильные микроорганизмы. Уже не одно десятилетие для выработки метана из отходов животноводческих комплексов в специальных биореакторах используются метаногенные бактерии [8-11].

Описание метода

Культивирование архебактерий

Большинство архебактерий не поддаются культивированию в обычных условиях. Именно поэтому до настоящего времени рассматриваемый домен был изучен недостаточно широко с точки зрения лабораторного выращивания.

Таблица 1 - Систематика архей

Таксон Название

Надцарство (домен) Archaea

Филогенетические ветви Crenarchaeota Euryarchaeota Korarchaeota

Группы

Метаногенные архебактерии: роды Methanobacterium, Methanosarcina, Methanospirillum, Methanobacillus и др.

Анаэробные сульфатредуцирующие (серовосстанавливающие) архебактерии: род Archaeoglobus - A. fulgidus, A. profundus

Экстремально термофильные и гипертермофильные архебактерии, метаболизирующие серу: род Sulfolobus- S. brierley, сем. Thermococcales, сем. Thermoproteales, роды Acidianus, Pyrodictium - P. occultum

Архебактерии, лишённые клеточной стенки (термоацидофильные микоплазмы): Thermoplasma acidophilum

Экстремально галофильные архебактерии (галобактерии): роды Halococcus, Halobacterium, Haloarcula, Natronobacterium, Natronococcus Малоизученные некультивируемые термофильные архебактерии

Культивирование архебактерий сопряжено с организацией специфических условий роста и жизнедеятельности: практически полное отсутствие кислорода, сложные питательные смеси, особые требования к температуре и освещению. На практике, в обычной среде, люди достаточно давно используют свойства такой группы, как метаноген-ные архебактерии. В специальных герметичных биореакторах, куда закладывается смесь органических отходов и воды, формируется анаэробная среда вследствие применения бактериями кислорода и начала процессов брожения. По мере протекания брожения происходит накопление его продуктов: органических кислот, углекислого газа, водорода, спиртов. Эти метаболиты ингибируют брожение, и процесс остановился бы, если бы образованные вещества не являлись субстратами для архебактерий. На данном этапе подключение метаногенных архей позволяет завершиться процессу бескислородного биоразложения органики. Деятельность метаногенов можно описать общей формулой:

CO2 + H2O ^ CH4 + 2H2O.

Реализация эксперимента

Планируется изучение экспериментальных результатов по жизнедеятельности метаногенных бактерий в условиях подземного коллектора, созданного под домом на базе Крестьянского (фермерского) хозяйства «Юниц-кого» (КФХ «Юницкого»). Данный тип сооружения можно отнести к установке анаэробной очистки сточных вод.

В системах аэробной очистки применяется перемешивание, механическая подача воздуха или технического кислорода на дно аэротенка.

Анаэробная очистка - процесс сбраживания высококонцентрированных сточных вод, осуществляемый микроорганизмами в отсутствии кислорода (в анаэробных условиях), в результате чего образуется горючий биогаз. Он представляет собой смесь, состоящую из 65 % метана, 30 % СО2, 1 % И2Я 4 % смеси И2, 02, Н2 и СО (угарного газа) [9]. В основе выделения биогаза лежит процесс метанового брожения, или биометаногенез.

Преобладающими группами микроорганизмов мета-ногенного сообщества являются гидролитические, бродильные, синтрофные, метановые бактерии. Они последовательно выполняют стадии анаэробного брожения. Между группами микроорганизмов имеются взаимосвязи. Из-за субстратной специфичности развитие метаногенов зависит от бактерий предыдущих стадий.

По количеству видов в метаногенном сообществе преобладают обычные анаэробные ферментирующие

бактерии (эубактерии): их в 10 раз больше, чем метанобра-зующих. Из 300 видов анаэробных микроорганизмов метан вырабатывают около 30 видов [9].

