CC BY
0
УДК 616.48-576.851.49
Мaмaтовa М.Н. и.о. профессорa
тфедра клинической лaборaторной дшгностики с курсом клинической лaборaторной дшгностики ФПДО
Шaйкулов Х.Ш. стaрший преподaвaтель тфедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Исокуловa М.М. aссuстент
тфедра клинической лaборaторной дшгностики с курсом клинической лaборaторной дuaгностuкu ФПДО Сaмaркaндскuй госудaрственный медицинский университет
Узбекuстaн, Сaмaркaнд
ПРИМЕНЕНИЕ РЕAКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМAГГЛЮТИНAЦИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ AНТИТЕЛ К СТAФИЛОКОККОВОМУ
ТОКСИНУ
Резюме. Проведенные испытания показали, что наилучшие условия для сенсибилизации эритроцитов создаются при следующем режиме: равные объемы танизированных эритроцитов и нативного токсина в разведении 1:160 смешивали и выдерживали при 370 С в течение 2-3 часов и затем в рефрижераторе при 40 С в течение 18-20 часов.
Результаты проведенных испытаний показали, что прогревание токсинов практически не влияло на их сенсибилизирующую активность по отношению к эритроцитам: танизированные эритроциты, сенсибилизированные токсинами прогретыми 56, 60 и 1000 С, проявляли примерно одинаковую активность и реагировали с противостафилококковой сывороткой почти в таких же разведениях, как и танизированные эритроциты, сенсибилизированные нативным стафилококковым токсином.
Ключевые слова: сенсибилизации эритроцитов, агглютинин, раствор формалина, антитоксин, иммунитет, анатоксин, стафилококковый токсин.
Mamatova M.N. acting professor
Department of Clinical Laboratory Diagnostics with the course of clinical laboratory diagnostics of the Faculty of Postgraduate Education
Samarkand State Medical University
Shaykulov H.Sh. senior lecturer
Department of Microbiology, Virology and Immunology
Samarkand State Medical University
Isokulova M.M. assistant
Department of Clinical Laboratory Diagnostics with the course of clinical laboratory diagnostics Faculty of Postgraduate Education Samarkand State Medical University Uzbekistan, Samarkand
Tm USE OF indirect НЕМAGGLUTINATЮN REACTION FOR DETERMLNATION OF ANTIBODIES ТО STAPHYLOCOCCUS
ТОХШ
Summary. The authors determined conditions providing sensitization of formalinized sheep erythrocytes with staphylococcus toxin: 2-hour exposure at 370 С and a subsequent 18-hour exposure at 40 С of 2,5% suspension of tannated erythrocytes with a crude toxin in 1:160 dilution (Lh 0,15 ml-an initial characteristics of the toxin). The activity of the preparation was preserved for 3 months with 1% formalin solution. Clumping of sensitized erythrocytes was specifically inhibited by addition of crude or heated toxin to the serum. Toxin samples heated at 56, 60 and 1000 С failed to lose their capacity to sensitize erythrocytes under the same conditions.
Keywords: sensitized erythrocytes, agglyutinin, formalin solution, antitoxin, immunitetes, anatoxin, staphylococcus toxin.
Введение. В последние годы в теоретической и прикладной иммунологии все большее применение находит реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации, которая по чувствительности значительно превосходит другие серологические методы выявления антител и все шире применяется при изучении различных инфекций [1, 3, 5].
Цель исследования. Мы попытались использовать реакцию непрямой гемагглютинации для обнаружения антител к стафилококковому токсину. Применяемый в настоящее время гемолитический метод позволяет выявлять антитела (антитоксины) лишь к токсическому компоненту стафилококкового токсина - в основном к а-токсину [2, 6].
Материалы и методы. В основу реакции положен метод непрямой гемaгглютинaции. В то же время разнообразие физико-химических свойств различных антигенов обусловливает значительную сложность сенсибилизации эритроцитов антигенами и это приводит к отсутствию единой стандартной методики [4]. Поэтому для каждого антигена экспериментальным путем приходится устанавливать оптимальные условия для адсорбции. Изложенное и побудило нас более подробно остановиться на методических вопросах применения указанной реакции для определения антител к стафилококковому токсину.
Первоначально мы попытались применить в реакции непрямой гемагглютинации нативные эритроциты барана, которые, однако, лизировались при сенсибилизации их различными разведениями нативного стафилококкового токсина. Поэтому нативные бараньи эритроциты оказались непригодными для работы с нативным токсином. Изложенное побудило нас попытаться применить формалинизированные бараньи эритроциты. Согласно данным литературы, применение формалинизированных эритроцитов позволяет избежать лизиса как в процессе танизирования, так и при дальнейшем хранении, предотвращает их спонтанную агглютинацию, позволяет получать стойкий препарат сенсибилизированных антигеном эритроцитов [10, 11].