В метаногенном биоценозе наблюдаются тесные сим-биотические связи между различными микроорганизмами, происходит последовательное сбраживание органического вещества, причём продукты жизнедеятельности одних бактерий являются субстратами для других.

Многие бактерии не принимают участия в биодеградации органических веществ, однако способны выделять в окружающую среду факторы роста или удалять из системы токсичные продукты метаболизма иных бактерий.

Факультативные анаэробы в метанногенном сообществе могут использовать случайно попавший в среду кислород, тем самым поддерживая строгие анаэробные условия, так как кислород ингибирует метаболизм метаногенных бактерий.

Метанобразующие бактерии морфологически достаточно разнообразны, однако их объединяют два общих признака:

• эти бактерии являются облигатными анаэробами;

• они способны образовывать метан.

Все метанобразующие бактерии относятся исключительно к архебактериям [9].

Известно более 45 видов метаногенов, принадлежащих к 13 родам: МеМапоЬа^ег, МеМапоооооиз, МеМа-подепит, МеМапозаопа, МеМапоМпхи др. Метаногенные бактерии всегда обитают в сложных по составу микробных сообществах, где представляют конечное звено в распаде сложных органических веществ.

Другие члены сообщества осуществляют подготовительные этапы для метаногенеза:

• сбраживание мономеров до органических кислот, спиртов;

• превращение кислот и спиртов в ацетат, С02, Н2.

Одна треть метанобразующих бактерий в природе

получает энергию в процессе окисления водорода, который является донором электронов, при этом происходит сопряжённое восстановление углекислоты. По типу питания они характеризуются как хемоавтотрофные метаногены:

4H2 + CO2 ^ 2H2O + CH4.

Две трети метана формируется за счёт превращений ацетата (уксусной кислоты):

СН3С00Н + 2Н2 ^ СН4 + 2Н20 + 3С02.

При анаэробном разложении сложных органических веществ более 70 % метана образуется из ацетата.

Метаногенные бактерии 90-95 % используемого углерода преобразуют в метан, и только 5-10 % углерода расходуется на прирост биомассы. На интенсивность анаэробного превращения органических веществ в метан влияют:

• скорость гидролитического расщепления биополимеров (если они содержатся в перерабатываемом сырье в большом количестве);

• скорость трансформации ацетата в метан, что связано с низкими темпами роста и размножения синтрофных и метаногенных бактерий.

При 35 °С время удвоения биомассы гидролитических микроорганизмов составляет 10-20 ч; кислотогенов - 1-10 ч, синтрофных (ацетогенных) бактерий - около 100 ч, ассимилирующих водород метаногенов - 15-100 ч. К сооружениям анаэробной очистки относятся септиктенки, осветли-тели-перегниватели, контактные резервуары, анаэробные лагуны, метантенки, биофильтры.

Общая схема процессов, происходящих при анаэробном сбраживании в системах очистки сточных вод, отображена на рисунке 1 [9].

Типичным примером сооружений анаэробной очистки являются септиктенки (септики) - распространённые сооружения для индивидуальных домохозяйств. Они работают автономно, не нуждаются в электропитании. Септики применяются при количестве воды не более 25 м3/сут.

Септиктенк представляет собой аппарат, состоящий из двух частей (рисунок 2).

Продолжительность нахождения воды в септике -3-4 суток.

При разложении органических веществ объём осадка уплотняется. Ил периодически (обычно один раз в год) удаляют, но часть его оставляют для поддержания работы септика.

Большинство септиков работают без обогрева при температуре менее 20 °С.

Таким образом, исследование проводилось и будет продолжаться в коллекторе дома № 12 на базе КФХ «Юниц-кого», представляющего собой мини-отель.