Формалинизированные бараньи эритроциты хронили в виде 50 % взвеси в физиологическом растворе, а перед постановкой опыта 3-кратно отмывали нейтральным физиологическим раствором и готовили 2,5 % взвесь на буферном солевом растворе рН 7,2. Равные количества полученной взвеси формалинизированных эритроцитов и таниновой кислоты в разведении 1:20000 смешивали и инкубировали при 370 в течение 20 мин. После 3-кратного отмывания буферным солевым раствором с рН 7,2 эритроциты ресуспендировали до первоначального объема.
Для выбора оптимальной дозы нативного токсина, которая обеспечивала бы хорошую сенсибилизацию эритроцитов, провели титрование токсина со стандартной противостафилококковой сывороткой. Оптимальными разведениями токсина оказались 1:40-1:160 (активность токсина Lh 0,15 мл). Учитывая возможность групповых реакций, из всех оптимальных концентраций антигена в реакции непрямой гемагглютинации предпочтительно пользоваться наименьшей. Поэтому в основной части работы для сенсибилизации эритроцитов нативный стафилакокковый токсин применяли в разведении 1:160, что соответствовало концентрации 70 мкг на 1 мл белка.
Как показали проведенные испытания, наилучшие условия для сенсибилизации эритроцитов создаются при следующем режиме: равные объемы танизированных эритроцитов и нативного токсина в разведении 1:160 (токсин разводили на буферном солевом растворе с рН 6,4)
смешивали и выдерживали при 370 в течение 2-3 часов и затем в рефрижераторе при 40 в течение 18-20 часов. За 2-3 часа до окончания сенсибилизации для предотвращения элюции антигена с эритроцитов добавляли формалин из расчета 1-2 % общего объема. После окончания сенсибилизации эритроциты 3-кратно отмывали буферным солевым раствором с рН 7,2 с 1 % раствором формалина, ресуспендировали в таком же растворе в первоначальном объеме.
Проведенные испытания полученных сенсибилизированных эритроцитов показали, что при хранении в течение 3 месяцев и более в рефрижераторе при 40 С диагностикумы почти не утрачивали активности. Так, если после приготовления сенсибилизированные токсином эритроциты реагировали с антитоксической сывороткой активностью 80 АЕ до титра 1: 819 200, то через 3 месяца хранения они реагировали с той же сывороткой, разведенной до 1:409 600. Эти материалы свидетельствовали, что нам удалось добиться прочной сорбции компонентов стафилакоккового токсина на танизированных эритроцитах и оптимальных условий для их сохранения.
Реакцию ставили в полистироловых пластинках. К 0,5 мл соответствовавшего разведения сыворотки (предварительно прогретой при 560 С в течение 30 минут и адсорбированной бараньими эритроцитами) добавляли каплю 2,5 % взвеси сенсибилизированных токсином эритроцитов. Содержимое пластинок тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 3-4 и окончательно через 18-20 часов по четырехбалльной системе. За титр исследуемой сыворотки принимали наивысшее разведение, обеспечивавшее четкую положительную реакцию (++) при отрицательной реакции в контрольных лунках.
В каждом опыте контролировали испытуемые сыворотки в низшем разведении с контрольнымиэритроцитами (без антигена) на отсутствие антител к бараньим эритроцитам.
Опытный и контрольный диагностикумы проверяли на отсутствие спонтанной агглютинации в растворителе, применявшемся в данной реакции. Изложенная методика позволила получить стойкий эритроцитарный диагностикум для определения антител к стафилококковому токсину.
Далее мы попытались выяснить ряд методических вопросов, связанных с применением реакции непрямой гемагглютинации при изучении стафилококковых инфекций, на модели стафилококковый токсин (анатоксин) - антитоксин [7, 8, 9].
Представлялось важным выяснить, насколько пригодны различные серии стафилококкового токсина для сенсибилизации эритроцитов. Проведенные испытания 5 серий, показали, что все препараты обладали хорошей сенсибилизирующей активностью, а полученные диагностикумы
- высокой активностью при стандартизации с противостафилококковой сывороткой активностью 80 АЕ (табл. 1).
Полученные материалы свидетельствовали о высокой чувствительности реакции непрямой гемагглютинации для обнаружения антител к компонентам стафилококкового токсина.