Коллектор - подземный резервуар с проницаемыми для корней растений стенками. Он размещён в субтропическом саду внутри дома на глубине 2 м, в котором стоки из туалетов (7 шт.) и кухни (включая стиральную и посудомоечную машины) последовательно впитываются в фильтрующие слои органики, где происходит разложение органического вещества сточных вод до полной его минерализации. Сверху коллектор засыпан плодородной почвой, в которую через корневую систему и почвенные

Гидролиз

(липолитические, протеолитические и целлюлолитические бактерии)

Аминокислоты, сахара

Кислотогенез (бактерии-бродильщики)

Летучие жирные кислоты и спирты .ш

Ацетогенез (водородообразующие синтрофные бактерии)

Ацетат/водород

Метаногенез (метаногенные бактерии)

Метан/С02

Рисунок 1 - Схема процессов, происходящих при анаэробном сбраживании (метаногенезе)

//I п

Рисунок 2 - Септиктенк (септик): 1 - отстойная часть (осветление воды осуществляется из-за движения её с малой скоростью); 2 - септическая часть (расположена под первой, в ней происходит перегнивание осадка при хранении его в течение 6-12 месяцев)

капилляры проникает снизу очищенная вода с растворёнными в ней минеральными солями - конечным продуктом жизнедеятельности бактерий-очистителей (рисунок 3). Избыточная вода по наружной системе канализации поступает во внешний пруд-накопитель.

Исследование запланировано в два этапа. На первой стадии начато изучение микробиологических показателей образцов сточной жидкости из коллектора и оценивание необходимости искусственного обсеменения коллектора культурой бактерий-метаногенов (в случае если естественное обсеменение не произошло). Начальные результаты продемонстрировали значительное снижение бактериальной обсеменённости в воде при выходе из коллектора по сравнению со сточной водой в самом резервуаре коллектора (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, происходит последовательное снижение численности бактерий - сначала в 150 раз, затем в 1000-2000 раз. Такое значительное уменьшение количества бактерий говорит об очистке воды, так как минерализация органического вещества вследствие его разложения приводит к отсутствию кормовой базы для гнилостных и бродильных бактерий и, как результат, к падению их численности.

На втором этапе планируется заселить наработанную культуру метаногенных архебактерий в коллектор дома и продолжить исследования. Основным параметром эффективности работы бактерий-деструкторов органики и метаногенных бактерий станет показатель биологического потребления кислорода, или бактериального потребления кислорода, который будет задействован для оценки интенсивности роста и размножения бактерий и, соответственно, как критерий эффективности очистки сточных вод и разложения органического материала. Опосредованно данный показатель укажет и на работу метаногенных бактерий.

Выводы

и дальнейшие направления исследования

Авторами рассмотрено надцарство микроорганизмов -архебактерии, обладающие уникальными характеристиками, отличными от признаков обычных бактерий, и обитающие в экстремальных экологических условиях подземных геотермальных горячих источников, сверхсолёных, кислых или щелочных водах, а также в глубине

Таблица 2 - Микробиологические показатели образцов из коллектора

Номер образца Место и дата отбора Количество микроорганизмов в 1 мл

1 Сточная вода из канализации, поступающая в резервуар коллектора (отбор пробы 30.04.2020) 1,5 х 1010 КОЕ/мл

2 Коллектор под домом № 12, центральный резервуар (отбор пробы 30.04.2020) 1 х 109 КОЕ/мл

3 Коллектор под домом № 12, люк аварийного сброса (отбор пробы 01.06.2020) 5 х 105 КОЕ/мл

4 Коллектор под домом № 12, люк аварийного сброса (отбор пробы 07.07.2020) 1 х 106 КОЕ/мл

торфяных болот, иле на дне водоёмов, очистных сооружениях сточных вод, пищеварительном тракте травоядных животных.

Такое разнообразие экологических свойств данной группы микроорганизмов позволяет рассматривать их в качестве объекта перспективного направления при создании замкнутых циклов внутри ЭКД. Планируется произвести анализ промышленно используемых микроорганизмов из указанной группы, осуществить поиск в условиях на-тивной природы для формирования коллекции штаммов архебактерий, заложить опыт по получению биогаза ме-таногенными архебактериями с помощью биореакторной установки, изучить потенциал отобранных штаммов для применения в ЭКД.

Проведённые микробиологические исследования биологического коллектора, созданного под домом на базе КФХ «Юницкого», выявили значительное снижение бактериальной обсеменённости на выходе сточных вод, что косвенно способно указывать на эффективную очистку воды от органических контаминантов. В анаэробных условиях подобный процесс возможен, когда в нём на последней фазе участвуют метаногенные архебактерии. Дальнейшее исследование включит в себя обогащение микрофлоры коллектора культурой метаногенов, наработанной из естественных источников, а также изучение изменения микробиологической обсеменённости очищенной воды. Кроме этого, будет анализироваться показатель биологического потребления кислорода, который прямо покажет эффективность очистки сточных вод и разложения органического материала сообществом микроорганизмов с участием метаногенных архебактерий.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод о целесообразности функционирования архебактерий в замкнутом цикле ЭКД, что позволит дополнить цепи переработки органических отходов, а также благодаря уникальным приспособленческим свойствам данной группы микроорганизмов изучить возможность их использования в условиях, связанных с созданием замкнутых систем ЭКД в космическом пространстве.

Среди архебактерий не имеется выявленных патогенных видов, а их жизнедеятельность не обусловлена выработкой токсичных для человека соединений, т. е. она экологична, что считается приоритетным фактором для Эко-КосмоДома. ЭКД - замкнутая система, и применение реликтовых архебактерий с уникальными свойствами поможет поднять уровень поддержания экологического баланса, а также повысить безопасность технологий биопереработки органических отходов.

Литература

1. Лысак, В.В. Микробиология: учеб. пособие / В.В. Лысак. -Минск: БГУ , 2008. - 343 с.

2. Лысак, В.В. Систематика микроорганизмов/В.В. Лысак, О.В. Фомина. - Минск: БГУ,2014. - 304 с.

3. Gerday, C. Physiology and Biochemistry of Extremophiles / C. Gerday, N. Glansdorff. - Washington: ASM Press, 2007. -429 p.

4. Юницкий, А.Э. Струнные транспортные системы: на Земле и в Космосе: науч. издание/ А.Э. Юницкий. - Силакрогс: ПНБ принт, 2019. - 576 с.: ил.

5. Rampelotto, P.H. Biotechnology of Extremophiles / P.H. Rampelotto. - Cham: Springer International Publishing, 2016. - 720 p.

6. Кузнецов, А.Е. Научные основы экобиотехнологии:учеб. пособие/А.Е. Кузнецов, Н.Б. Градова. - М.: Мир, 2006. -504 с.

7. Extremophiles [Electronic resource]. - 2020. - Mode of access: https: //link.springer.com/journal/792. - Date of access: 24.07.2020.

8. Ручай, Н.С. Технология микробного синтеза: электронный курс лекций / Н.С. Ручай, И.А. Гребенчикова. -Минск: БГТУ, 2014. - 168 с.

9. Пучкова, Т.А. Микробиологическая очистка сточных вод: курс лекций [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www. bio. bsu. by/microbio/files/presentations/ puchkova/microbiol_ochistka_vody.pdf. - Дата доступа: 24.07.2020.

10. Glazer, A.N. Microbial Biotechnology. Fundamentals of Applied Microbiology/A.N. Glazer, H. Nicaido. - 2nd ed. -Cambridge: Cambridge University Press, 2012. - 554 p.

11. Okator, N. Modern Industrial Microbiology and Biotechnology / N. Okator, B.C. Okeke. - New Hampshire: CRC Press, 2017. - 551 p.

12. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Editorin-Chief G.M. Garrity. - New York: Springer, 2001-2003. -Vol. 1-5.

13. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. /под ред. Дж Хоулта [и др.]. - М.: Мир, 1997. - Т. 1-2.