Таблица 1
Сравнительное изучение сенсибилизирующей активности различных
серий стафилококковых токсинов и анатоксинов
№ серии препарата Максимальные титры
противостафилококковой
сыворотки
Токсины 462 1 320 000-1 640 000
487 1 160 000-1 320 000
427 1 160 000-1 320 000
505 1 640 000-1 1 280 000
507 1 320 000-1 1 280 000
Анатоксины 64-1 1 3 200
65-2 1 6 400
61-1 1 800
62-1 1 200
63-2 1 100
Далее мы попытались применить для сенсибилизации эритроцитов препараты стафилококкового анатоксина (разные серии) и сравнить сенсибилизирующую активность токсина. Полученные материалы свидетельствовали, что препараты стафилококкового анатоксина оказывали неодинаковое и значительно более слабое сенсибилизирующее действие при взаимодействии с танизированными эритроцитами, чем препараты токсина. В то время как одни серии (65-2, 64-1) оказывали определенное сенсибилизирующее действие на танизированные эритроциты и такие днагностикумы реагировали с противостафилококковой сывороткой в разведениях 1:3200 и 1:6400, другие серии анатоксина (62-1, 63-2) практически вообще были неспособны сенсибилизировать танизированные эритроциты.
С целью подтверждения высокой специфичности и чувствительности реакции непрямой гемагглютинации мы применили реакцию ее торможения. Проведенные исследования показали, что предварительное добавленне к разведениям противостафилококковой сыворотки нативного токсина приводило к нейтрализации соответствующих антител и значительному снижению титра антисыворотки в реакции непрямой гемагглютинации. Таким образом, результаты реакции торможения
непрямой гемагглютинации подтвердили специфичность результатов, полученных в реакции непрямой гемагглютинации.
Особого внимания, как нам кажется, заслуживал вопрос о том, какими именно антигенными компонентами стафилококкового токсина обусловлена положительная реакция, зависит ли она от термолабильных (являющихся в основном собственно экзотоксинами) компонентов токсина или термостабильных, накопление которых происходит за счет лизиса бактериальных клеток и обусловлено в основном содержащимися в токсине растворимыми антигенами микробной клетки. Для ответа на эти вопросы мы получили препараты стафилококкового токсина, прогретые при 56 и 60° С в течение 30 минут и при 100° С в течение 20 мин. Этими прогретыми токсинами сенсибилизировали эритроциты и сравнивали активность полученных диагностикумов с активностью эритроцитов, сенсибилизированных нативным токсином.
Peзультaты иccлeдoвaния. Результаты проведенных испытаний (табл. 2) показали, что прогревание токсинов практически не влияло на их сенсибилизирующую активность по отношению к эритроцитам: танизированные эритроциты, сенсибилизированные токсинами прогретыми 56, 60 и 100° С, проявляли примерно одинаковую активность и реагировали с противостафилококковой сывороткой почти в таких же разведениях, как и танизированные эритроциты, сенсибилизированные нативным стафилококковым токсином.
Изложенное позволиловысказать предположение, что в реакции непрямой гемагглютинации выявляются не токсические (возможно, не столько токсические) компоненты стафилококкового токсина, которые очень чувствительны к нагреванию, а какие-то антигенные компоненты токсина, устойчивые к действию температурного фактора.
Таблица 2.
Реaкция непрямой гемaгглютинaции с нативным и гретыми
стaфилококковыми токси^ми
Токсин, использованный для сенсибилизации Максимальный титр противостафилококковой сыворотки
Нативный.............................. Прогретый при 600 С 30 мин Прогретый при 600 С 30 мин Кипяченый при 1000 С 20 мин... 1:640 000 1:640 000 1:320 000 1:320 000
По-видимому, в серологических реакциях, в частности в реакции гемагглютинации, выявляются антигенные свойства токсина и микробной клетки, а не токсические компоненты стафилококкового токсина.
С целью подтверждения высказанного предположения и доказательства специфичности полученных данных мы применили
реакцию торможения непрямой гемагглютинации. К последовательным разведениям противостафилококковой сыворотки (0,25 мл) добавляли в первом случае равные количества различных разведений нативного токсина, во втором - равные количества токсина, прогретого при 600 С в течение 30 мин. После соответствующей экспозиции (час при 370 и час при комнатной температуре) в качестве тест-системы применяли эритроциты, сенсибилизированные как нативным, так и прогретым при 600 С токсинами. Результаты перекрестных контрольных опытов показали, что добавление для нейтрализации антител противостафилококковой сыротки токсинов как нативного, так и гретого оказывало вообще одинаковый эффект торможения независимо от того, каким токсином сенсибилизированы эритроциты тест-системы.
Полученные материалы свидетельствовавшие об однозначных результатах реакции с эритроцитами, сенсибилизированными как нативным токсином, так и гретым, подтверждали ранее полученные данные о том, что в реакции непрямой гемагглютинации проявляются в основном термостабильные антигенные компоненты стафилококкового токсина и выявляются соответствующие им антитела в антисыворотках.
В то же время проведенное изучение гемолитических свойств нативного и гретых токсинов (гемолитическим методом) показало, что прогревание токсинов приводило почти к полной потере гемолитических свойств токсинов.
Эти материалы подтверждали данные литературы, согласно которым при нагревании происходит практически почти полное разрушение наиболее устойчивой гемолитической функции стафилококкового токсина и полное разрушение его дермонекротической и летальной функции [12, 13, 14].
Следовательно, прогревание токсинов приводит к потере токсических свойств, но почти не влияет на антигенные компоненты стафилококкового токсина, которые проявляются в реакции непрямой гемагглютинации. Вероятно, при сенсибилизации танизированных эритроцитов как нативным, так и гретыми токсинами эритроцитами сорбируются только эти термостабильные компоненты, держащиеся в токсине, и выявляются в противостафилококковой сыворотке соответствующие антитела. Именно этим, по-видимому, и выясняется примерно одинаковая активность при тестировании с противостафилококковой сывороткой эритроцитов, сенсибилизированных как нативным, так и гретыми токсинами.
Выводы. 1. Определены оптимальные условия сенсибилизации формалинированных бараньих эритроцитов нативным стафилококковым токсином и получен стойкий эритроцитарный стафилококковый диагностикум.
2. Различные серии стафилококкового токсина обладали высокой и примерно одинаковой сенсибилизирующей активностью, в то время как различные серии анатоксина обладают неодинаковой и значительно более слабой сенсибилизирующей активностью.
3. Прогревание токсинов не снижало их сенсибилизирующей активности. При помощи реакции торможения установлено, что в реакции непрямой гемагглютинации выявляются в основном антитела к термостабильным антигенным компонентам стафилококкового токсина.
Использованные источники:
1. Акатов А.К., Зуева B.C. Стафилококки//-М.: Медицита. -1983. -С. 256.
2. Кудратова З.Э., Юсупова Н.А., Набиева Ф.С. Нозологическая структура острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенной микрофлорой в Самаркандской облaсти//Medicus. - 2019, № 6.
3. Куанова Г.С. Стафилококки и стафилококковые инфекции бактериологические аспекты профилактики стафилококковых заболеваний// Вестник Атырауского университета. 2018;49(2): 147-151.
4. Мaмaтовa М.Н. Study of the biological properties of rabies by the method of diagnosis of the "Gold standard"// Scientific Journal, Colden Brain. -2024, Volum 2 (4).
5. Негодовa Е.В. Рaспрострaненность респирaторных зaболевaний среди детей гарнизота, роль стaфилококковой инфекции в этиологии зaболевaний органов дыхания// Глaв.врaч Юга России. 2011. №1 (24).
6. Николаева И. В., Анохин В. А. Стафилококковые инфекции в педиатрии// ПМ. 2010. №4.
7. Шайкулов Х.Ш., Исокулова М.М., Маматова М.Н. Огепень бактериоциногенности антибиотикорезистентных штаммов стафилококков, выделенных в Самарканде// Eurasian journal of medical and natural sciences. -2023, № 3(1).
8. Шяйкулов, Х.Ш., Исокуловa М.М. Характеристика энтеропатогенных кишечных палочек, выделенных у детей раннего возраста// Экономика и социум". -2023. №1(104).
9. Шайкулов Х.Ш., Исокулова М.М. Бактериоциногенная активность антибиотикоустоичивых штаммов стафилококков, выделенных в Самарканде// Перспективы развития науки в современном мире. - 2022.
10. Чернова O.JI. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве// Автореф. дис. канд. биол. наук. Челябинск, 1989. - С. 22.
11. Чернова О.Л. и др. Роль факторов персистенции Staphylococcus epidermidis в инфекционном процессе// Журн. микробиол. -1997. -№4. -С. 81-83.
12. Baselga R. Staphylococcus aureus capsule and slime as virulence factors in ruminant mastitis// Vet. Microbiol. -1994. -V.39. -N.3-4. -P. 195-204.
13. Corbella X. Staphylococcus aureus nasal carriage as marker for subseguent staphyloccal infections in intensive care unit patients// Eur. J. Clin. Microbiol. Infekt. Dis. -1997. -Vol.l6, №5. -P.351-357.
14. Welsch M. Le "lysozyme" des Staphylocoques. Compt. Rend// Soc. Biol. -1959. -Vol. 153. -P.2080-2083.
